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1、第六章第六章 免疫标记技术免疫标记技术第六章第六章 免疫标记技术免疫标记技术第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 免疫酶技术放射免疫技术（radioimmunoassay，RIA）第一节第一节放射免疫技术放射免疫技术 Rosalyn Yalow （美国）（1977年获诺贝尔生理和医学奖） “for the development of radioimmunoassays of peptide hormones”Veterans Administration Hospital Bronx, NY, USA b. 19211959年，Yalow和Berson首次应用放射免疫分析法测定胰岛
2、素与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功 开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。放射免疫技术放射免疫技术优点：优点： 特异性强，即抗原抗体的特异性反应； 灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g； 操作流程简单易行，加样程序简单，测量和 数据处理自动化； 样品用量少、一般无需复杂的提纯步骤； 应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。缺点：缺点： 需要昂贵的检测仪器；同位素污染。放射免疫技术的原理放射免疫技术的原理 是建立在标记抗原（或配体）和待测抗原（或配体）对有限量的特异性抗体（或受体）的竞争性抑制反应基础上的，最终形成的放射
3、性标记复合物与被测配体（或抗原）呈负相关，因而亦称竞争性放射免疫技术。 RIA测定原理 AgAg* * + + AbAb Ag Ag* *-Ab-Ab （F F） （B B） + + Ag Ag Ag- Ag-AbAb RIARIA测定原理的定量示意图测定原理的定量示意图 Ag* Ag Ab AgAb 游离游离Ag B/F B/T 6/2 6/83/5 3/82/6 2/84/4 4/8返回一、免疫荧光技术的原理二、建立免疫荧光技术的 必备条件三、免疫荧光技术的基本 方法第二节免疫荧光技术 返回一、免疫荧光技术的原理 免疫荧光技术免疫荧光技术（immuno - fluorescence tec
4、hnique） 二十世纪40年代，Coons等首先用荧光素作为示踪物质标记抗体，检测可溶性肺炎双球菌多糖抗原，从而创建了免疫荧光示踪技术。 原理： 将抗体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，借助荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗体。激发光和发射激发光和发射光光 三结合： 抗原抗体反应的高度特异性 荧光的敏感可测性 显微技术的高度精确性 可以准确、特异、灵敏、快速地检测和定位微量物质。主要优点主要优点：特异性强，速度快，敏感性高，能准确检测少量抗原或抗体在组织细胞内的定位分布。主要缺点主要缺点： 非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观
5、性不足。 返回二、建立免疫荧光技术的必备条件1 1 荧光素荧光素 2 2 荧光素与蛋白质结合物荧光素与蛋白质结合物 的制备的制备 3 3 荧光检测仪荧光检测仪 返回1荧光素 荧光素：可以产生明亮荧光的染色物质。荧光的种类自发荧光 二次荧光常用的荧光素返回3荧光检测仪 （1） 荧光显微镜 （2） 荧光分光光度计（3） 流式细胞仪（4） 荧光偏振光分析仪 荧光显微镜荧光显微镜的构造吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜分色镜分色镜汞灯汞灯汞灯汞灯返回三、 免疫荧光技术的基本方法（1）直接荧光染色法（2）间接荧光染色法 （3）补体荧光染色法（4）
6、特殊染色法 返回（1）直接荧光染色法将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原。优点：简单、快速、特异性高。缺点：敏感性差。 返回（2）间接荧光染色法 将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体。（2）间接荧光染色法 优点：可检测多种不同的抗原抗体复合物，具一定通用性；敏感性高。缺点：操作流程长、干扰因素多。 返回（3）补体荧光染色法 将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。（3）补体荧光染色法 优点：可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高。缺点：操作流程长、干扰因素多、非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制备不方便。 返回FLASH
7、（4）特殊染色法 双标记免疫荧光技术 双色免疫荧光技术 反衬染色法 返回双标记免疫荧光技术在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行免疫荧光染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同类型的抗原。双标记免疫荧光技术如 ： FITC（ 黄 绿 色 荧 光 ） 和RB200或TRITC9（桔红色荧光） 返回双色免疫荧光技术 如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（碘化丙锭）。 双重染色标本的单色和双色观察 WUWU WIBWIBDUALDUAL BANDBANDWIBAWIBAWIGWIGWIBWIBDAPI+FITCDAPI+FITCFITC+PIFITC+PI多重染色标本的多色观察FITC
8、+Texas Red+DAPIFITC+Texas Red+DAPI返回反衬染色法 是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色。反衬染色法 如：用RB200标记牛血清白蛋白作为非特异性反衬标记，用FITC标记特异性抗体。 返回第三节免疫酶技术1971年Engrail和Penlmann 以及Vanweemen和Schuurs两组学者分别用酶代替放射性同位素制备了酶标记试剂，创立了酶免疫分析技术（enzyme immunoassay，EIA）。一、原理 二、建立免疫酶技术的条件三、免疫酶技术的基本方法四、通用与放大技术第三节免疫酶技术 返回一、原理免疫免疫酶技术技术（enzyme imm
9、unoassay technique）：就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。酶催化反应的两种基本形式：（1）E+S（ES） E+P（2）E+S（ES） + D1 E + P + D2E：酶 S：酶作用的底物P：底物分解后的产物（有色化合物）D1：供氢体 D2：为D1的氧化型（有色化合物）优点：灵敏度高，特异性强；可定性、定量检测可溶性 抗原和抗体，适用于普查；试剂来源广，稳定，保存 时间长，且无同位素污染； 结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； 操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； 可用于定位组织细胞上的抗原
10、或抗体成分。 缺点：标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。 返回二、 建立免疫酶技术的条件 1标记酶2免疫酶结合物的制备3酶标检测仪 返回常用的标记酶 辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP） 葡萄糖氧化酶 （glucooxidase，Glu） -D-半乳糖苷 （-D-galactosidase，-D-Gal）返回返回三、免疫酶技术的基本方法酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent，ELISA）（1）直接标记法（2）间接标记法（3）夹心法（4）竞
11、争法（5）抗体桥联法（6）抗酶抗体法（7）ELISPOT返回(1)直接标记法(direct labeling)direct ELISAfor Agdirect ELISAfor Ab返回（2）间接标记法（indirect labeling）返回（3）夹心法（sandwich assaysandwich assay）（3）夹心法双夹心法返回（4）竞争法a固相抗体竞争法b固相抗原竞争法a固相抗体竞争法b b固相抗原竞争法固相抗原竞争法返回（5） 抗体桥联法（immunobridge）返回（6）抗酶抗体法（peroxidase-antiperoxidase，PAP）PO抗PO法返回返回四、通用与放大
12、技术1 SPA通用系统2ABC放大系统返回 SPA通用系统通用系统（1）SPA的发现 （2）颗粒SPA的应用（3）SPA的标记和应用 返回（1）SPA的发现 1940年Verwey发现金黄色葡萄球菌的某些菌株，可与人正常血清在双相免疫扩散试验中出现沉淀线。1958年Jensen用离子交换树脂分析证明，该成分是一种细菌胞壁上不含糖的蛋白质 ， 命 名 为 金 黄 色 葡 萄 球 菌 A蛋 白(Staphylococcal Protein A，SPA)Forsgren等证明SPA与IgG分子的Fc段结合，为假免疫反应。 生产SPA的国际标准菌株:Cowan 株（NcTc8530 和ATCC1259
13、8） 不生产SPA的标准株:Wood46 返回（2）颗粒SPA的应用 协同凝集试验SPA吸收IgG试验应用IgG-SPA制备抗IgG的抗体 返回（3）SPA的标记和应用 荧光素标记SPA及应用酶标记SPA及应用 酶标酶标SPASPA法法返回2ABC放大系统 生物素-亲合素系统（biotin-avidin system）的特点： 高度特异性 高度灵敏性 简单快速安全稳定 （1）生物素、亲合素、链霉亲 合素的特性（2）生物素的标记技术 （3）亲合素的标记技术（4）生物素-亲合素系统的应用 返回（1）生物素、亲合素、链霉亲合素的特性 生物素（biotin，B）又称维生素H、辅酶R（羧基转化酶的辅酶）
14、MW 244.31， pI 3.5 分子式为C10H16O3N2S BiotinBiotin亲合素（avidin，A）： 又称卵白蛋白、抗生物素。 MW 68,000，pI 1010.5，为碱性蛋白，含糖量高达10%； 1个亲合素可与4个生物素结合； Ka = 1015 mol/L 链霉亲合素链霉亲合素（streptavidin，SA）： 是Streptomyces avidin 菌分泌的一种蛋白质。 MW 65000，pI 6.0，为略偏酸性的蛋白，不含任何糖基 1个链霉亲合素可与4个生物素结合 Ka = 1015 mol/L SA与A在实际应用中灵敏度要高、非特异性反应要少。返回（2）生物素的标记技术 生物素的活化活化生物素结合物的制备 活化生物素结合物的制备 活化生物素可结合或偶联抗体、酶、蛋白质、多肽、激素、凝集素、糖类及DNA 、RNA等 返回（4）生物素-亲合素系统的应用返回
