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1、食品安全问题日益严重！2015-05-19漳州市珍桂食品有限公司生产的知名“来伊份”手撕肉条菌落总数超标.2015-05-14国内全部100家生产企业和部分进口婴幼儿配方乳粉抽检当中，23家国内生产企业和4家进口经销商抽检样品不合格。杨凌圣妃乳业有限公司等企业的2批次样品检出菌落总数超标。2015-04-06国家食品药品监督管理总局针对深受学生群体偏爱的“辣条”发布食用安全消费提示，指出抽检结果显示部分产品存在超范围、超限量使用防腐剂、色素以及菌落总数超标等问题。在引起公众关注的同时也引起了广泛的质疑：1、菌落总数超标是否等于食品不安全？2、测试方法是否科学？3、央视是否有权公布结果？央视曝光
2、，在北京崇文门真功夫、肯德基、麦当劳三大快餐店取回可食用冰块，并抽取马桶水样品后，送往北京理化中心进行对比检测。检测结果显示，3家快餐店的菌落总数均超出标准。实验十 水中菌落总数和大肠菌群数量测定实验十一 肠道杆菌的抗原性检测实验十 水中菌落总数和大肠菌群数量测定权威科学标准严格水质微生物检查通常包括两个项目：菌落总数和大肠菌群测定。菌落总数是指1mL检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，CFU)数，故其单位应是cfu/mL。它反映的是检样中活菌的数量。大肠菌群是指在37、24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的
3、革兰氏阴性无芽孢杆菌的总称。大肠菌群普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成。 国家饮用水标准规定：饮用水中菌落总数每毫升不超过100个；总大肠菌、耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌不得检出。实验目的1.了解水质状况与细菌数量在饮水中的重要性；2.学习并掌握各类水样采集和细菌活菌计数的方法；3.了解平板菌落计数法在有关行业的微生物检验中的作用与意义。实验原理 1、平板菌落总数测定法微生物在固体培养基上所形成的一个菌落代表一个单细胞，因此通过统计菌落数就可计算出样品中含有的活菌数。菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（
4、每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。由于现有条件不能满足样品中厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌等微生物的生理需求，故上述难以繁殖生长。因此菌落总数并不等于样品中的所有微生物的总数。但在一定范围和条件下，菌落总数与样品中微生物数量成正比关系，所以菌落总数可以反映环境微生物的数量和洁净程度。实验原理 2、多管发酵法来测定水样中的大肠菌群数利用大肠菌群微生物在乳糖蛋白胨液体培养基发酵产酸产气的特征，结合统计学的方法，利用MPN (most probable number，最可能数)检索表，快速测定水样中总大肠菌群最可能数(MPN)值。实验器材1.培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基(琼
5、脂为1.5%)、乳糖发酵管、伊红美兰培养基；2.水样采集器（灭菌处理），1.5mL离心管，移液器，枪头；3.无菌水，250ml三角瓶（灭菌处理），灭菌培养皿。实验步骤一、水样采集1、自来水的采集：用酒精灯火焰对自来水龙头灼烧1分钟灭菌，开放水龙头流水5分钟后将水龙头关小，在水龙头旁拔去灭菌三角瓶塞，迅速将瓶口对准水龙头接取水样若干，盖好瓶塞待分析。2、环境水的采集：用ETC-1A采水器采集0.5-1M水深样品，然后置于灭菌器皿待分析。二、平板菌落总数测定1、自来水样品(每组2块)倾注法制平板（注意无菌操作）：吸取1mL自来水样分别加入2个灭菌培养皿中；倾注约15mL经融化并冷却至45左右（以不
6、烫手为宜）的牛肉膏蛋白胨培养基，立即在桌面作平面旋转混用。注意样品与培养基混合时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转，使其充分混匀。旋转时小心，不要使混合物溅到皿边上方。皿底琼脂凝固后将平皿倒置培养于37培养24h。2、环境水样品(每组4块)将样品在无菌水试管中做10倍梯度稀释；取10-1和10-2稀释度的环境水样各1ml放入不同的培养皿内，倾注法混匀，每个稀释度做2个平皿，然后置于37倒置培养24h。三、菌落计数1、自来水样品：两个平板的平均菌落数即为1ml水样的菌落总数；2、环境水样品：(1)平皿菌落数的选择：先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生
7、长时，则不宜采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的面积大小不足平板的一半，而其余的一半平板菌落分布又比较均匀，则可将此一半的菌落数乘以2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。(2)稀释度的选择首先当只有一个稀释度的平均菌落在30300之间的，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的菌落总数。（见表中例1）若有两个稀释度的平均菌落数在30300之间，则按两者菌落总数之比来决定。若比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数；若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数。（见表中例2、3和4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀
8、释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。（见表中例5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。（见表中例6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。（见表中例7）若所有稀释度的均无菌落生长，则以1乘以稀释倍数报告之。（见表中例8）表1 稀释度选择和菌落总数报告方式实实例例不同稀释度的平均菌落数不同稀释度的平均菌落数两个稀释度两个稀释度菌落数之比菌落数之比菌落总数菌落总数（CFU/mL）报告方式报告方式（CFU/mL）10-110-210-31136516420-1640016000或或1.61042276029
9、5461.63775038000或或3.810432890271602.22710027000或或2.71044150308215001500或或1.51035多不可计多不可计1650513-513000510000或或5.1105627115-270270或或2.71027多不可计多不可计30512-3050031000或或3.11048000- 10 110四、多管发酵法来测定水样中的大肠菌群实验包括三个部分：1.乳糖蛋白胨液体培养基初发酵，2.伊红美兰培养基(EMB)平板分离，3.乳糖蛋白胨液体培养基复发酵。乳糖蛋白胨发酵培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏 0.3%，乳糖 0.5%，NaCl
10、0.5%，1.6%溴酚蓝(产酸指示剂)，pH7.2-7.4，分装于装有杜氏小管的试管中。四、多管发酵法来测定水样中的大肠菌群环境水样的体积(mL)原液1mL/管10-1稀释度1mL/管10-2稀释度1mL/管管数5管5管5管培养条件37度培养24小时阳性结果的标准发酵液的颜色：变为黄色（证明产酸）杜氏小管：内有气泡产生（证明产气）取三个不同稀释度的、环境水样(100/10-1/10-2)分别接种到5支乳糖蛋白胨液体培养基。五、环境水样初发酵大肠菌群计数1.观察产酸和产气的情况，确定每个稀释度的阳性管数；2.根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN(most pribable number，最可
11、能数)检索表(P71)，报道每100mL水样中总大肠菌群最可能数(MPN)值；3.取1管阳性管培养基在冰箱保存，下周接种。实验结果1、记录实验数据并填写下表：不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数（CFU/mL）10-110-2环境水样品平板1菌落数平板2菌落数菌落总数（CFU/mL）自来水样品不同稀释度大肠菌群阳性的管数大肠菌群数(MPN/100mL)10-010-110-2环境水样品实验思考1.如果有关部门委托你检测某快餐店的冰块中微生物的污染情况，请设计实验以提供严谨、权威的数据。2.水中若有大量的致病菌-霍乱弧菌，那么用多管发酵法检测大肠菌群能否得到阳性结果？为什么？每组准备5支9mL无菌水试管，包扎灭菌。每组包扎培养皿1包，灭菌。
