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1、表观遗传学创新实验表观遗传学创新实验5-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组氮胞苷处理水稻幼苗对基因组DNA甲基化的影响甲基化的影响 庞劲松庞劲松刘宝刘宝东北师范大学生物基础实验教学中心东北师范大学生物基础实验教学中心1v表观遗传学与表观遗传学与DNA甲基化甲基化vDNA甲基化作用甲基化作用DNA的甲基化及其方式的甲基化及其方式DNA甲基化的生物学意义甲基化的生物学意义DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成胞嘧啶甲基化的种类和形成vDNA胞嘧啶甲基化检测胞嘧啶甲基化检测检测方法检测方法：MSAP，bisulfitesequencingv5氮胞苷处理对水稻氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响甲基化的影响实验目的实验
2、目的实验材料实验材料仪器仪器试剂试剂实验方法实验方法v5-氮胞苷处理水稻幼苗氮胞苷处理水稻幼苗v植物基因组植物基因组DNA的提取与纯化的提取与纯化v基因组基因组DNA酶切酶切-连接接头连接接头vPCR扩增扩增：预扩增预扩增，选择性扩增选择性扩增vPAGE电泳电泳预期实验结果预期实验结果注意事项与建议注意事项与建议思考题思考题参考文献参考文献2v表观遗传学：表观遗传学：不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。饰。表观遗传变异包括表观遗传变异包括:X
3、染色体失活、转基因沉默、核仁染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。显性和基因组印记等方面。表观遗传变异的原因表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。DNA甲基化：甲基化：在在DNA复制后，经复制后，经DNA甲基转移酶（甲基转移酶（DMT）催化，）催化，将将S-腺苷酰腺苷酰-L-甲硫氨酸甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到上的甲基基团连接到DNA分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修修饰的过程。饰的过程。3vDNA甲基化的方式甲基化的方式
4、胞嘧啶甲基化胞嘧啶甲基化腺嘌呤甲基化腺嘌呤甲基化DAM(DNA腺嘌呤甲基转移酶腺嘌呤甲基转移酶)识别回文序列识别回文序列GATC,在此位在此位置两条链的腺嘌呤置两条链的腺嘌呤N-6位置上位置上同时甲基化，同时同时甲基化，同时SAM转变为转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸)在DMT(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化 DNA甲基化作用甲基化作用图图1胞嘧啶甲基化过程胞嘧啶甲基化过程图图2腺嘌呤甲基化过程腺嘌呤甲基化过程4vDNA甲基化的生物学意义甲基化的生物学意义影响基因表达状态：通过该表基因调控区影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲
5、基化程度调甲基化程度调控基因转录控基因转录图图3甲基化与基因沉默甲基化与基因沉默参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）（如转座子）处于沉默状态处于沉默状态提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型表型5vDNA胞嘧啶甲基化的种类和形成胞嘧啶甲基化的种类和形成从头甲基化从头甲基化(de novomethylation)vDNMT3a，DNMT3bv在完全没有甲基化的在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。上加上甲基。维持甲基化维持甲基化(maintenancemethylat
6、ion)vMet1，DNMT1v较特异地识别半甲基化状态的较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责，负责在细胞分裂过程中依据在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化母链的甲基化状态给新合成的状态给新合成的DNA链上加上甲基。链上加上甲基。图图4两种胞嘧啶两种胞嘧啶甲基化方式甲基化方式6DNA胞嘧啶甲基化检测方法胞嘧啶甲基化检测方法使用对胞嘧啶使用对胞嘧啶5-甲基化状态敏感的限制性内切酶进甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：行酶切处理，然后检测多态性：v甲基化敏感扩增多态性甲基化敏感扩增多态性(MSAP,MethylationSensitiveAmplificationPoly
7、morphism)胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：v重亚硫酸盐测序重亚硫酸盐测序(Bisulfitesequencing)GCmTACT重亚硫酸钠重亚硫酸钠GCmTATT测序测序测序测序此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等 7vMSAP用途：用途：v最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段原理：原理：v利用对利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割甲基化敏感性
8、不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、扩增、PAGE电泳、银染，产电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。甲基化信息。甲基化状态分析：甲基化状态分析：v在不同泳道相对应的位置上，如果在不同泳道相对应的位置上，如果MspI酶切产物有扩增带、而酶切产物有扩增带、而HpaII酶切酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此；若都有扩增带，说明此处是处是CCGG。还
9、可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。v表表1甲基化敏感酶对不同甲基化状态甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果的切割结果原始序列原始序列内切酶内切酶CCGGCCmGGCmCGGHpaIICCGG不切割不切割不切割不切割MspICCGGCCmGG不切割不切割8vMSAP流程：流程：提取基因组提取基因组DNA（注意发育时期和成长状态相同注意发育时期和成长状态相同）ATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGGCCTGMspI酶
10、切酶切+接头接头HapII酶切酶切+接头接头ATCCGGTGGCTTGCCmGGACATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGGCCTGTAGGCCACCGAACGGCCTGPCRPCRPAGE电泳电泳PAGE电泳电泳MspI5CC(m)GG33GGC(m)C5HpaII5CCGG33GGCC39v重亚硫酸盐测序重亚硫酸盐测序图图5重亚硫酸盐测序原理重亚硫酸盐测序原理105氮胞苷处理对水稻氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响甲基化的影响v实验目的实验目的使用不同浓度的使用不同浓度的5氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组其基
11、因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。传表型。v实验材料实验材料水稻：日本晴水稻：日本晴(Oryza sativavarjaponica,nipponbare)5氮胞苷如何影响基因组氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平甲基化水平：5氮胞苷可以与氮胞苷可以与DNA甲基转移酶（甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在）结合从而抑制其
12、活性，在DNA复制复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低。甲基化水平降低。11所需仪器所需仪器v离心机离心机PCR仪仪气浴摇床气浴摇床水浴摇床水浴摇床植物生长箱植物生长箱v电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽微量移液器微量移液器紫外分析仪紫外分析仪分析天平分析天平 图图6所需主要仪器所需主要仪器12v试剂试剂植物基因组植物基因组DNA改良改良CTAB提取液：提取液：vbufferA:0.35mol/LSorbitol，0.1mol/LTris-HClpH7.5，0.5mmol/LEDTA;vbufferB:0.2mol/LTris-HClpH7.5
13、，0.05mol/LEDTA，2mol/LNaCl，2%CTAB;vbufferC:5%N-lauroylsarcosinePCR试剂：试剂：TakararTaq，10XPCRbuffer，ddH2O，vPCR引物引物预扩增引物：预扩增引物：H/M+0:(5-GACTGCGTACCAATTCA-3)EcoRI+0:(5-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3)选择性扩增引物：选择性扩增引物：H/M+AN:5-GACTGCGTACCAATTCAA(T,C,G)-3EcoRI+AN:5-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T,C,G)-3。酶切酶切-连接试剂：连接试剂：EcoRI(NEB)，
14、HapII(NEB)，MspI(NEB)，T4DNAligase，T410xreactionbuffer接头：接头：EcoRIadapter:5-CTCGTAGACTGCGTACC-3CATCTGACGCATGGTTAAHapII/MspIadapter:5-GATCATGAGTCCTGCT-3AGTACTCAGGACGAGCPAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝，溴酚蓝，银染固定银染固定/终止液终止液(10%冰乙酸冰乙酸)，染色液，染色液(2升双蒸水预冷，用时加升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，克硝酸银，3ml37%甲甲醛醛)，显影液，显影液(
15、2升双蒸水中溶解升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至克碳酸钠，冷却至10-12C，用时，加入，用时，加入3ml37%甲醛，甲醛，400ul硫代硫酸钠（硫代硫酸钠（10mg/ml）)。其它试剂：其它试剂：5-氮胞苷氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，蒸馏水，PVP(20%)，氯仿，氯仿:异戊醇异戊醇(24:1)，异丙醇，异丙醇，70%乙醇，乙醇，RNA酶酶A(DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，琼脂糖，EB，未酶切的，未酶切的DNA，1xTBE(0.089MTris-borate,0.089MBoricAcid,0.002MEDTA)，3xloadingbuffer(300mMNaOH,
16、97%formamide,0.2%bromophenolblue)。13实验方法实验方法v5-氮胞苷处理水稻幼苗：氮胞苷处理水稻幼苗：26，暗培养，暗培养(1)取水稻取水稻Nipponbare种子种子10粒粒X4组，分别置于组，分别置于90mm培养皿内培养皿内的双层滤纸上，加入的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种蒸馏水浸种24h；（第一天）；（第一天）(2)分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL,50mg/mL,100mg/mL5-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理共处理10天，每天换处理液天，
17、每天换处理液1次；（第二次；（第二十一天）十一天）图图75-氮胞苷处理的水稻幼苗（右）和对照植株（左）氮胞苷处理的水稻幼苗（右）和对照植株（左）14v植物基因组植物基因组DNA的提取与纯化的提取与纯化改良改良CTAB法法(KidwellandOsborn,1992)不同处理的叶片不同处理的叶片1g液氮中研磨成粉液氮中研磨成粉转入转入50ml离心管离心管加入等体积加入等体积DNA提取缓冲液提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加混合，加1%PVP于于B液液)65恒温水浴摇床，恒温水浴摇床，40-50rpm振摇振摇90分钟分钟加入等体积的氯仿：异戊醇加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻
18、上下颠倒，轻轻上下颠倒10-15分钟分钟43000rpm离心离心10-15分钟分钟上层水相上层水相加入加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置分钟并置4冰箱内冰箱内10minDNA沉淀后于沉淀后于43000rpm离心收集离心收集DNA于管底于管底DNA于于70%乙醇中过夜乙醇中过夜。DNA沉淀沉淀（第十二天）（第十二天）15风干风干DNAGenomicDNA2mlEppendorf中加中加1mlTE溶解沉淀溶解沉淀待待DNA完全溶解后，加入完全溶解后，加入5l不含不含DNA酶的酶的RNA酶，酶，37保温保温30分钟以除去分钟以除去DNA中的中的RNA。加入等量氯
19、仿加入等量氯仿:异戊醇异戊醇(24:1)纯化纯化DNA，轻轻上下颠倒，轻轻上下颠倒10-15分钟分钟43000rpm离心离心10-15分钟分钟DNA沉淀沉淀70%乙醇过夜洗涤乙醇过夜洗涤DNA溶于溶于DNA于于200-500lTE中中GenomicDNA溶液溶液0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的的质量并据已知的DNAMarker（未酶切的（未酶切的DNA）估计其浓度。）估计其浓度。调整调整DNA浓度，置於浓度，置於-20备用。备用。 16v基因组基因组DNA酶切酶切-连接接头连接接头甲基化分析采用两种甲基化敏感酶甲基化分析采用两种甲基化敏感酶Hap和和Msp
20、（NEB）。在限）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试序列见试剂部分剂部分)，即，即100变性变性5分钟分钟,缓慢冷却至室温，缓慢冷却至室温，-20冷冻保存备用。冷冻保存备用。水稻水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下：限制性酶切和连接体系如下： T4 10 x buffer2.5lBSA (10mg/L)0.1lEcoR I adaptor (5pM)0.5lH/M adaptor (50pM)0.5lEcoR I (20U/l)0.5lH/M HpaII (20U/l) 0.25lMspI (10U/l) 0.5
21、lT4 ligase0.1lGenomic DNA300ngAFLP-Water补足总反应体积补足总反应体积20l混匀体系，混匀体系，37，6小时，小时，8，4小时，小时，4保存。保存。共四个处理组，即共四个处理组，即Nipponbare25mg/mL处理组，处理组，Nipponbare50mg/mL处理组，处理组，Nipponbare100mg/mL处理组，处理组，Nipponbare对照组；每组分别用对照组；每组分别用HapII/MspI酶切，共需切酶切，共需切8管管（第十五天）（第十五天）表表2水稻水稻MSAP限制性酶切、连接体系限制性酶切、连接体系17vPCR扩增扩增预扩增：水稻预扩增
22、：水稻AFLP预扩增体系如右表预扩增体系如右表(预扩增引物预扩增引物PCR引物部分引物部分)：混匀体系，按下列参数进行混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：扩增反应：vPCR程序：程序：94预变性预变性2min,94变性变性30秒，秒，56复性复性30秒，秒，72延伸延伸60秒秒,共进行共进行30个循环，最后个循环，最后72延伸延伸10分钟。分钟。v根据检测结果，用根据检测结果，用0.1xTEbuffer稀释预扩增产物稀释预扩增产物1/101/40，作为，作为PCR选择性扩增的选择性扩增的DNA模板。模板。10 x PCR reaction buffer2.5LdNTPs (2.5mM) 2
23、LEcoR I adaptor + A (5M) 1LH/M adaptor +0 +0 (5M) 1LTaq DNA polymerase (5U/L) 0.2LPCR water16.3LDNA 模板（酶切连接产物）模板（酶切连接产物） 2LTotal volume 25L表表3AFLP预扩预扩PCR体系体系18水稻水稻AFLP选择性扩增体系如下：选择性扩增体系如下：v按以下参数进行按以下参数进行PCR扩增反应：扩增反应：94预变性预变性2分钟分钟,94变性变性30秒，秒，65复性复性30秒，秒，72延延伸伸80秒，以后每轮循环温度递减秒，以后每轮循环温度递减1，扩增，扩增10轮。接着轮。
24、接着94变性变性30秒，秒，55复性复性30秒，秒，72延伸延伸80秒，共进行秒，共进行40个个循环，最后循环，最后72延伸延伸10分钟。分钟。（第十七天）（第十七天）10 x PCR reaction buffer10 x PCR reaction buffer1.5L1.5LdNTPs (2.5mM) dNTPs (2.5mM) 0.6L0.6LEcoREcoR I primer (5M) I primer (5M)0.6L0.6LH/MH/M primer (5M) primer (5M)0.6L0.6LTaq DNA polymerase (5U/L)Taq DNA polymeras
25、e (5U/L)0.12L0.12LPCR waterPCR water9.58L9.58LDNA DNA 模板（预扩增稀释产物）模板（预扩增稀释产物）2L2LTotal volumeTotal volume15L15L表表4AFLP选扩选扩PCR体系体系19vPAGE电泳电泳电泳装置图电泳装置图玻璃板分为大板和小板玻璃板分为大板和小板(上部凹形上部凹形)。自来水清洗自来水清洗95酒精擦两遍酒精擦两遍硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面板的一面5分钟后，分钟后，95酒精再擦两遍，酒精再擦两遍，装板装板灌胶灌胶
26、图图8PAGE电泳系统电泳系统20尿素尿素-PAGE胶配制胶配制灌胶前，加入四甲基乙二胺（灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30L，10%过硫酸铵过硫酸铵（APS）160l，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。度。胶聚合胶聚合1小时以上才可以电泳。小时以上才可以电泳。电泳：电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电型。电泳缓冲液为泳缓冲液为1xTBE，85W预电泳预电泳1小时，胶板的温度达到小时，胶板
27、的温度达到55C。点样前，点样前，DNA样品样品95C变性变性5分钟，立即冰浴，加分钟，立即冰浴，加3xloadingbuffer,混匀，瞬时离心，点样量混匀，瞬时离心，点样量16L，恒功率恒功率55W电泳到指电泳到指定位置，即可卸板染色。定位置，即可卸板染色。尿素尿素(分析纯分析纯)16.8g10xTBE4mL40%丙烯酰胺胶贮液丙烯酰胺胶贮液(Acrylamide/Bis 19: :1)16mL超纯水超纯水加到总体积加到总体积40mL灌胶图电泳图表表5PAGE胶配方胶配方21v银染操作银染操作电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将附着胶的大板置于固定附着胶的大
28、板置于固定/终止液中，轻摇终止液中，轻摇20分钟，直至指示染料消失。分钟，直至指示染料消失。凝胶洗涤，回收固定凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水终止液，用双蒸水洗涤凝胶洗涤凝胶3次，每次至少次，每次至少2分钟，凝胶板分钟，凝胶板从水中取出后，竖起空水从水中取出后，竖起空水15秒。秒。染色，将胶板移至染色液中，轻摇染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。分钟。凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒
29、入另一半显影液，轻摇至条带全部出当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。秒。）终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。中用过的），停止显影并固定影像。固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产溶液不再有二氧化碳产生生)，用双蒸水洗涤凝胶，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取分钟，凝胶板从水中取出后，
30、竖起控水凉干备用。出后，竖起控水凉干备用。（第十九天）（第十九天）图图9PAGE胶银染胶银染22v预期实验结果预期实验结果同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化状态不同。状态不同。（第二十天）（第二十天）图图10预期结果预期结果PAGE电泳图电泳图23v注意事项与建议注意事项与建议五氮胞苷（五氮胞苷（5-azacytidine；MW:244.21）：粉末于）：粉末于-20保存，保存，见光或遇热分解，使用时配母液于见光或遇热分解，使用时配母液于4保存，保存时间不宜超保存，保存时间不宜超过半个月；过半个月；丙烯酰胺为剧毒试剂，配
31、制、使用时必须按有关规程做好个人丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人防护；防护；24思考题思考题v5-氮胞苷为什么能使氮胞苷为什么能使DNA甲基化水平降低？甲基化水平降低？vMSAP的原理是什么？的原理是什么？v如何分析如何分析MSAP电泳图？电泳图？25参考文献参考文献 v1 Razin A, Cedar H. DNA methylation-Biochemistry and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 31-40.v2 Flavell R B. Inactivation of gene expression in plants as a on sequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 91:3490-3496.v3 Ng H.H, Bird A. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev, 1999, 9(2): 158163v4 Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2001, 6(11):503-512.26
