分子植物病理学ppt课件教学教程

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1、分子植物病理学MolecularPlantPathology绪论绪论1 1、概念（、概念（conception）分子植物病理学是在分子植物病理学是在分子水平分子水平上研究并解释植物病理上研究并解释植物病理现象、讨论和解决植物病害防治理论及其途径的科学。现象、讨论和解决植物病害防治理论及其途径的科学。2 2、研究内容、研究内容( (contents) ) 应用分子生物学理论和应用分子生物学理论和DNA重组技术，研究植物病害重组技术，研究植物病害的发生机制，阐明病程中，寄主病原物的发生机制，阐明病程中，寄主病原物相互作用的分子相互作用的分子基础基础；寄主、病原物与病程相关的；寄主、病原物与病程相关

2、的基因及其结构、表达和基因及其结构、表达和调控机制调控机制。3 3、主要研究方法（、主要研究方法（main strategy） 从从“里里”到到“外外”：以研究寄主和病原物的基：以研究寄主和病原物的基因为主要对象，阐明寄主病原物相互作用的有关基因为主要对象，阐明寄主病原物相互作用的有关基因的结构、表达、调控及其产物功能。因的结构、表达、调控及其产物功能。 方方 法导向：法导向：先以分子克隆的方法鉴定与致病性先以分子克隆的方法鉴定与致病性有关的基因，然后根据该基因产物及其对生物表型的有关的基因，然后根据该基因产物及其对生物表型的影响，确定该基因的类型和作用。影响，确定该基因的类型和作用。 在在分

3、子（分子（DNA）水平）水平上通过互补分析和缺失研上通过互补分析和缺失研究，从个体到群体分析有关基因的作用和功能表现的究，从个体到群体分析有关基因的作用和功能表现的调节。调节。4 4、分子植物病理学的发展（、分子植物病理学的发展（history） 分子植物病理学是植物病理学中最年轻的分支，是在遗分子植物病理学是植物病理学中最年轻的分支，是在遗传学、细胞生物学、分子生物学、生物化学和生物物理学等传学、细胞生物学、分子生物学、生物化学和生物物理学等现代学科发展和影响下逐渐形成的。然而，由于各种病原物现代学科发展和影响下逐渐形成的。然而，由于各种病原物的分类地位及其所从属的学科不同，因此，在各种植物

4、病害的分类地位及其所从属的学科不同，因此，在各种植物病害的研究中，运用分子植物病理学观点和方法对其进行研究的的研究中，运用分子植物病理学观点和方法对其进行研究的水平是不平衡的。水平是不平衡的。植物病毒病害的分子生物学研究植物病毒病害的分子生物学研究1935，W. M. Stanley 成功分离出成功分离出TMV结晶，并证明结结晶，并证明结晶的大部分组成是晶的大部分组成是protein. 1937,E. C. Borden N. w. Pirie 报道了报道了TMV的化学组的化学组成，提出该病毒由成，提出该病毒由95protein 和和5RNA组成组成19551956，H. Frankel-Co

5、nrat 对对TMV的蛋白质和的蛋白质和核酸进行了重组研究，为证明核酸作为一种遗传物质的作核酸进行了重组研究，为证明核酸作为一种遗传物质的作用提出了令人信服的证据用提出了令人信服的证据可被可被TMV抗体纯化抗体纯化不能被不能被HR抗体纯化抗体纯化侵染植物侵染植物RNA供体病毒的特征供体病毒的特征分离出的病毒颗粒能被分离出的病毒颗粒能被HR抗体钝化抗体钝化杂合病毒杂合病毒TMV CPHR RNA 1958,Gierer et al,用亚硝酸诱变获得用亚硝酸诱变获得TMVTMV突变株突变株, ,使坏死使坏死病斑从病斑从0.2%0.2%增加到增加到15%,15%,进一步说明病毒进一步说明病毒RNAR

6、NA的突变与致病功的突变与致病功能的关系能的关系. .植物细菌病害的分子生物学研究植物细菌病害的分子生物学研究植物病原细菌中欧氏杆菌归属于肠杆菌科，这类病原菌的分子遗植物病原细菌中欧氏杆菌归属于肠杆菌科，这类病原菌的分子遗传研究在传研究在20世纪世纪70年代初才开始，较肺炎双球菌的分子遗传学研究迟了年代初才开始，较肺炎双球菌的分子遗传学研究迟了近近40年，较年，较DNA双螺旋的发现晚了将近双螺旋的发现晚了将近20年。年。 20世纪世纪5070年代是植物病原细菌基因操作技术积累的时期。年代是植物病原细菌基因操作技术积累的时期。 19531956，D.T. Klein R. M. Klein 发现

7、根癌土壤杆菌的基因发现根癌土壤杆菌的基因转化与致病性有关的现象。转化与致病性有关的现象。 1957， R.R.CoreyM.P.Starr 发现了菜豆黄单胞的转化作用与其发现了菜豆黄单胞的转化作用与其对链霉素抗性和菌落形态变化之间的关系。对链霉素抗性和菌落形态变化之间的关系。 1966，日本学者完成了水稻白叶枯病菌的转化研究。，日本学者完成了水稻白叶枯病菌的转化研究。农杆菌（农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 1944, 1944, 发现农杆菌侵染的植物组织可以在不加激素的发现农杆菌侵染的植物组织可以在不加激素的培养基上生长。培养基上生长。 19701970，G.Mo

8、rel et al. .发现农杆菌致病菌有两种类型，发现农杆菌致病菌有两种类型，其区别在于对两种不常见其区别在于对两种不常见ArgArg衍生物章鱼碱（衍生物章鱼碱（octopine）和）和胭脂碱（胭脂碱（nopaline）的代谢不同。）的代谢不同。 1973,J.A.Lippincoot1973,J.A.Lippincoot证明，无致病力菌株丧失对上证明，无致病力菌株丧失对上述两种述两种ArgArg衍生物的利用能力，因此，农杆菌有衍生物的利用能力，因此，农杆菌有3 3种类型。种类型。typetoxicoctopinenopalineoctopineopalineA + + + B + + +

9、C 细菌利用细菌利用 肿瘤组织合成肿瘤组织合成 19741978，农杆菌菌株的遗传转化研究。其中，农杆菌菌株的遗传转化研究。其中，1977， M.D.Chilton证明农杆菌的证明农杆菌的Ti质粒上只有一小段质粒上只有一小段DNA与肿瘤诱与肿瘤诱发有关系，而且可以从细菌转移到植物细胞；发有关系，而且可以从细菌转移到植物细胞；1978，J.Schell 首次以首次以Ti为载体把带有抗生素抗性基因的转座子为载体把带有抗生素抗性基因的转座子Tn7转移到植转移到植物细胞中去，开创了以物细胞中去，开创了以Ti质粒为载体转移外源质粒为载体转移外源DNA进入植物的进入植物的植物基因工程研究日益兴旺，同时对植

10、物基因工程研究日益兴旺，同时对Ti质粒的精细分析和与寄质粒的精细分析和与寄主植物互作的研究成为分子植物病理学研究热点主植物互作的研究成为分子植物病理学研究热点.欧氏杆菌欧氏杆菌(Erwinia spp) 欧氏杆菌与大肠杆菌相近欧氏杆菌与大肠杆菌相近, ,同时也是重要植物病原细菌同时也是重要植物病原细菌, ,因此开始分子遗传学研究较早。因此开始分子遗传学研究较早。2020世纪世纪7070年代年代,M.P.Starr,M.P.Starr实验实验室进行了欧氏杆菌室进行了欧氏杆菌HfrHfr菌株的结合遗传学研究，利用营养缺菌株的结合遗传学研究，利用营养缺陷型标记转移法对其致病基因进行作图陷型标记转移法

11、对其致病基因进行作图, ,结果表明结果表明, ,致病基因位致病基因位于染色体上于染色体上hishis和和thrthr两个基因之间两个基因之间. .自自1984年年N.T.Keen首次报道从菊欧氏杆菌首次报道从菊欧氏杆菌(E.Chrysanthemi)中克隆到果胶裂解酶基因后中克隆到果胶裂解酶基因后,发表了有关欧氏发表了有关欧氏杆菌中杆菌中2个种个种pel 基因克隆的报道基因克隆的报道,其中涉及编码其中涉及编码5个主要同工酶个主要同工酶的的5个个pel基因基因.假单胞细菌假单胞细菌( (Pseudomonas.spp.).) 茄青枯假单胞茄青枯假单胞( (P.solanacearum) ) 丁香

12、假单胞丁香假单胞( (P.syringae) ) 大豆斑点病菌大豆斑点病菌( (P.s.pv.glycinea) ) 大豆假单胞大豆假单胞( (P.glycinea) )植物真菌病害的分子生物学研究植物真菌病害的分子生物学研究 传统植物病理学中许多重要的理论和学说都是以真菌病害传统植物病理学中许多重要的理论和学说都是以真菌病害为模式发展起来的为模式发展起来的, ,但在分子病理学方面的进展明显滞后但在分子病理学方面的进展明显滞后. . 1979 1979年年M.E.Case在粗糙脉孢霉在粗糙脉孢霉( (Neurospora crassa) )和和J.Tilburn在巢曲霉在巢曲霉( (Asper

13、gillus) )遗传转化系统试验相继取得成遗传转化系统试验相继取得成功后功后, ,丝状植物病原真菌的分子生物学研究发展迅速丝状植物病原真菌的分子生物学研究发展迅速. .5 5、分子植物病理学研究进展（、分子植物病理学研究进展（ReviewReview） Gene for Gene Hypothesis 植物对某种病原菌的特异性抗性取决于它是否具有抗植物对某种病原菌的特异性抗性取决于它是否具有抗性基因，即寄主分别含有感病基因（性基因，即寄主分别含有感病基因（r）和抗病基因（）和抗病基因（R），），病原分别含有有毒基因（病原分别含有有毒基因（vir）和无毒基因（）和无毒基因（avr），只有），只

14、有当具有抗性基因的植物与具有无毒基因的病原相遇时，才当具有抗性基因的植物与具有无毒基因的病原相遇时，才能激发植物的抗病反应，其他情况下二者表现亲和，即寄能激发植物的抗病反应，其他情况下二者表现亲和，即寄主表现感病。主表现感病。5.1 5.1 病原菌致病相关基因的研究进展病原菌致病相关基因的研究进展 致病性基因致病性基因( (Pathogenicity genes) )是病原均与寄主植是病原均与寄主植物互作过程中决定对植物致病性的基因。它决定着病原菌物互作过程中决定对植物致病性的基因。它决定着病原菌在寄主植物过程中与植物建立寄生关系，破坏寄主植物细在寄主植物过程中与植物建立寄生关系，破坏寄主植物

15、细胞正常生理代谢功能以及调控对植物的吸附、侵染、定植胞正常生理代谢功能以及调控对植物的吸附、侵染、定植扩展和最终显症等过程。致病基因主要包括毒性基因和无扩展和最终显症等过程。致病基因主要包括毒性基因和无毒基因毒基因, ,前者决定对植物表现亲和性前者决定对植物表现亲和性, ,即调控病害的发生与即调控病害的发生与发展发展; ;后者决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物品后者决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物品种表现专化性不亲和。种表现专化性不亲和。 无毒基因无毒基因(Avirulent genes)广泛存在于寄主植物的病原广泛存在于寄主植物的病原中，中，Staskawicz et al （

16、1984）通过把含无毒基因）通过把含无毒基因avrA的大的大豆丁香假单胞杆菌豆丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringaepv.glycinea)6号小号小种的种的Cosmid克隆接合转移到不含克隆接合转移到不含avrA的小种中，以遗传互的小种中，以遗传互补实验，克隆了补实验，克隆了avrA，这是克隆的第一个无毒基因。随后，这是克隆的第一个无毒基因。随后，许多研究者通过类似的方法从不同的病原许多研究者通过类似的方法从不同的病原(包括细菌、真菌包括细菌、真菌和病毒和病毒)中克隆了中克隆了50多个无毒基因，涉及多个无毒基因，涉及4050种病原物。种病原物。5.1.1 5.1.1 植物病

17、毒无毒基因的研究植物病毒无毒基因的研究TMV等近等近10种病毒的无毒基因已得到研究，现已明确种病毒的无毒基因已得到研究，现已明确的病毒无毒基因产物均为病毒致病相关功能蛋白，包括病的病毒无毒基因产物均为病毒致病相关功能蛋白，包括病毒外壳蛋白、复制酶蛋白和运动蛋白。毒外壳蛋白、复制酶蛋白和运动蛋白。 1986,Beachy, et al.将将TMV U1株的外壳蛋白株的外壳蛋白cDNA转转入烟草细胞，获得了高抗性的烟草植物，此后，利用外壳入烟草细胞，获得了高抗性的烟草植物，此后，利用外壳蛋白基因获得抗病毒病植物的方法很快被应用到其他病毒蛋白基因获得抗病毒病植物的方法很快被应用到其他病毒和植物上。和

18、植物上。 病毒：病毒：TMV，ALMV，CMV，TRV， PVX，PVY，SMV，BMV，RSV 寄主：寄主： 烟草，番茄，马铃薯，大豆，水稻烟草，番茄，马铃薯，大豆，水稻5.1.2 5.1.2 植物病原细菌无毒基因的研究植物病原细菌无毒基因的研究自第一个植物病原细菌无毒基因自第一个植物病原细菌无毒基因avrA从丁香假单胞菌从丁香假单胞菌大豆致病变种大豆致病变种6号生理小种中被克隆后，目前已从丁香假号生理小种中被克隆后，目前已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞菌单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞菌等植物病原细菌中克隆了等植物病原细菌中克隆了40多个无毒基因，

19、远远超过从其多个无毒基因，远远超过从其它植物病原菌中克隆到的无毒基因。它植物病原菌中克隆到的无毒基因。 细菌无毒基因产物在植物细胞内的定位及气与激发子细菌无毒基因产物在植物细胞内的定位及气与激发子HR的关系是近年来的研究热点之一。研究结果表明，无的关系是近年来的研究热点之一。研究结果表明，无毒基因产物实现其激发子功能的场所不在胞外空间，而是毒基因产物实现其激发子功能的场所不在胞外空间，而是依赖于功能性依赖于功能性hrp(Hypersensitive responses and pathogeni- city)基因产物直接将无毒基因产物从菌体内转移到寄主细基因产物直接将无毒基因产物从菌体内转移到

20、寄主细胞质内，从而实现其激发子功能。胞质内，从而实现其激发子功能。 应用植物基因工程技术将具有能激活植物自身防御系统的应用植物基因工程技术将具有能激活植物自身防御系统的无毒基因与适合于植物背景、非专一性的病原物诱导启动子组无毒基因与适合于植物背景、非专一性的病原物诱导启动子组合成嵌合基因构建到植物表达载体中。通过农杆菌或基因枪的合成嵌合基因构建到植物表达载体中。通过农杆菌或基因枪的介导转化植物介导转化植物, ,可筛选出高效广谱的抗真菌和细菌病害的转基可筛选出高效广谱的抗真菌和细菌病害的转基因植株。因植株。 杨希才等杨希才等(2001)(2001)从病原细菌从病原细菌Pseudomonas sy

21、ringae PV.tomato中获得的无毒基因中获得的无毒基因avrD(0.93kb)和从病原真菌和从病原真菌Phytophthoraparasitica中获得的无毒基因中获得的无毒基因Elicitin(0.294kb)分别分别与非专一性病原物诱导启动子与非专一性病原物诱导启动子Pill和和BG组成含组成含2 2个嵌合基因个嵌合基因( (Pill-avrD,BG-Elicitin) )的植物表达载体的植物表达载体pYH144和和pYHEt。通过农杆菌通过农杆菌LBA4404介导转化马铃薯介导转化马铃薯, ,其中用其中用pYH144载体转化载体转化2 2个品种个品种( (克新克新1 1号号,2

22、,2号号),),用用pYHEt载体转化载体转化3 3个品种个品种( (Desiree, ,克新克新2 2号号,4,4号号),),通过组织培养分别获得潮霉素通过组织培养分别获得潮霉素( (Hygromycin B) )标记的转基因马铃薯试管苗标记的转基因马铃薯试管苗, ,对马铃薯晚疫病具有明显的抗性。对马铃薯晚疫病具有明显的抗性。5.1.3 5.1.3 植物病原真菌无毒基因的研究植物病原真菌无毒基因的研究 由于缺乏简便有效的克隆方法由于缺乏简便有效的克隆方法, ,真菌无毒基因的克隆已真菌无毒基因的克隆已落后于细菌无毒基因以及相应植物抗病基因的克隆落后于细菌无毒基因以及相应植物抗病基因的克隆, ,

23、这已成这已成为进一步研究克隆抗病基因与真菌无毒基因产物互作及下为进一步研究克隆抗病基因与真菌无毒基因产物互作及下游信号转导途径的制约因素之一。游信号转导途径的制约因素之一。番茄叶霉病菌番茄叶霉病菌（Cladosporium fulvum）的无毒基因）的无毒基因 现已从不同番茄品种中鉴定了许多抗性基因，这些基因的现已从不同番茄品种中鉴定了许多抗性基因，这些基因的近等位基因系对已知的病原小种表现明显的不同反应被侵染叶近等位基因系对已知的病原小种表现明显的不同反应被侵染叶片的非原生质体汁液中含有真菌结构蛋白和定植期间被诱导产片的非原生质体汁液中含有真菌结构蛋白和定植期间被诱导产生的蛋白。其中之一是无

24、毒基因生的蛋白。其中之一是无毒基因avr9的产物，与番茄抗病基因的产物，与番茄抗病基因cf9的产物特异性互作。的产物特异性互作。 目前，已对目前，已对avr9基因产物进行了纯化和测序，明确了其分基因产物进行了纯化和测序，明确了其分子结构，为一个子结构，为一个63个个AA的前体蛋白，的前体蛋白，C末端含有末端含有28个个AA的成熟的成熟激发子，因此，可以从蛋白质到基因的克隆途径来鉴定基因。激发子，因此，可以从蛋白质到基因的克隆途径来鉴定基因。所分离的基因克隆表明，所分离的基因克隆表明，avr9的的ORF中有一个中有一个59bp的短内含子。的短内含子。 能在能在cf4基因型的番茄上诱导过敏反应的小

25、种专化型激发基因型的番茄上诱导过敏反应的小种专化型激发子及无毒基因子及无毒基因avr4的产物也已被纯化和测序并以相同的方法克的产物也已被纯化和测序并以相同的方法克隆到无毒基因隆到无毒基因avr4。稻瘟病菌稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的无毒基因的无毒基因稻瘟病是世界性重要病害，现已作为模式病害，从经典遗传学、分稻瘟病是世界性重要病害，现已作为模式病害，从经典遗传学、分子生物学核细胞生物学等不同的角度进行了全方位的分子病理学研究。子生物学核细胞生物学等不同的角度进行了全方位的分子病理学研究。 Rice Blast DiseaseZeigler, et al. 1994 在已鉴定

26、克隆的在已鉴定克隆的8个个 pwi 基因（基因（pathogenicity of weeping lovegrass,对画眉草致病）。对画眉草致病）。 pwi 1基因是从马唐与画眉草菌株杂交后鉴定出来的，基因是从马唐与画眉草菌株杂交后鉴定出来的，对画眉草的致病性发生了变化，因此，根据经典的无毒基因控制一种寄对画眉草的致病性发生了变化，因此，根据经典的无毒基因控制一种寄主植物品种转化性的概念预测主植物品种转化性的概念预测pwi 2基因有阻止对画眉草侵染的作用。目基因有阻止对画眉草侵染的作用。目前用染色体步查的方法已克隆了前用染色体步查的方法已克隆了pwi 2基因，并进行了测序。研究发现，基因，并

27、进行了测序。研究发现，大多数水稻菌株含有大多数水稻菌株含有1到数个到数个pwi 2拷贝。通过研究具有不同寄主专化性拷贝。通过研究具有不同寄主专化性的稻瘟病菌株的稻瘟病菌株pwi 2同源序列的分布，发现同源序列的分布，发现pwi是一个多基因家族。是一个多基因家族。亚麻栅锈病菌亚麻栅锈病菌（Melampsora lini）无毒基因无毒基因 亚麻锈病的寄主病原物关系是研究最充分的病例。目前已鉴定出亚麻锈病的寄主病原物关系是研究最充分的病例。目前已鉴定出3434个抗病基因分别存在于个抗病基因分别存在于7 7个群中。个群中。 用用 射线进行缺失诱变克隆到射线进行缺失诱变克隆到4 4个无毒个无毒基因。但目

28、前对亚麻锈病菌的转化系统还不十分成熟。基因。但目前对亚麻锈病菌的转化系统还不十分成熟。大麦云纹病菌大麦云纹病菌（Rhynchosporium secalis）无毒基因无毒基因 大麦近等位基因系大麦近等位基因系Atlas对小种对小种US138.1是感病的，是感病的， Atlas46带有抗病基带有抗病基因因Rrs1是对小种是对小种US138.1抗病的。抗病的。 Atlas Atlas46第一代、第二代对小种第一代、第二代对小种US138.1抗性遗传分析表明，这种抗性是由单个共显性基因控制的。小种抗性遗传分析表明，这种抗性是由单个共显性基因控制的。小种US138.1产生的产生的3种能诱导细胞坏死的多

29、肽种能诱导细胞坏死的多肽NIP1、NIP2和和NIP3在两个品种在两个品种上诱导坏死的能力是相同的。上诱导坏死的能力是相同的。 NIP1、NIP2的存在与不亲和互作中坏死的的存在与不亲和互作中坏死的发生有关，在亲和互作中不产生过敏反应。在小种发生有关，在亲和互作中不产生过敏反应。在小种US138.1的不亲和互作的不亲和互作中病程相关蛋白中病程相关蛋白PRHv-1的的mRNA的积累水平比在亲和互作中高，而且只的积累水平比在亲和互作中高，而且只有有US138.1产生的产生的NIP1能特异地诱导带能特异地诱导带Rrs1抗病基因的品种产生抗病基因的品种产生PRHv-1的的mRNA。因此，。因此， NI

30、P1可能是一种无毒基因。该基因的克隆和转化研究正可能是一种无毒基因。该基因的克隆和转化研究正在进行。在进行。5.2 5.2 植物抗病基因的研究植物抗病基因的研究自自Johal,et al(1992)成功克隆出第一个玉米抗圆斑病成功克隆出第一个玉米抗圆斑病R基因基因Hm1以来，迄今人们已经从以来，迄今人们已经从9种不同植物中成功地克种不同植物中成功地克隆出了隆出了22种种R基因。克隆植物基因。克隆植物R基因一般采用产物导向法基因一般采用产物导向法(product-orientated approaches)、鸟枪射击法、鸟枪射击法(shot-gun complementation)、扣除杂交法、

31、扣除杂交法(subtractive hybridization)、转座子标记法转座子标记法(transposon tagging)和图位克隆法和图位克隆法(map-based cloning)等等7种方法，但只有转座子标记法和定位克种方法，但只有转座子标记法和定位克隆法取得了成功。上述隆法取得了成功。上述22种种R基因都是采用这两种方法克基因都是采用这两种方法克隆的。隆的。 已已 克克 隆隆 的的 植植 物物 抗抗 病病 基基 因因随着分子生物学技术在分子植物病理学中的广泛应用，随着分子生物学技术在分子植物病理学中的广泛应用，尤其是抗病基因的成功克隆与分析，对植物抗病基因的分子尤其是抗病基因的

32、成功克隆与分析，对植物抗病基因的分子功能已有一定的实验依据。功能已有一定的实验依据。B.Baker和和K.E.Hammond-Kosack等（等（1997）分别从寄主病原物相互作用和克隆分离的抗病）分别从寄主病原物相互作用和克隆分离的抗病基因结构特征阐述了植物抗病基因的功能即识别、信号传导基因结构特征阐述了植物抗病基因的功能即识别、信号传导和进化。和进化。 有待解决的问题有待解决的问题： 在抗病基因产物中那些结构决定病原物的特异性识别？在抗病基因产物中那些结构决定病原物的特异性识别？ 其下游信号物质是什么？这些物质又是如何起作用的？其下游信号物质是什么？这些物质又是如何起作用的？ 被诱导的防卫

33、反应对不同病原物为什么具有特异性抗性被诱导的防卫反应对不同病原物为什么具有特异性抗性？ 自然界中新的抗性基因是如何产生的？自然界中新的抗性基因是如何产生的？第一章第一章 病原物致病相关基因病原物致病相关基因第一节第一节 病原物基因组的结构特征病原物基因组的结构特征 植物病原真菌基因组植物病原真菌基因组 植物病原细菌基因组植物病原细菌基因组 植物病毒基因组植物病毒基因组 植物线虫基因组植物线虫基因组第二节第二节 病原物致病基因的类型病原物致病基因的类型 1 1 决定亲和性的基因决定亲和性的基因 1.1 1.1 1.1 1.1 编码致病因子的基因：编码致病因子的基因：编码致病因子的基因：编码致病因

34、子的基因：胞壁水解酶酶基因、毒素胞壁水解酶酶基因、毒素基因、植物生长调节物质合成有关酶的基因、编码未知产物的基因、植物生长调节物质合成有关酶的基因、编码未知产物的基因。基因。 病原菌中还有正向调控寄主范围的基因，将这些基因转移病原菌中还有正向调控寄主范围的基因，将这些基因转移到相关细菌中，可使受体菌扩大寄主范围，使原来的不亲和互到相关细菌中，可使受体菌扩大寄主范围，使原来的不亲和互作变为亲和互作，这在植物病原细菌的小种和致病变种中都有作变为亲和互作，这在植物病原细菌的小种和致病变种中都有发现。发现。 1.2 1.2 1.2 1.2 克服寄主防卫反应的基因：克服寄主防卫反应的基因：克服寄主防卫反

35、应的基因：克服寄主防卫反应的基因：目前已报道的有植物目前已报道的有植物病原真菌对植保素解毒酶基因（病原真菌对植保素解毒酶基因（pda）。）。 2 2 决定不亲和性的基因决定不亲和性的基因2.1 2.1 2.1 2.1 无毒基因（无毒基因（无毒基因（无毒基因（avravr） 无毒基因编码特异性激发子与抗病基因产物受体互作。病原无无毒基因编码特异性激发子与抗病基因产物受体互作。病原无毒基因编码的产物是蛋白质，这些蛋白质有些是直接起激发子的作毒基因编码的产物是蛋白质，这些蛋白质有些是直接起激发子的作用，如番茄叶霉病菌的无毒基因用，如番茄叶霉病菌的无毒基因avr9编码编码63个个AA的多肽。而有些的多

36、肽。而有些是编码激发子合成的酶，如番茄丁香假单胞菌的无毒基因是编码激发子合成的酶，如番茄丁香假单胞菌的无毒基因avrD的产的产物是物是3.4104u的蛋白，在合成激发子中具有酶的功能。的蛋白，在合成激发子中具有酶的功能。 TMV的外壳蛋白在含有的外壳蛋白在含有N抗病基因的烟草中是过敏反应的激发抗病基因的烟草中是过敏反应的激发子；其子；其avr表型决定因子可能是复制酶蛋白，有些植物病毒的运动表型决定因子可能是复制酶蛋白，有些植物病毒的运动蛋白基因也具有无毒基因的功能蛋白基因也具有无毒基因的功能 （Padgett et al，1993） 。2.2 2.2 2.2 2.2 决定非寄主不亲和性基因（寄

37、主专化性基因）决定非寄主不亲和性基因（寄主专化性基因）决定非寄主不亲和性基因（寄主专化性基因）决定非寄主不亲和性基因（寄主专化性基因） 目前，在植物病原细菌和真菌中都已分离到非寄主专化性的激目前，在植物病原细菌和真菌中都已分离到非寄主专化性的激发子。韦忠民（发子。韦忠民（1993）证明梨火疫病菌）证明梨火疫病菌hrpN的编码蛋白（的编码蛋白（harpin）具有激发子功能，能诱导非寄主植物产生过敏反应。具有激发子功能，能诱导非寄主植物产生过敏反应。第二节第二节 植物病毒的侵染过程植物病毒的侵染过程 与致病相关基因与致病相关基因1 1 侵染过程（自学）侵染过程（自学）王金生王金生. .分子植物病理

38、学分子植物病理学. .中国农业出版社，中国农业出版社，1999.1999.肖火根肖火根. .病毒在植物体内的运转病毒在植物体内的运转. .病毒学报病毒学报, ,2001,17(3):282-287.张振臣张振臣. .植物病毒胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究植物病毒胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究 进展进展. .农业生物技术学报，农业生物技术学报，2000,8(4):403-408.曹雪松曹雪松.植物病毒在胞内和胞间运动的研究植物病毒在胞内和胞间运动的研究.莱阳农学院学报，莱阳农学院学报， 2002,19(4):251-252.2 2 植物病毒致病相关基因植物病毒致病相关基因2.1

39、2.1 外壳蛋白基因外壳蛋白基因（coat protein gene） R.Beachy(1986)首次将首次将TMV 的的CP基因转入烟草，培育出稳定遗传基因转入烟草，培育出稳定遗传的抗病毒工程植物以来，已经克隆了至少的抗病毒工程植物以来，已经克隆了至少15个病毒组中个病毒组中30种病毒的种病毒的CP基因，并成功转化了基因，并成功转化了20多种植物，其中一些植株已经进入田间试验。多种植物，其中一些植株已经进入田间试验。 CP基因的抗性机理基因的抗性机理：（：（1）抑制病毒脱壳。（）抑制病毒脱壳。（2）干扰病毒的复制。）干扰病毒的复制。（3）限制病毒粒子的扩展与运转。（）限制病毒粒子的扩展与运

40、转。（1）CP基因所表达的基因所表达的mRNA与侵与侵入病毒入病毒RNA之间相互作用之间相互作用（RNA介导的病毒抗性介导的病毒抗性）。）。 存在的问题存在的问题（1）多表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类型）多表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类型和高抗类型较少。（和高抗类型较少。（2）具有潜在危险性。）具有潜在危险性。2.2 2.2 复制酶基因复制酶基因（replicase gene）病毒编码的复制酶蛋白存在多个保守序列，其中一个是存在于所有病毒编码的复制酶蛋白存在多个保守序列，其中一个是存在于所有RNA聚合酶中的聚合酶中的Gly-Asp-Asp三肽基元序列（三肽基元序列（GDD mo

41、tif）, ,对维持聚合对维持聚合酶活性必不可少。另一个保守序列是三磷酸核苷酸结合结构域（酶活性必不可少。另一个保守序列是三磷酸核苷酸结合结构域（NTP binding domain），在病毒复制时的解螺旋过程中起重要作用。），在病毒复制时的解螺旋过程中起重要作用。Zaitlin et al(1990)将将TMV的的54KD蛋白基因转入烟草并获得抗性烟草后，蛋白基因转入烟草并获得抗性烟草后，国内外陆续报道了此类由病毒非结构蛋白基因介导的植物对病毒的抗性。国内外陆续报道了此类由病毒非结构蛋白基因介导的植物对病毒的抗性。 复制酶介导抗性的特点：复制酶介导抗性的特点： （1 1）对完整病毒粒子和裸露

42、病毒对完整病毒粒子和裸露病毒RNA均具有高度抗性。均具有高度抗性。 （2 2）抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数无关。抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数无关。 （3 3）抗性持续时间长，并对高温（抗性持续时间长，并对高温（3131）不敏感。）不敏感。 （4 4）具有明显的株专化性。具有明显的株专化性。 抗性机理：抗性机理： （1 1）在蛋白质水平上，复制酶蛋白在病毒的侵染过在蛋白质水平上，复制酶蛋白在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正链和负链复制的平衡或干扰了控制复制酶活性的反馈抑制链和负链复制的平衡或干扰了控制

43、复制酶活性的反馈抑制途径。途径。 （2 2）在在RNARNA水平上，转录出的水平上，转录出的mRNA与病毒的复制酶与病毒的复制酶进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是mRNA诱导了诱导了植物的自然抗性。植物的自然抗性。 缺损型复制酶基因也可以介导抗性缺损型复制酶基因也可以介导抗性。T.M.Anderson et al (1992)将将TMV Fny株系的株系的RNARNA内部缺失内部缺失94个核苷酸后个核苷酸后导入烟草，结果，缺失造成导入烟草，结果，缺失造成ORF的移码，其翻译产物只有的移码，其翻译产物只有完整的完整的97KD蛋白的蛋白的75左右，但仍然表

44、达对左右，但仍然表达对CMV的高度的高度抗性。抗性。2.3 2.3 运动蛋白基因运动蛋白基因（movement protein gene） 病毒基因编码的基因产物病毒基因编码的基因产物MP能与胞间连丝结合，使胞间连丝可以能与胞间连丝结合，使胞间连丝可以通过物质的孔径增大，以允许病毒粒子或基因组核酸进入邻近细胞中，通过物质的孔径增大，以允许病毒粒子或基因组核酸进入邻近细胞中，从而实现病毒在细胞间的运动。从而实现病毒在细胞间的运动。 研究证明，完整的研究证明，完整的TMV基因表达并不能介导抗性的产生。基因表达并不能介导抗性的产生。M. Lapidot et al(1993) & SI Malysh

45、enko et al（1993）将）将TMV的缺陷型的缺陷型MP（dMP）基因转入烟草后能获得抗）基因转入烟草后能获得抗TMV植株，进一步研究表明，转植株，进一步研究表明，转dMP基因的烟草不仅对基因的烟草不仅对TMV，还对其他病毒如，还对其他病毒如CMV、BMV等具有不同等具有不同程度的抗性。由此可见，各种病毒程度的抗性。由此可见，各种病毒MP之间虽然缺乏同源性，但具有相之间虽然缺乏同源性，但具有相同的功能。同的功能。 抗性机制：由于缺陷型抗性机制：由于缺陷型MP与野生型与野生型MP竞争胞间连丝上的结合位点竞争胞间连丝上的结合位点而实现的。而实现的。2.4 2.4 卫星病毒卫星病毒（sate

46、llite RNA ）某些病毒除基因组外，还伴有一些小片段某些病毒除基因组外，还伴有一些小片段RNA，它们本身并没，它们本身并没有编码外壳蛋白的遗传信息，称为卫星有编码外壳蛋白的遗传信息，称为卫星RNA。携带卫星。携带卫星RNA的病毒称的病毒称为辅助病毒。迄今已报道有为辅助病毒。迄今已报道有6组共组共26种植物病毒带有卫星种植物病毒带有卫星RNA。 卫星卫星RNA对植物病毒的影响有对植物病毒的影响有3种表现：种表现：加重症状；无调节作用；加重症状；无调节作用；加重症状；无调节作用；加重症状；无调节作用；减轻症状。减轻症状。减轻症状。减轻症状。1986年，年，Baulcombe等首次将等首次将C

47、MV的的sat RNA 克隆转入烟克隆转入烟草，获得了抗草，获得了抗CMV的基因工程植株。的基因工程植株。 抗性机制：抗性机制：卫星卫星RNA与病毒基因组争夺病毒复制酶。由于卫星与病毒基因组争夺病毒复制酶。由于卫星 RNA能更有效地占据能更有效地占据RNA复制酶，而且其分子小、复制周期短，因此，复制酶，而且其分子小、复制周期短，因此，随着复制循环的增加，随着复制循环的增加， sat RNA的复制量远远大于基因组的复制量远远大于基因组RNA复制量，复制量，最终是病毒基因组的复制受阻。最终是病毒基因组的复制受阻。u 虽然卫星虽然卫星RNARNA只需低水平表达，不产生异源蛋白，但这种抗性仅只需低水平

48、表达，不产生异源蛋白，但这种抗性仅在侵染晚期发挥作用，而且转基因植物体内减轻症状的卫星在侵染晚期发挥作用，而且转基因植物体内减轻症状的卫星RNARNA有可能有可能突变成加重症状的卫星突变成加重症状的卫星RNARNA，因此具有一定的潜在危险性。，因此具有一定的潜在危险性。2.5 2.5 核酶基因核酶基因（ribozyme gene）核酶是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切割自身及其它核酶是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切割自身及其它RNA分子的小分子分子的小分子RNA。广泛存在于一些类病毒和病毒卫星。广泛存在于一些类病毒和病毒卫星RNA序列中。序列中。 根据核酶的结构可分为锤头型和发夹型，

49、其中锤头型核酶较为普遍。根据核酶的结构可分为锤头型和发夹型，其中锤头型核酶较为普遍。人们可根据核酶可切割任何生物的人们可根据核酶可切割任何生物的RNA，而且对底物作用位点的碱基序，而且对底物作用位点的碱基序列要求不严格这一特性，设计出切割已知序列的病原性列要求不严格这一特性，设计出切割已知序列的病原性RNA人工核酶。人工核酶。目前，人工核酶已成功应用于动物细胞，在体外实现了对目前，人工核酶已成功应用于动物细胞，在体外实现了对HIV等有害基等有害基因转录物的特异性切割。在植物抗病毒方面，也成功地在体外合成了能因转录物的特异性切割。在植物抗病毒方面，也成功地在体外合成了能切割马铃薯纺锤块茎类病毒（

50、切割马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTV）等的基因组）等的基因组RNA的核酶、能切割的核酶、能切割苹果锈果类病毒的核酶等，但是，在转基因植物水平上的进展缓慢。体苹果锈果类病毒的核酶等，但是，在转基因植物水平上的进展缓慢。体内表达不如体外表达有效。内表达不如体外表达有效。 该方法也存在潜在危险性，即核酶可能将细胞该方法也存在潜在危险性，即核酶可能将细胞RNARNA作为靶作为靶RNARNA切割而切割而破坏细胞正常功能。破坏细胞正常功能。第三节第三节 植物病原细菌的致病相关基因植物病原细菌的致病相关基因1 1 基因克隆的策略和研究方法基因克隆的策略和研究方法1.1 1.1 基因克隆策略基因克隆策略1.2

51、1.2 突变诱变方法突变诱变方法1.2.1 1.2.1 物理诱变物理诱变1.2.2 1.2.2 化学诱变化学诱变1.2.3 1.2.3 转座子诱变转座子诱变突变方法突变方法1.1.物理诱变物理诱变 紫外线（紫外线（UVUV）、）、X X射线和射线和、射线诱变；射线诱变；离子束诱变，离子束是元素的离子经高能加速器加速后获得的放射线；中子 2.2.化学诱变化学诱变 化学诱变剂：碱基类似物、亚硝酸如亚硝基胍(NTG）、丫定橙染料、烷化剂如甲基磺酸乙脂（EMS）等3.3.转座子插入突变转座子插入突变野生型细菌的基因组文库野生型细菌的基因组文库物理和化学诱变获得的突变体两亲交配或三亲交配进行功能互补两亲

52、交配或三亲交配进行功能互补获得能恢复突变体表型的阳性克隆获得能恢复突变体表型的阳性克隆克隆片段的亚克隆分析和进一步功能互补验证克隆片段的亚克隆分析和进一步功能互补验证基因的克隆、测序和序列分析基因的克隆、测序和序列分析热激或电激转化转座子质粒热激或电激转化转座子质粒接合实验接合实验转座子插入突变转座子插入突变转座子诱变致病性测定，获得致病性发生变化的突变体获得相应的突变体以转座子的侧端序列为探针进行Southern杂交，确定转座子插入的拷贝数，明确突变表型是由于转座子的插入引起得突变体的遗传稳定性分析Fig.SymptomsexpressedoncitrusleavesFig.Symptoms

53、expressedoncitrusleaves2weeksafterinoculationwith2weeksafterinoculationwithX.campestrisX.campestrispv.citriXW47(A),XT906pv.citriXW47(A),XT906(B),orXT906(pUW906XAp)(C).(B),orXT906(pUW906XAp)(C).RequirementforPhosphoglucoseIsomeraseofRequirementforPhosphoglucoseIsomeraseofXanthomonascampestrisXanthomo

54、nascampestrisininPathogenesisofCitrusCanker.PathogenesisofCitrusCanker.Appl.Envir.Microbiol.1999;65:5564-5573Appl.Envir.Microbiol.1999;65:5564-5573 Fig.StructuralorganizationoftheFig.Structuralorganizationofthepgipgi(A)and(A)andhrpXhrpX(B)lociof(B)lociofX.campestrisX.campestrispv.citripv.citriandofp

55、lasmidsderivedtherefrom.(A)Restrictionmapofthegenomicregionandofplasmidsderivedtherefrom.(A)Restrictionmapofthegenomicregioncontainingcontainingpgipgishowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthesiteofshowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthesiteoftransposoninsertioninthemutantXT

56、906.(B)RestrictionmapofthegenomicregiontransposoninsertioninthemutantXT906.(B)RestrictionmapofthegenomicregioncontainingcontaininghrpXhrpXshowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthestructureshowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthestructureoftheplasmidpUW10PGUS,whichcontainsano

57、ftheplasmidpUW10PGUS,whichcontainsanhrpXhrpX: :gusgusfusiongene.fusiongene.Wei Qian et al. Comparative and functional genomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestris pv. Campestris Genome Res. 2005; 15: 757-767A schematic illustration of the experimentally determined in

58、teraction between Xcc and host cell 1.3 1.3 基因文库的构建基因文库的构建 构建基因文库常用的载体有质粒（构建基因文库常用的载体有质粒（plasmid）、黏粒）、黏粒（cosmid）和）和 噬菌体噬菌体(phase (phase ) )。适用于作基因克隆的质粒载。适用于作基因克隆的质粒载体必须具备体必须具备3 3个共同的组成部分，即复制因子、选择标记和克隆个共同的组成部分，即复制因子、选择标记和克隆位点。位点。 理想基因文库应具备的条件：理想基因文库应具备的条件：（1）以一种稳定的形式含有基以一种稳定的形式含有基因组因组DNADNA的序列。的序列。（2

59、）克隆总数不宜过大。克隆总数不宜过大。（3）文库的克隆片段大小必须文库的克隆片段大小必须足够包含一个完整的基因。足够包含一个完整的基因。（4）克隆片段大小适应于载体的容纳能力，便克隆片段大小适应于载体的容纳能力，便于进行酶切图谱分析。于进行酶切图谱分析。（5）应从少量的起始材料进行构建并易于筛选理想应从少量的起始材料进行构建并易于筛选理想的片段。的片段。（6）克隆片段之间需要有部分片段重叠以利于克隆片段之间需要有部分片段重叠以利于chromosome chromosome walkingwalking。（7）克隆片段应易于从载体上切下而不带有任何载体序列。克隆片段应易于从载体上切下而不带有任何

60、载体序列。（8）文库应能在克隆不损失的情况下得到扩增，而且能长期保存。文库应能在克隆不损失的情况下得到扩增，而且能长期保存。1.4 1.4 基因克隆基因克隆1.4.11.4.1转座子表签法转座子表签法1.4.2 1.4.2 鸟枪法鸟枪法在已获得标记基因突变体和基因文库的基础上进行，在已获得标记基因突变体和基因文库的基础上进行，用基因库互补突变体筛选使图变体表型恢复的克隆。该克用基因库互补突变体筛选使图变体表型恢复的克隆。该克隆含有目的基因功能片段的序列，并将此克隆转移到隆含有目的基因功能片段的序列，并将此克隆转移到E.coli中得到纯系克隆，在与突变体互补进行验证。中得到纯系克隆，在与突变体互

61、补进行验证。1.4.3 1.4.3 基因功能互补法基因功能互补法 常用来克隆控制寄主范围的基因如无毒基因。常用来克隆控制寄主范围的基因如无毒基因。 1.5 1.5 克隆片段的亚克隆分析克隆片段的亚克隆分析2 2 与病理过程有关的基因与病理过程有关的基因 植物病原菌的侵染过程一般包括趋化性、吸附、定植物病原菌的侵染过程一般包括趋化性、吸附、定植和侵入。植和侵入。 已鉴定出土壤农杆菌的一条染色体基因已鉴定出土壤农杆菌的一条染色体基因chvE与其细与其细菌的趋化性有关，此外，该细菌染色体上的菌的趋化性有关，此外，该细菌染色体上的picA基因还基因还影响细菌的聚集而与毒性有关。影响细菌的聚集而与毒性有

62、关。 A.Kelman等用转座子诱变方法获得了青枯假单胞菌等用转座子诱变方法获得了青枯假单胞菌类似多型性表型转换的现象，并在分子水平上进行了研类似多型性表型转换的现象，并在分子水平上进行了研究，该基因为究，该基因为phcA.2.1 与病原菌侵染有关的基因与病原菌侵染有关的基因 2.2 决定显症的基因决定显症的基因植物病原细菌的症状类型与其致病生化因子有密切关植物病原细菌的症状类型与其致病生化因子有密切关系。如细胞降解酶与组织浸离症状有关；产生坏死症状的系。如细胞降解酶与组织浸离症状有关；产生坏死症状的病菌如丁香假单胞引起的各种叶斑病都涉及到毒素的作用；病菌如丁香假单胞引起的各种叶斑病都涉及到毒

63、素的作用；毒素和多糖还和植物萎蔫症状有关。有关这些基因的克隆、毒素和多糖还和植物萎蔫症状有关。有关这些基因的克隆、结构鉴定和功能分析早已展开并取得很大进展。结构鉴定和功能分析早已展开并取得很大进展。 黄单胞菌中一个黄单胞菌中一个800bp的的opsX基因参与基因参与LPS的生物合的生物合成和修饰以及诱导水渍状反应；柑桔黄单胞的成和修饰以及诱导水渍状反应；柑桔黄单胞的pthA基因是基因是引起增生性溃疡症状所必需的。引起增生性溃疡症状所必需的。D.W.Gabriel, et al(1995)2.3 2.3 决定寄主范围的基因决定寄主范围的基因2.3.1 2.3.1 正向调控寄主范围的基因正向调控寄

64、主范围的基因根癌土壤杆菌（根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）青枯假单胞菌（青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum）黄单胞菌水稻白叶枯枝病致病变种（黄单胞菌水稻白叶枯枝病致病变种（X. Oxyzae pv. oxyzae）2.3.2 2.3.2 负向调控寄主范围的基因负向调控寄主范围的基因植物病原细菌的无毒基因是负向调控寄主范围的植物病原细菌的无毒基因是负向调控寄主范围的基因，无毒基因直接产物或间接产物作为激发子与相基因，无毒基因直接产物或间接产物作为激发子与相应抗病基因产物识别诱导寄主防卫基因表达，从而表应抗病基因产物识别诱导寄主防卫基因

65、表达，从而表现小种品种互作的不亲和。无毒基因失活或缺乏相现小种品种互作的不亲和。无毒基因失活或缺乏相应的无毒基因则表现小种品种互作的亲和反应，所应的无毒基因则表现小种品种互作的亲和反应，所以无毒基因的作用是病原菌小种对不同品种的寄主范以无毒基因的作用是病原菌小种对不同品种的寄主范围的负向调控基因。围的负向调控基因。 此外，负向调控寄主范围的基因也可以表现在不此外，负向调控寄主范围的基因也可以表现在不同致病变种的致病能力上。同致病变种的致病能力上。植物病原细菌无毒基因的克隆植物病原细菌无毒基因的克隆 B.J.Staskawica （1984）首先通过基因互补）首先通过基因互补法从大豆丁香假单胞法

66、从大豆丁香假单胞6号小种中筛选到一个具有号小种中筛选到一个具有无毒基因功能的克隆，无毒基因功能的克隆，Napoli（1987）将此基因）将此基因命名为命名为avrA。此后，已从丁香假单胞菌、甘蓝黑。此后，已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞中克隆到腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞中克隆到40多个无毒基因。多个无毒基因。无毒基因的表达和调控无毒基因的表达和调控 以以P.syringae pv.glycinea中中avrB为代表，其不能在富为代表，其不能在富加培养基上表达，但可以在基本培养基上表达。其表达水加培养基上表达，但可以在基本培养基上表达。其表达水平依赖于碳源。在侵

67、染期间，平依赖于碳源。在侵染期间，avrB在感病或抗病寄主上都在感病或抗病寄主上都能高水平表达，在非寄主植物上也能表达，说明表达不受能高水平表达，在非寄主植物上也能表达，说明表达不受特异性植物因子调控。特异性植物因子调控。 以以X.campestris pv. Vesicatoria avrBs3为代表，能在为代表，能在富加、基本培养基以及植物上组成性表达。这类基因的表富加、基本培养基以及植物上组成性表达。这类基因的表达不依赖于达不依赖于hrp基因簇，但无毒表型的出现需要有功能的基因簇，但无毒表型的出现需要有功能的hrp基因，可能是需要基因，可能是需要hrp基因编码的无毒蛋白通道。基因编码的无

68、毒蛋白通道。无毒基因的生理功能无毒基因的生理功能研究表明研究表明,许多植物病原细菌中存在着无毒基因的许多植物病原细菌中存在着无毒基因的隐性同源序列隐性同源序列,但这种同源序列已丧失了诱导过敏性坏死但这种同源序列已丧失了诱导过敏性坏死反应的功能。说明无毒基因除了有诱导过敏性坏死反应反应的功能。说明无毒基因除了有诱导过敏性坏死反应的功能外，还有其自身的生理功能。的功能外，还有其自身的生理功能。无毒基因是病原物遗传因子，除诱导寄主植物（含无毒基因是病原物遗传因子，除诱导寄主植物（含抗性基因）产生过敏性坏死反应外，还具有决定病原物抗性基因）产生过敏性坏死反应外，还具有决定病原物致病性或适应性的功能。致

69、病性或适应性的功能。 无毒基因的概念是相对的，在一种病原物中起无毒无毒基因的概念是相对的，在一种病原物中起无毒基因作用而在另一种病原物中起致病作用。基因作用而在另一种病原物中起致病作用。无毒基因与无毒基因与hrp基因互作基因互作无毒基因通常在体外、腐生或非致病细菌中并不无毒基因通常在体外、腐生或非致病细菌中并不表达。因此，一般情况下无毒基因产物不足以在植物表达。因此，一般情况下无毒基因产物不足以在植物中诱导过敏反应，必须依赖于一个具有完全功能的中诱导过敏反应，必须依赖于一个具有完全功能的hrp基因介导的机制分泌。基因介导的机制分泌。 近年来的研究表明，作为效应分子，无毒基因产近年来的研究表明，

70、作为效应分子，无毒基因产物是通过物是通过hrp基因簇所编码的基因簇所编码的型通道分泌系统运送至型通道分泌系统运送至细菌细胞外与寄主发生相互作用的。细菌细胞外与寄主发生相互作用的。2.4 决定病原菌致病性或毒性的基因决定病原菌致病性或毒性的基因2.4.1 胞壁降解酶基因胞壁降解酶基因 果胶酶基因果胶酶基因 果胶酶是软腐欧氏杆菌的重要致病因子，并在果胶酶是软腐欧氏杆菌的重要致病因子，并在萎蔫性病害（萎蔫性病害（P.solanacearum ）中也起作用，现）中也起作用，现已在至少已在至少5种病原细菌中克隆到果胶酶基因。种病原细菌中克隆到果胶酶基因。 除此之外，在青枯假单胞菌已鉴定出除此之外，在青枯

71、假单胞菌已鉴定出4种胞外种胞外酶基因。酶基因。 纤维素酶基因纤维素酶基因 蛋白酶基因蛋白酶基因 编码纤维素酶基因已在软腐欧氏杆菌和青枯假单编码纤维素酶基因已在软腐欧氏杆菌和青枯假单胞中得到克隆，其主要类型都是内聚葡聚糖酶基因。胞中得到克隆，其主要类型都是内聚葡聚糖酶基因。在荧光假单胞（在荧光假单胞（P.flouorescens）胞外酶对马铃薯块组织的）胞外酶对马铃薯块组织的浸离作用研究中发现，蛋白酶有软化薯块组织的浸离作用。王浸离作用研究中发现，蛋白酶有软化薯块组织的浸离作用。王金生等（金生等（1984）研究表明，）研究表明，3中软腐病菌产生的蛋白酶在离体中软腐病菌产生的蛋白酶在离体条件下对马

72、铃薯块组织有较强的浸离力。目前已从软腐欧氏杆条件下对马铃薯块组织有较强的浸离力。目前已从软腐欧氏杆菌中克隆了许多蛋白酶基因并对其产物特征进行了研究，但这菌中克隆了许多蛋白酶基因并对其产物特征进行了研究，但这些基因在致病过程中的作用及其调控机理尚不清楚。些基因在致病过程中的作用及其调控机理尚不清楚。2.4.2 毒素基因毒素基因植物病原细菌的毒素一般是低分子量的非寄主专植物病原细菌的毒素一般是低分子量的非寄主专化性毒素。这一特征有利于对毒素进行遗传分析，又由化性毒素。这一特征有利于对毒素进行遗传分析，又由于生物测定是可以敏感微生物代替寄主植物进行生物测于生物测定是可以敏感微生物代替寄主植物进行生物

73、测试，因此筛选程序简单、快速。目前已对试，因此筛选程序简单、快速。目前已对4种丁香假单种丁香假单胞致病变种的毒素进行了遗传分析。胞致病变种的毒素进行了遗传分析。致病变种毒素致病变种毒素 TOX菌株类型菌株类型 毒性表现毒性表现pv.tomato/coronatine Tn5突变体突变体 仅产生小病斑，菌群增长不大仅产生小病斑，菌群增长不大 pv.phaseolicola/phaseolotoxin UV突变体突变体 菌群发育正常，但无症状出现菌群发育正常，但无症状出现pv.syringae/syringomycin Tn5突变体突变体 在樱桃上降低毒性或完全丧失毒性在樱桃上降低毒性或完全丧失毒

74、性pv.tabaci/tabtoxin 自然突变体自然突变体 接种接种3d细菌生长曲线与野生型不同细菌生长曲线与野生型不同2.4.3 胞外多糖基因胞外多糖基因研究证明，在青枯病菌、梨火疫病菌、玉米细菌性研究证明，在青枯病菌、梨火疫病菌、玉米细菌性枯萎病菌和甘蓝黑腐病菌等植物病原菌中胞外多糖与其枯萎病菌和甘蓝黑腐病菌等植物病原菌中胞外多糖与其致病性有关。致病性有关。2.4.4 植物激素基因植物激素基因致病细菌诱导植物组织过度生长是由于细菌产生植致病细菌诱导植物组织过度生长是由于细菌产生植物激素的作用。这些激素的遗传决定因子在油橄榄癌肿物激素的作用。这些激素的遗传决定因子在油橄榄癌肿病假单胞菌和根

75、癌土壤杆菌中已有详细研究。病假单胞菌和根癌土壤杆菌中已有详细研究。2.4.5 hrp 基因基因 Hrp基因的鉴定基因的鉴定 P.B.Lindgren(1986)用转座子用转座子Tn5对菜豆晕斑病菌对菜豆晕斑病菌（P.syringae pv.phaseolicola）进行随机插入诱变，筛）进行随机插入诱变，筛选出选出6个突变体，它们既失去在感病菜豆品种上的致病个突变体，它们既失去在感病菜豆品种上的致病性，同时也不再引起非寄主植物如番茄、大豆、烟草性，同时也不再引起非寄主植物如番茄、大豆、烟草和豇豆的过敏性坏死反应。和豇豆的过敏性坏死反应。Southern杂交和标记交换杂交和标记交换分析证明，这些

76、突变体表型改变是由于单个分析证明，这些突变体表型改变是由于单个Tn5插入的插入的结果。从野生型基因文库中筛选到一个黏粒结果。从野生型基因文库中筛选到一个黏粒pPL6，可，可以恢复所有以恢复所有6个突变体的个突变体的hrp突变表型，说明该黏粒上突变表型，说明该黏粒上带有带有hrp基因，且基因，且hrp基因是由多个基因组成的基因簇。基因是由多个基因组成的基因簇。 Hrp基因的结构和功能保守性基因的结构和功能保守性以以P.s.pv.syringae的的hrp基因为探针与该病原的其他基因为探针与该病原的其他8个个致病变种的基因组致病变种的基因组DNA进行杂交，结果都表现出同源性，进行杂交，结果都表现出

77、同源性，但不同致病变种间的杂交信号强度有差别。但不同致病变种间的杂交信号强度有差别。 研究证明，不同病原细菌的研究证明，不同病原细菌的hrp之间也存在同源性，之间也存在同源性， E.amylovora 的的hrp至少与至少与8种植物病原细菌基因组种植物病原细菌基因组DNA有同有同源性，其中包括在植物中不引起源性，其中包括在植物中不引起HR的的E.stewartii和和E.chrysanthemi。此外，还发现非病原细菌。此外，还发现非病原细菌E.coli也含有一也含有一些能互补些能互补E.amylovora hrp 突变体的基因。突变体的基因。根据根据hrp基因的基因的DNA杂交和异源互补研究

78、结果，植物杂交和异源互补研究结果，植物病原细菌可以归类为两组病原细菌可以归类为两组（1）包括青枯假单胞和甘蔗黑）包括青枯假单胞和甘蔗黑腐黄单胞的致病变种，其腐黄单胞的致病变种，其hrp基因簇是共线性的，以相对基因簇是共线性的，以相对较高的严谨度相互杂交，且同源性涉及到较高的严谨度相互杂交，且同源性涉及到hrp基因的大部基因的大部分；（分；（2）包括丁香假单胞的致病变种和梨火疫病菌，其）包括丁香假单胞的致病变种和梨火疫病菌，其hrp基因在同一组菌之间具有同源性，但两组菌之间的基因在同一组菌之间具有同源性，但两组菌之间的hrp基因不存在同源性。基因不存在同源性。 植物病原菌中的植物病原菌中的hrp

79、基因的广泛存在及保守性说明了基因的广泛存在及保守性说明了许多不同植物病害具有共同的机制，并且可能编码与病害许多不同植物病害具有共同的机制，并且可能编码与病害表达有关的具有致病功能的因子，但其随病原细菌的不同表达有关的具有致病功能的因子，但其随病原细菌的不同而有差异，而有差异， hrp基因的基因的DNA序列在不同类型生物体之间的序列在不同类型生物体之间的相似性也说明了它们在系统发育中的高度保守性。相似性也说明了它们在系统发育中的高度保守性。 Hrp基因的表达和调控基因的表达和调控环境诱导和抑制信号环境诱导和抑制信号植物成分的诱导植物成分的诱导调节基因调节基因 Hrp基因产物及其功能基因产物及其功

80、能Hrp基因是一类基因产物未知的基因，已报道的产基因是一类基因产物未知的基因，已报道的产物多是根据物多是根据Hrp基因的基因的DNA序列分析推测出来的。序列分析推测出来的。 1992年韦忠民等首先从年韦忠民等首先从E.amylovora中分离出一个激中分离出一个激发过敏反应的蛋白，定名为发过敏反应的蛋白，定名为HarpinEa由由Hrp基因编码。基因编码。该蛋白为细菌外膜相关蛋白，富含该蛋白为细菌外膜相关蛋白，富含Gly ，热稳定，对蛋，热稳定，对蛋白酶敏感，不具泌出蛋白特性。白酶敏感，不具泌出蛋白特性。功能功能：（1）调节蛋白的功能；（）调节蛋白的功能；（2）跨膜蛋白泌出功）跨膜蛋白泌出功能

81、；（能；（3）编码无毒基因功能；（）编码无毒基因功能；（4）调节无毒基因表）调节无毒基因表达功能；（达功能；（5）信号识别功能。）信号识别功能。2.4.6 dsp 基因基因只影响寄主植物的侵染能力，而不影响在非寄主植物上只影响寄主植物的侵染能力，而不影响在非寄主植物上诱导过敏反应能力的基因称为诱导过敏反应能力的基因称为dsp 基因。它们与病菌的侵袭基因。它们与病菌的侵袭力和代谢能力有关。一般认为，力和代谢能力有关。一般认为， dsp 基因在其基因组中是基因在其基因组中是分散排列的，而在质粒上是成簇排列的。分散排列的，而在质粒上是成簇排列的。2.4.7 外泌基因外泌基因2.4.8 致病性调控基因

82、致病性调控基因是指那些不直接编码致病因子但对致病因子产生的总体是指那些不直接编码致病因子但对致病因子产生的总体水平发生影响的基因。如水平发生影响的基因。如 global regulatory gene和和phenotype conversion ,PC。2.4.9 编码未知产物的基因编码未知产物的基因3 3 质粒及其在致病中的作用质粒及其在致病中的作用3.1 质粒的特征及分离质粒的特征及分离3.2 质粒在决定致病性或毒性中的作用质粒在决定致病性或毒性中的作用 植物病原细菌决定致病性或毒性的基因可以在植物病原细菌决定致病性或毒性的基因可以在染色体上，也可以在质粒上。质粒基因可包括无毒染色体上，也

83、可以在质粒上。质粒基因可包括无毒基因、基因、hrp基因以及编码毒素和植物生长素的基因。基因以及编码毒素和植物生长素的基因。3.3 质粒编码的非致病特性质粒编码的非致病特性3.3.1 生态适应和进化作用生态适应和进化作用质粒的存在使植物病原菌对环境产生适应能力。质粒的存在使植物病原菌对环境产生适应能力。一方面是质粒在群体中的转移，使许多可利用的基因一方面是质粒在群体中的转移，使许多可利用的基因得以传播和扩散，同时提高了细菌群体得以传播和扩散，同时提高了细菌群体DNA复制的效复制的效果。另一方面，质粒编码的性状如产生细菌素和营养果。另一方面，质粒编码的性状如产生细菌素和营养能力，增加了细菌在新环境

84、中的适应和与其他细菌竞能力，增加了细菌在新环境中的适应和与其他细菌竞争的能力，对抗生素、重金属和紫外线辐射的抗性增争的能力，对抗生素、重金属和紫外线辐射的抗性增加了细菌在不良环境中存活的机会。加了细菌在不良环境中存活的机会。 质粒基因的复杂性是细菌生长进化的产物。质粒基因的复杂性是细菌生长进化的产物。3.3.2 细菌素（细菌素（bactrocin）的产生）的产生自自1946年年Fredericq报道大肠杆菌素（报道大肠杆菌素（colocin）后，）后，至今已报道了至今已报道了100多种细菌素。多种细菌素。 澳大利亚学者澳大利亚学者Kerr(1972)分离到一株能产农杆菌素分离到一株能产农杆菌素

85、84（Agrocin 84）的放射土壤杆菌菌株）的放射土壤杆菌菌株84，该菌株发酵，该菌株发酵后产生的后产生的A84对苹果属对苹果属 、梨属、山楂属和蔷薇属等许多、梨属、山楂属和蔷薇属等许多属植物的根癌并具有较强防治作用，目前该技术已在澳属植物的根癌并具有较强防治作用，目前该技术已在澳大利亚、美国、加拿大、英国、意大利和希腊等国家实大利亚、美国、加拿大、英国、意大利和希腊等国家实现商品化生产而应用于大田防治。现商品化生产而应用于大田防治。3.3.3 用重组质粒向病原细菌导入新的基因用重组质粒向病原细菌导入新的基因将从费氏弧菌（将从费氏弧菌（Vibrio fischeri）分离的荧光素基因）分离

86、的荧光素基因导入植物病原细菌后可使这些细菌的细胞形成生物荧光，导入植物病原细菌后可使这些细菌的细胞形成生物荧光，因此可以利用它们的发光性来监测其在植物和环境中的因此可以利用它们的发光性来监测其在植物和环境中的分布和存活。分布和存活。 目前已由实验室把含有目前已由实验室把含有Bt杀虫蛋白基因的重组克杀虫蛋白基因的重组克隆导入生防菌构建成病虫兼治的生防制剂。隆导入生防菌构建成病虫兼治的生防制剂。双组分调控系统是生物中普遍存在的和相当保守的双组分调控系统是生物中普遍存在的和相当保守的一种重要调控机制。细菌细胞在环境变化是通过这种调一种重要调控机制。细菌细胞在环境变化是通过这种调控系统直接或间接地感受

87、和传递信号，调节机体内有关控系统直接或间接地感受和传递信号，调节机体内有关基因的表达或有关蛋白的活性，从而对环境的变化作出基因的表达或有关蛋白的活性，从而对环境的变化作出反应，使细胞能适应环境的变化。反应，使细胞能适应环境的变化。 基于对蛋白质基于对蛋白质AA序列的同源性比较，已经发现近序列的同源性比较，已经发现近30个双组分调控系统。个双组分调控系统。4 4 植物病原细菌致病基因的调控机制植物病原细菌致病基因的调控机制4.1 双组分系统的基本组成和调节控制双组分系统的基本组成和调节控制组成组成典型的双组分调控系统有感受蛋白（典型的双组分调控系统有感受蛋白（sensor,modulator,t

88、ranmitter）和调节蛋白（）和调节蛋白（regulator,effector,receiver）组成。分别由两个不同的基因编码。所有双组分）组成。分别由两个不同的基因编码。所有双组分调控系统的感受蛋白和调节蛋白在调控系统的感受蛋白和调节蛋白在AA序列上具有高度的同序列上具有高度的同源性。源性。感受蛋白：感受蛋白：C末端末端250个个AA序列具有明显的同源性，在这一区域中，有序列具有明显的同源性，在这一区域中，有5个小区表现高度的保守性；个小区表现高度的保守性；N末端虽然不具同源性，但是均有末端虽然不具同源性，但是均有2个疏水区。个疏水区。调节蛋白：调节蛋白：N末端末端120个个AA序列是

89、高度保守的，一些调节蛋白的序列是高度保守的，一些调节蛋白的C末端区末端区也具有同源性。根据其同源性，可将目前已发现的调节蛋白分成也具有同源性。根据其同源性，可将目前已发现的调节蛋白分成5类，其类，其中中3类类C末端具有一定的保守性；一类无保守性；另一类其分子量较小，末端具有一定的保守性；一类无保守性；另一类其分子量较小，近又保守的近又保守的C末端区域组成。末端区域组成。调控机制调控机制 感受蛋白通过感受蛋白通过N末端感受信号。然后保守的末端感受信号。然后保守的C末末端与调节蛋白的保守端与调节蛋白的保守N末端互相作用，将信号传递给调节蛋白。这种信末端互相作用，将信号传递给调节蛋白。这种信号的传递

90、是通过磷酸化或去磷酸化作用实现的。在不少双组分调控系统号的传递是通过磷酸化或去磷酸化作用实现的。在不少双组分调控系统中，已经证实感受蛋白是磷酸化激酶，其活性区正是中，已经证实感受蛋白是磷酸化激酶，其活性区正是C末端的保守区。末端的保守区。在这一区域中，有一个完全保守的在这一区域中，有一个完全保守的His蛋白激酶，是感受蛋白自身磷酸化蛋白激酶，是感受蛋白自身磷酸化位点。感受蛋白在接受环境信号后，能将磷酸基团转移到调节蛋白上，位点。感受蛋白在接受环境信号后，能将磷酸基团转移到调节蛋白上，使调节蛋白磷酸化，被磷酸化的调节蛋白即具有了调节其他相关基因表使调节蛋白磷酸化，被磷酸化的调节蛋白即具有了调节其

91、他相关基因表达的活性。有的感受蛋白还具有磷蛋白磷酸酶的活性，可以通过去磷酸达的活性。有的感受蛋白还具有磷蛋白磷酸酶的活性，可以通过去磷酸化作用是被磷酸化的调节蛋白失去活性。化作用是被磷酸化的调节蛋白失去活性。输入信号输入信号感受蛋白感受蛋白调节蛋白调节蛋白NCCNP输出信号输出信号HP4.2 土壤农杆菌毒性基因的调控土壤农杆菌毒性基因的调控植物释放的信号物质植物释放的信号物质糖糖ChvE酚类酚类膜外周质膜外周质细胞质细胞质PACGBDEVirG 无活性无活性受体受体有活性有活性VirA跨膜蛋白跨膜蛋白1跨膜蛋白跨膜蛋白25 5 植物病原细菌的致病岛（毒力岛）植物病原细菌的致病岛（毒力岛）5.1

92、 概念概念毒力岛（毒力岛（Pathogenicity island, PAI）是指细菌）是指细菌染色体上一段具有典型结构特点的基因簇，主要编码与染色体上一段具有典型结构特点的基因簇，主要编码与细菌毒力及代谢等功能相关的产物。细菌毒力及代谢等功能相关的产物。 毒力岛最早是用来描述泌尿道致病大肠杆菌毒力岛最早是用来描述泌尿道致病大肠杆菌（Ueropathogenic E.coli, UPEC）染色体上两个分子量）染色体上两个分子量很大，编码许多毒力相关基因的，不稳定的外源很大，编码许多毒力相关基因的，不稳定的外源DNA片段（片段（Hacker J,1997）。随着研究的不断深入，现已）。随着研究的

93、不断深入，现已在动植物病原细菌中发现了在动植物病原细菌中发现了30多个毒力岛。多个毒力岛。 5.2 5.2 毒力岛的结构特点与功能毒力岛的结构特点与功能（1）存在于病染菌软色体上，）存在于病染菌软色体上，编码毒力相关基因簇的一个分编码毒力相关基因簇的一个分子量较大的子量较大的DNA片段。片段。（2）两端具有）两端具有RS和和IS。（3）位于染色体的）位于染色体的tRNA位点位点内或附近，或者与质粒、噬菌内或附近，或者与质粒、噬菌体整合有关的位点。体整合有关的位点。（4）其）其G-C含量、密码使用与含量、密码使用与宿主染色体具有明显的差异。宿主染色体具有明显的差异。（5）不稳定并含有一些潜在的）

94、不稳定并含有一些潜在的可移动成分。可移动成分。（6）编码的产物多为分泌性蛋）编码的产物多为分泌性蛋白和细胞表面蛋白。白和细胞表面蛋白。第四节第四节 植物病原真菌的致病相关基因植物病原真菌的致病相关基因1 1 病原真菌基因克隆的策略和研究方法病原真菌基因克隆的策略和研究方法1.1 1.1 差异杂交法差异杂交法 分离两个菌株的分离两个菌株的mRNA群体，并用其中的一个转录成群体，并用其中的一个转录成cDNA，然后互相杂交，分离出没有被杂交的特异性，然后互相杂交，分离出没有被杂交的特异性mRNA，再将此，再将此mRNA转录成转录成cDNA构建探针，从基因组文库中钓构建探针，从基因组文库中钓取目的基因

95、克隆。取目的基因克隆。 该方法已被成功地用于克隆巢曲霉（该方法已被成功地用于克隆巢曲霉（Aspergillus nidulans）的发）的发育调节基因。育调节基因。1.2 1.2 功能互补法功能互补法 以野生型菌株基因文库为供体，缺失某种性状的突以野生型菌株基因文库为供体，缺失某种性状的突变体为受体。突变体是已知目的基因所编码性状发生明变体为受体。突变体是已知目的基因所编码性状发生明显改变如致病性丧失和与致病性有关的致病生化因子的显改变如致病性丧失和与致病性有关的致病生化因子的缺失。因此，用野生型菌株的基因文库向突变体转化可缺失。因此，用野生型菌株的基因文库向突变体转化可以筛选能使突变体性状发

96、生恢复的基因克隆，获得克隆以筛选能使突变体性状发生恢复的基因克隆，获得克隆即含有能互补突变体功能的片段。即含有能互补突变体功能的片段。 该方法已成功用于筛选玉米小斑病菌该方法已成功用于筛选玉米小斑病菌( (Cochliobolus heterostrophus) )交配型基因、玉米瘤黑粉病菌交配型基因、玉米瘤黑粉病菌( (Ustilago maydis) )的的b b位点和豌豆根腐病菌（位点和豌豆根腐病菌（Nectria haematococca）pda基因。基因。1.3 1.3 根据蛋白质克隆基因法根据蛋白质克隆基因法 从纯化的蛋白质氨基酸序列推测基因序列合成探针，从纯化的蛋白质氨基酸序列推

97、测基因序列合成探针，标记后从基因文库中或标记后从基因文库中或cDNA文库中钓取有关基因。文库中钓取有关基因。 从黑曲霉（从黑曲霉（Aspergillus niger）克隆果胶裂解酶基）克隆果胶裂解酶基因因D和从番茄叶霉病菌和从番茄叶霉病菌( (Cladosporium fulvum) )克隆无毒克隆无毒基因基因avr9就是利用这一方法。就是利用这一方法。1.4 1.4 染色体步查（染色体步查（chromosome walking）法）法 用与目的基因紧密连锁的用与目的基因紧密连锁的RFLP标记为探针，从基标记为探针，从基因文库中鉴定出同源片段，再以此片段克隆为探针鉴定因文库中鉴定出同源片段，再

98、以此片段克隆为探针鉴定出编码目的基因的基因组重叠区，将这些克隆在进行出编码目的基因的基因组重叠区，将这些克隆在进行RFLP分析，从而得到新的分析，从而得到新的RFLP，因为真菌基因组较，因为真菌基因组较大，必须一步一步反复巡查，使克隆的功能片段逐步缩大，必须一步一步反复巡查，使克隆的功能片段逐步缩短，才能最终获得必需的目的基因。短，才能最终获得必需的目的基因。 该方法已用于克隆鉴定控制小种品种转化性的该方法已用于克隆鉴定控制小种品种转化性的基因即无毒基因，如莴苣霜霉病菌基因即无毒基因，如莴苣霜霉病菌（Bremia lactucae）、）、稻瘟病菌稻瘟病菌（Magraparthe grisea）

99、。）。2 2 病原真菌致病过程的相关基因病原真菌致病过程的相关基因2.1 参与真菌发育调节的基因参与真菌发育调节的基因游动孢子侵染寄主的发育调节基因游动孢子侵染寄主的发育调节基因鞭毛菌亚门的植物病原真菌的游动孢子是主要侵鞭毛菌亚门的植物病原真菌的游动孢子是主要侵染结构，主要从根的生长区、根毛发生区和根冠或伤染结构，主要从根的生长区、根毛发生区和根冠或伤口等处侵染。其侵入并不是随机发生的而是由根和游口等处侵染。其侵入并不是随机发生的而是由根和游动孢子表面特殊的诱导因子和受体介导的。动孢子表面特殊的诱导因子和受体介导的。分生孢子侵染寄主的发育调节基因分生孢子侵染寄主的发育调节基因植物病原真菌的分生

100、孢子一般在水中即可萌发，但植物病原真菌的分生孢子一般在水中即可萌发，但有时除环境条件外还受外源物质的影响。有时除环境条件外还受外源物质的影响。 噬菌体或有机酸等化学物质可影响孢子萌发和附着噬菌体或有机酸等化学物质可影响孢子萌发和附着胞的分化甚至组织侵染发生；胞的分化甚至组织侵染发生； 番茄叶霉病菌在抗感品种中都可以侵入，但在抗病番茄叶霉病菌在抗感品种中都可以侵入，但在抗病品种中菌丝在进入气孔后在气孔腔内就被抑制，不能在品种中菌丝在进入气孔后在气孔腔内就被抑制，不能在细胞内形成菌丝网络以及从气孔产生新的分生孢子；细胞内形成菌丝网络以及从气孔产生新的分生孢子； 分生孢子萌发后芽管和附着胞中黑色素的

101、沉积有利分生孢子萌发后芽管和附着胞中黑色素的沉积有利于增加结构强度，这对病菌侵染有时是必要的。于增加结构强度，这对病菌侵染有时是必要的。2.2 编码致病生化因子的基因编码致病生化因子的基因编码胞外酶基因编码胞外酶基因植物表面的角质层是阻碍病原真菌侵入的主要障植物表面的角质层是阻碍病原真菌侵入的主要障碍，所以在真菌入侵机制方面对角质酶的功能及其作碍，所以在真菌入侵机制方面对角质酶的功能及其作用机制研究较多。至少有用机制研究较多。至少有22种植物病原真菌已被证明种植物病原真菌已被证明产生角质酶。目前，对豌豆根腐病菌（产生角质酶。目前，对豌豆根腐病菌（Fusarium f. sp. pisi）的角质

102、酶致病作用分子机制进行了很深入的）的角质酶致病作用分子机制进行了很深入的研究。许多真菌还产生其他胞外酶如果胶酶、纤维素研究。许多真菌还产生其他胞外酶如果胶酶、纤维素酶等，但对这些酶基因的研究并不多。酶等，但对这些酶基因的研究并不多。编码毒素的基因编码毒素的基因 关于真菌致病毒素的产生及其作用分子机制主要在玉米小关于真菌致病毒素的产生及其作用分子机制主要在玉米小斑病菌产生的斑病菌产生的T毒素、燕麦根腐病菌产生的维多利亚毒素和毒素、燕麦根腐病菌产生的维多利亚毒素和交链孢产生的交链孢产生的AM、AK和和AT毒素等方面有较深入的研究。毒素等方面有较深入的研究。 T-毒素是一类聚乙醇酮化合物，其产生是由

103、病原菌染色体毒素是一类聚乙醇酮化合物，其产生是由病原菌染色体上单一显性遗传位点上单一显性遗传位点Toxl决定的。决定的。 1947年发现维多利亚长蠕孢产生的一种毒素称为年发现维多利亚长蠕孢产生的一种毒素称为victorin或或HV-毒素，由真菌中毒素，由真菌中Tox3控制。与控制。与HV毒素合成有关的酶毒素合成有关的酶和基因尚未鉴定出来。和基因尚未鉴定出来。 目前已知至少目前已知至少9种交链孢引起的病害与病原菌产生的寄主专种交链孢引起的病害与病原菌产生的寄主专化性毒素有关。化性毒素有关。由交链孢产生的寄主专化性毒素由交链孢产生的寄主专化性毒素编码植物保卫素降解酶的基因编码植物保卫素降解酶的基因

104、 豌豆素为一种异黄酮类化合物，是豌豆产生的一种豌豆素为一种异黄酮类化合物，是豌豆产生的一种主要植物保卫素。豌豆素在健康豌豆组织中不存在，但主要植物保卫素。豌豆素在健康豌豆组织中不存在，但受病原菌侵染后几天其积累量可大植物干重的受病原菌侵染后几天其积累量可大植物干重的5。豌豆。豌豆茄镰孢能使豌豆素脱甲基而降低其毒性，这被认为是病茄镰孢能使豌豆素脱甲基而降低其毒性，这被认为是病原菌侵入寄主的一种机制。强致病力菌株耐豌豆素而使原菌侵入寄主的一种机制。强致病力菌株耐豌豆素而使其脱甲基，而弱致病力菌株则对其敏感而无脱甲基功能。其脱甲基，而弱致病力菌株则对其敏感而无脱甲基功能。 豌豆素脱甲基酶的基因（豌豆

105、素脱甲基酶的基因（pda）已经克隆。）已经克隆。2.3 病原真菌的无毒基因（自学）病原真菌的无毒基因（自学）3 3 病原真菌低致病力的分子遗传基础病原真菌低致病力的分子遗传基础低致病力（低致病力（Hypovirulence）是由于细胞核遗传决定）是由于细胞核遗传决定因子或细胞质因子如病毒、类病毒的因子、质粒或线粒因子或细胞质因子如病毒、类病毒的因子、质粒或线粒体的作用使真菌致病力降低的现象。所有真菌类群都已体的作用使真菌致病力降低的现象。所有真菌类群都已报道由病毒或类似病毒的因子。除少数外，大部分真菌报道由病毒或类似病毒的因子。除少数外，大部分真菌病毒都是病毒都是dsRNA。自。自20世纪世纪

106、60年代发现真菌病毒以来，年代发现真菌病毒以来，由于病毒的侵染对真菌的表型特别是致病性的影响，引由于病毒的侵染对真菌的表型特别是致病性的影响，引起许多植物病理学家的关注，并希望应用于真菌病害的起许多植物病理学家的关注，并希望应用于真菌病害的生物防治。生物防治。3.1 真菌低致病力的发生真菌低致病力的发生3.2 真菌低致病力与真菌低致病力与dsRNA的分子生物学关系的分子生物学关系栗疫病菌（栗疫病菌（Endothia parasitica）的低致病力）的低致病力 研究表明，栗疫病菌低致病菌株中含有研究表明，栗疫病菌低致病菌株中含有dsRNA，生物防治时，生物防治时低致病力菌株中的低致病力菌株中的

107、dsRNA可以自然传递给正常植株。可以自然传递给正常植株。 低致病力植株低致病力植株dsRNA包含在细胞质膜液泡中，并与依赖包含在细胞质膜液泡中，并与依赖RNA聚合酶活性有关。序列分析表明，有些低致病力菌株中含有一个聚合酶活性有关。序列分析表明，有些低致病力菌株中含有一个大的大的dsRNA分子称为分子称为L-RNA。同时还有许多小的。同时还有许多小的dsRNA分子，它分子，它们被认为是由们被认为是由L-RNA内部缺失衍生而来的。内部缺失衍生而来的。R.Shapira(1990)从菌从菌株株EP713中分离和鉴定了中分离和鉴定了L-RNA的全核苷酸序列，其中的全核苷酸序列，其中12.7kb的的R

108、NA含有含有poly-A链，有链，有4个个ORF，并研究证明了，并研究证明了dsRNA与低致病与低致病力有关的直接证据。力有关的直接证据。 用与低致病力有关的病毒用与低致病力有关的病毒dsRNA的全长的全长cDNA转转化无化无dsRNA的毒性菌株，转化后经鉴定含有预期的的毒性菌株，转化后经鉴定含有预期的12.7kb的的dsRNA，因而使原来的毒性菌株变为低致病，因而使原来的毒性菌株变为低致病力菌株。同时还证明这种转化后低致病力菌株在数代力菌株。同时还证明这种转化后低致病力菌株在数代产孢后代中仍能维持产孢后代中仍能维持dsRNA的物理完整性和生物功能。的物理完整性和生物功能。这说明这说明cDNA

109、的传递以及与低致病力有关的的传递以及与低致病力有关的dsRNA可可以经分生孢子和子囊孢子稳定遗传。以经分生孢子和子囊孢子稳定遗传。12.7kb的的dsRNA有有5个不同的结构域与马铃薯病毒组多聚蛋白中的保个不同的结构域与马铃薯病毒组多聚蛋白中的保守区域相似，如与守区域相似，如与RNA聚合酶、蜗牛酶和蛋白酶有明聚合酶、蜗牛酶和蛋白酶有明显的同源序列。显的同源序列。3.3 真菌低致病力的生化特征真菌低致病力的生化特征 栗疫病菌含有栗疫病菌含有dsRNA的低致病力菌株的菌落形的低致病力菌株的菌落形态有所改变，与无态有所改变，与无dsRNA的菌株相比，低毒力菌株的菌株相比，低毒力菌株色素减少；产生分生

110、孢子、氧化酶和虫漆酶，而且色素减少；产生分生孢子、氧化酶和虫漆酶，而且还抑制至少还抑制至少9种真菌种真菌poly(A)RNA和多肽的合成。和多肽的合成。 研究表明，许多真菌都含有虫漆酶活性，它与研究表明，许多真菌都含有虫漆酶活性，它与木质素降解、致病性、产孢和色素形成都有关系。木质素降解、致病性、产孢和色素形成都有关系。dsRNA介导的低致病力菌株的虫漆酶的酚氧化活性介导的低致病力菌株的虫漆酶的酚氧化活性明显降低。明显降低。4 4 植物病原真菌致病基因的调控机制植物病原真菌致病基因的调控机制真菌致病基因的调控机制多数尚不清楚。目前对真菌致病基因的调控机制多数尚不清楚。目前对玉米瘤黑粉病菌（玉米

111、瘤黑粉病菌（U. maydis）交配型的分子遗传学研）交配型的分子遗传学研究比较充分。究比较充分。 研究表明。玉米瘤黑粉病菌交配反映和交配后生研究表明。玉米瘤黑粉病菌交配反映和交配后生长发育受交配型长发育受交配型a和和b 两个位点控制。两个位点控制。B位点控制有性位点控制有性阶段和致病性的发生，因此是一个主要的致病基因。阶段和致病性的发生，因此是一个主要的致病基因。现已证明，现已证明，b位点中有两个等位基因所编码的两个多肽位点中有两个等位基因所编码的两个多肽分子互作控制性器官的发育在该种真菌中作为识别自分子互作控制性器官的发育在该种真菌中作为识别自我和非自我的双组分调控系统。我和非自我的双组分

112、调控系统。第二章第二章 寄主植物的抗病基因寄主植物的抗病基因第一节第一节 基础知识与基本概念基础知识与基本概念 植物抗病表型：植物抗病表型：植物与抗病有关的形态、结构与生理植物与抗病有关的形态、结构与生理生化特征。生化特征。 垂直抗性（垂直抗性（vertical resisitance）：）：由单基因作用，对由单基因作用，对病原物某些小种具有较高的抗性而对其它小种不具抗性。病原物某些小种具有较高的抗性而对其它小种不具抗性。 水平抗性（水平抗性（horizontal resistance）：）：由多基因作用，由多基因作用，对病原物小种均具有一定程度的抗性。对病原物小种均具有一定程度的抗性。 非寄

113、主抗性（非寄主抗性（non-host resistance,NHR）：）：植物对非植物对非自身病原物的抗性。自身病原物的抗性。 过敏性反应（过敏性反应（HR）：）：植物在病原菌侵染的同时产生植物在病原菌侵染的同时产生一系列防御反应如程序性细胞死亡、抗微生物代谢物一系列防御反应如程序性细胞死亡、抗微生物代谢物（如植保素）的合成、对病原有害物（如几丁质酶、葡（如植保素）的合成、对病原有害物（如几丁质酶、葡聚糖酶）的合成以及感染区域植物细胞壁的强化。聚糖酶）的合成以及感染区域植物细胞壁的强化。 系统获得性抗性（系统获得性抗性（SAR）：）：特定的植物自我保护信号特定的植物自我保护信号传递过程，主要特

114、点是坏死斑的形成，继而产生广谱而传递过程，主要特点是坏死斑的形成，继而产生广谱而系统的抗性，其区别于其他抗性反应的标志是对病原的系统的抗性，其区别于其他抗性反应的标志是对病原的广谱抗性和相关基因表达的变化。广谱抗性和相关基因表达的变化。 抗病基因：抗病基因：其直接产物或间接产物与相应的无毒基其直接产物或间接产物与相应的无毒基因的直接或间接产物相互识别，从而诱导防卫基因的迅因的直接或间接产物相互识别，从而诱导防卫基因的迅速表达。速表达。 防卫基因：防卫基因：非亲和病原侵染植株后，其无毒基因产非亲和病原侵染植株后，其无毒基因产物与寄主相对应的抗病基因产物发生识别，会诱导一些物与寄主相对应的抗病基因

115、产物发生识别，会诱导一些新的基因表达，这些所表达的基因即是防卫基因。新的基因表达，这些所表达的基因即是防卫基因。 抗病基因与防卫基因是两个完全不同的概念，防卫抗病基因与防卫基因是两个完全不同的概念，防卫基因是直接作用于病原菌，限制病原菌增殖；而抗性基基因是直接作用于病原菌，限制病原菌增殖；而抗性基因的产物是直接或间接作用于无毒基因，将识别信号传因的产物是直接或间接作用于无毒基因，将识别信号传给防卫基因，进而诱导防卫基因的迅速表达。二者的作给防卫基因，进而诱导防卫基因的迅速表达。二者的作用和先后表达顺序不同。用和先后表达顺序不同。与病原物亲和性因子有关的抗病性与病原物亲和性因子有关的抗病性病原物

116、亲和性因子指寄主病原物亲和性互作中，寄主病原物亲和性因子指寄主病原物亲和性互作中，寄主植物表现敏感的病原物致病因子如毒素、胞壁降解酶等。阻植物表现敏感的病原物致病因子如毒素、胞壁降解酶等。阻止亲和性因子作用的抗病性表现，如对毒素的减毒作用或对止亲和性因子作用的抗病性表现，如对毒素的减毒作用或对胞外酶抑制作用，在遗传上是稳定的，因为要克服它需要获胞外酶抑制作用，在遗传上是稳定的，因为要克服它需要获得一种新的亲和性因子。得一种新的亲和性因子。 说明植物对亲和性因子抗性机制的最好例子是玉米圆斑病菌说明植物对亲和性因子抗性机制的最好例子是玉米圆斑病菌（Cochliobolus carbonum），），

117、该菌小种该菌小种产生的产生的HCHC毒素是一种环状毒素是一种环状多肽（亲和性因子），只对小种多肽（亲和性因子），只对小种敏感的玉米基因型起作用。玉米小种敏感的玉米基因型起作用。玉米小种抗性受两个核基因抗性受两个核基因HM1和和HM2调控，调控，HM1在在1号染色体上，号染色体上，HM2在在2号染色体上。号染色体上。HM1提供在全生育期及全株抗性，提供在全生育期及全株抗性，HM2则为半显性，幼苗则为半显性，幼苗是感病的，随植物成熟度增加而增强抗性表达。分子克隆及抗性表达研是感病的，随植物成熟度增加而增强抗性表达。分子克隆及抗性表达研究表明，究表明，HM1编码编码HC-毒素还原酶（毒素还原酶（HC

118、TR），钝化毒素分子中的羰基。），钝化毒素分子中的羰基。 目前对其它类型目前对其它类型 病原物亲和性因子如胞壁降解酶的研究尚未导病原物亲和性因子如胞壁降解酶的研究尚未导致有关酶抑制剂的分子克隆。致有关酶抑制剂的分子克隆。与病原物不亲和性因子有关的抗病性与病原物不亲和性因子有关的抗病性 与病原物不亲和性因子有关的抗性主要表现在与病原物不亲和性因子有关的抗性主要表现在gene for gene互作中。涉及到病原物无毒基因产物或次级代谢产物互作中。涉及到病原物无毒基因产物或次级代谢产物激发子与寄主受体的特异性结合，从而导致寄主防卫激发子与寄主受体的特异性结合，从而导致寄主防卫基因的表达。病原无毒基因

119、产物被认为是寄主抗病基因产基因的表达。病原无毒基因产物被认为是寄主抗病基因产物所识别的抗原决定簇。无毒基因对病原菌的生存是不利物所识别的抗原决定簇。无毒基因对病原菌的生存是不利的，它之所以被保留下来是因为相应抗病基因出现的频率的，它之所以被保留下来是因为相应抗病基因出现的频率低和在不带抗病基因的品种上占优势。低和在不带抗病基因的品种上占优势。 病原物无毒基因的产物，由于能与寄主植物抗病基因病原物无毒基因的产物，由于能与寄主植物抗病基因产物互作，进而激发寄主的防卫反应，所以又称激发子。产物互作，进而激发寄主的防卫反应，所以又称激发子。它可以是无毒基因的直接产物也可以是间接产物，在后一它可以是无毒

120、基因的直接产物也可以是间接产物，在后一种情况下，可能包括对植物正常组分的转化。种情况下，可能包括对植物正常组分的转化。普通激发子是指一种病原菌所有成员产生的，能激发一种普通激发子是指一种病原菌所有成员产生的，能激发一种植物所有基因型产生防卫反应的物质。常常是微生物细胞的结植物所有基因型产生防卫反应的物质。常常是微生物细胞的结构成分，一般在非寄主抗性中也起作用，包括寡多糖、多糖和构成分，一般在非寄主抗性中也起作用，包括寡多糖、多糖和蛋白质及糖蛋白。其中有些是由侵入真菌的牙管结构中释放出蛋白质及糖蛋白。其中有些是由侵入真菌的牙管结构中释放出来的。来的。 小种专化性激发子是指表达一定无毒基因的病菌小

121、种产生小种专化性激发子是指表达一定无毒基因的病菌小种产生的，仅能激发那些互补抗病基因的植物品种产生防卫反应的激的，仅能激发那些互补抗病基因的植物品种产生防卫反应的激发子。发子。 上述激发子应与非特异性激发子相区别。非特异性激上述激发子应与非特异性激发子相区别。非特异性激发子如真菌或植物细胞壁碎片能引起如植保素的合成而降低植发子如真菌或植物细胞壁碎片能引起如植保素的合成而降低植物的病害反应，但这些激发子与源于无毒基因的激发子有本质物的病害反应，但这些激发子与源于无毒基因的激发子有本质区别，无毒基因激发子可激发区别，无毒基因激发子可激发R R基因介导的植物抗病性反应。基因介导的植物抗病性反应。第二

122、节第二节 植物抗病基因的克隆策略与方法植物抗病基因的克隆策略与方法 克隆基因的途径分为克隆基因的途径分为2种种正向遗传学和反向遗传学正向遗传学和反向遗传学途径。前者是依据目标基因所表现的功能为基础，通过鉴途径。前者是依据目标基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型突变而进行；反向遗传学则着眼于基定其产物或某种表型突变而进行；反向遗传学则着眼于基因本身，通过特定的序列或其在基因组中的位置进行。然因本身，通过特定的序列或其在基因组中的位置进行。然而，由于人们对而，由于人们对R基因产物及其表达调控机制、特性知之甚基因产物及其表达调控机制、特性知之甚少，加之抗病突变体也难以确定或创造等原因，目

123、前用此少，加之抗病突变体也难以确定或创造等原因，目前用此方法来克隆抗病基因尚属起步阶段。在植物抗病基因的克方法来克隆抗病基因尚属起步阶段。在植物抗病基因的克隆工作中，定位克隆或图谱克隆隆工作中，定位克隆或图谱克隆(positionalcloning，map-based cloning)和转座子标记技术和转座子标记技术(transposontagging)2种方种方法都得到了成功的应用。法都得到了成功的应用。1 功能克隆功能克隆 功能克隆即已知基因编码产物的克隆方法。当目的基因序列未知，但其编码功能克隆即已知基因编码产物的克隆方法。当目的基因序列未知，但其编码产物的生理生化及代谢途径研究得比较清

124、楚时就可以采用这种克隆方法。产物的生理生化及代谢途径研究得比较清楚时就可以采用这种克隆方法。 根据克隆基因的原理又可分为两条路线，一条是分离纯化已知的蛋白质或多根据克隆基因的原理又可分为两条路线，一条是分离纯化已知的蛋白质或多肽，制备该蛋白的特异抗体，利用标记的特异蛋白抗体作为探针筛选由表达型载肽，制备该蛋白的特异抗体，利用标记的特异蛋白抗体作为探针筛选由表达型载体建立的基因组文库或者体建立的基因组文库或者cDNA文库，通过免疫杂交筛选到重组克隆，并最终克隆文库，通过免疫杂交筛选到重组克隆，并最终克隆目的基因；第二条路线是将蛋白质纯化后测定其目的基因；第二条路线是将蛋白质纯化后测定其N端一段端

125、一段AA序列，根据蛋白质密序列，根据蛋白质密码子编码规律和密码子偏爱原则，反向推算出码子编码规律和密码子偏爱原则，反向推算出mRNA序列，然后人工合成一段寡序列，然后人工合成一段寡核苷酸作探针，利用同位素或其它方法标记后筛选一般的基因组文库或核苷酸作探针，利用同位素或其它方法标记后筛选一般的基因组文库或cDNA文库，文库，筛选阳性重组克隆，并最终克隆目的基因。筛选阳性重组克隆，并最终克隆目的基因。 除此之外除此之外,也可以用也可以用RT-PCR扩增法扩增法,即根据已知的氨基酸序列，人工合成简并即根据已知的氨基酸序列，人工合成简并的寡聚核苷酸上游引物，下游引物为的寡聚核苷酸上游引物，下游引物为O

126、ligo(dT)，以反转录，以反转录cDNA的的第一条链作的的第一条链作为模板进行为模板进行PCR扩增，扩增的片段连入合适的载体，进而酶切或序列分析、鉴定扩增，扩增的片段连入合适的载体，进而酶切或序列分析、鉴定重组子、测序，从而得到目的基因片段。重组子、测序，从而得到目的基因片段。2 定位克隆定位克隆 定位克隆技术是根据目标基因在染色体上的位置进定位克隆技术是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，目标基因精确定位在染色体特行基因克隆的一种方法，目标基因精确定位在染色体特定位置之后，用目标基因两侧紧密连锁的标记筛选含有定位置之后，用目标基因两侧紧密连锁的标记筛选含有大的插入片段的基

127、因组文库大的插入片段的基因组文库(如如BAC和和YAC)，通过染色，通过染色体步行筛选到含有目标基因的克隆，最后通过遗传转化体步行筛选到含有目标基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。其核心任务是染色体步行，和功能互补实验进行验证。其核心任务是染色体步行，如果能找到与目标基因很近的标记，以至于二者之间的如果能找到与目标基因很近的标记，以至于二者之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小,就可以就可以直接筛选到含有目标基因的克隆直接筛选到含有目标基因的克隆,最终得到候选基因，最最终得到候选基因，最后通过遗传转化和功能互补试验进行验证，这

128、种策略称后通过遗传转化和功能互补试验进行验证，这种策略称为染色体登陆（为染色体登陆（Chromosome landing）。）。 定位克隆技术依赖于高密度的分子标记图谱；另一定位克隆技术依赖于高密度的分子标记图谱；另一个关键是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记；此外，个关键是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记；此外，高质量的基因组文库也是成功的关键。继高质量的基因组文库也是成功的关键。继YAC文库之后文库之后,又相继出现了又相继出现了BAC、TAC、PAC等。在寻找到与目标基等。在寻找到与目标基因连锁的分子标记之后因连锁的分子标记之后,下一步就是通过跨叠文库克隆向下一步就是通过跨叠文库克隆向目标基

129、因进行染色体步行目标基因进行染色体步行,但染色体步行在大多数具有复但染色体步行在大多数具有复杂基因组的高等植物中很难较好地应用。杂基因组的高等植物中很难较好地应用。 目前利用这种方法已克隆出目前利用这种方法已克隆出1616种种R R基因，占已克隆基因，占已克隆R R基因的基因的73%73%。人们克隆到的第一个符合经典基因对基因关系的番茄基因。人们克隆到的第一个符合经典基因对基因关系的番茄基因Pto Pto 和第一个从单子叶植物中克隆到的水稻和第一个从单子叶植物中克隆到的水稻R R基因基因Xa21Xa21都是利用定位都是利用定位克隆法获得的。但是对于基因组较大克隆法获得的。但是对于基因组较大,

130、,重复序列较多的一些植物重复序列较多的一些植物, ,采采用该方法分离克隆抗病基因不仅投资大而且效率低用该方法分离克隆抗病基因不仅投资大而且效率低, ,因此因此, ,该方法也该方法也受到一定的限制。受到一定的限制。3 序列克隆序列克隆 序列克隆即已知所克隆基因序列或同源基因的序列时采序列克隆即已知所克隆基因序列或同源基因的序列时采用的方法。这种情况下用的方法。这种情况下,可以从可以从DNA序列数据库序列数据库(如如GenBank数据库数据库)中查找有关基因的序列，然后可以设计并合成一对寡中查找有关基因的序列，然后可以设计并合成一对寡核苷酸引物，提取所要分离基因的植物染色体核苷酸引物，提取所要分离

131、基因的植物染色体DNA或者用或者用RNA在逆转录酶的作用下合成在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，以此为模的第一条链，以此为模板，采取板，采取PCR或或RTPCR的方法来克隆基因。扩增的片段的方法来克隆基因。扩增的片段经纯化后，连接到合适的载体上，经酶切和序列分析并与已经纯化后，连接到合适的载体上，经酶切和序列分析并与已知的基因序列作比较。知的基因序列作比较。 该方法简便快速，国内利用此方法已经克隆了豌豆外源该方法简便快速，国内利用此方法已经克隆了豌豆外源凝集素基因。凝集素基因。4 表型克隆表型克隆 表型克隆是与定位克隆相对的一种克隆基因的策略，它是对因突变而导表型克隆是与定位克隆相对的

132、一种克隆基因的策略，它是对因突变而导致的某一特殊表型的目的基因直接进行克隆，因而不必事先知道其生化功能致的某一特殊表型的目的基因直接进行克隆，因而不必事先知道其生化功能及在染色体上的精确位置，也不需知道假设基因的数目或其作用方式，将表及在染色体上的精确位置，也不需知道假设基因的数目或其作用方式，将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来从而分离特定表型相关基因。表型型与基因结构或基因表达的特征联系起来从而分离特定表型相关基因。表型克隆与定位克隆相比，省去了用大量遗传标记进行定位分析的繁琐程序，可克隆与定位克隆相比，省去了用大量遗传标记进行定位分析的繁琐程序，可较容易地检测基因组之间差异或相同区域

133、，大大加快基因克隆的速度。较容易地检测基因组之间差异或相同区域，大大加快基因克隆的速度。 常见的表型克隆方法有：消减杂交常见的表型克隆方法有：消减杂交(Subtractive hybridization)、DNA转转染法染法(DNA Transfection)、代表性差异分析技术、代表性差异分析技术(Representational difference anlysis)、mRNA差异显示差异显示(mRNA Differential display)、抑制消减杂交法抑制消减杂交法(Suppression subtractive hybrization)、转座子标签技术、转座子标签技术(Tran

134、sposon tagging)等。但在植物抗病基因的克隆中，由于抗病突变体难以确定和创造等因素的等。但在植物抗病基因的克隆中，由于抗病突变体难以确定和创造等因素的存在，在一定程度上限制了这些方法的应用，其中应用较有价值的是转座子存在，在一定程度上限制了这些方法的应用，其中应用较有价值的是转座子标签技术、鸟枪克隆法和差异显示技术。标签技术、鸟枪克隆法和差异显示技术。4.1 转座子标签和转座子标签和T-DNA标签技术法标签技术法转座子标签技术是应用最为普遍的一种方法。它是利用转转座子标签技术是应用最为普遍的一种方法。它是利用转座子来克隆基因的技术，其显著特点是可以分离预先不清楚表座子来克隆基因的技

135、术，其显著特点是可以分离预先不清楚表达产物的基因。当转座子插入到植物基因组中某个基因或者基达产物的基因。当转座子插入到植物基因组中某个基因或者基因的邻近位点时，会破坏该基因的结构，引起基因突变使植物因的邻近位点时，会破坏该基因的结构，引起基因突变使植物表型发生变异，因此可以用转座子作为探针从被标记的突变体表型发生变异，因此可以用转座子作为探针从被标记的突变体植物的基因文库中，克隆出突变的基因，然后再利用突变基因植物的基因文库中，克隆出突变的基因，然后再利用突变基因作为探针从野生型植物中克隆出野生型基因。作为探针从野生型植物中克隆出野生型基因。 利用这种方法已克隆出利用这种方法已克隆出6种种R基

136、因基因,占已克隆占已克隆R基因的基因的27%。第一个。第一个R基因基因Hm1就是利用玉米转座子就是利用玉米转座子Mu标记得到的，但它不是标记得到的，但它不是Flor基因对基因系基因对基因系统中的统中的R基因。其余基因。其余5种种R基因中基因中,番茄番茄Cf9基因的克隆是利用玉米基因的克隆是利用玉米Ds转座子转座子进行的，烟草进行的，烟草N基因、亚麻基因、亚麻L6基因和基因和M基因等基因等3种种R基因是利用玉米基因是利用玉米Ac转座转座子标记克隆的，玉米子标记克隆的，玉米Rp-1D基因是利用玉米基因是利用玉米Mu和和Ds转座子标记克隆的。转座子标记克隆的。4.2 mRNA差式显示技术差式显示技术

137、（mRNA Differential Display） 绝大多数真核生物基因转录后加工成熟的绝大多数真核生物基因转录后加工成熟的mRNA 3- -端有一个端有一个Poly(A)的尾巴。的尾巴。DDRT-PCR正是利用这一特性，在反转录酶的作用下，正是利用这一特性，在反转录酶的作用下，用用3-端含有端含有Poly(A)的锚定引物对来自两种或两种以上对比材料的的锚定引物对来自两种或两种以上对比材料的mRNA进行反转录。在这个锚定引物中，与进行反转录。在这个锚定引物中，与Poly(A)紧密相连的碱基分别是紧密相连的碱基分别是C、G及及A，而四种碱基与这，而四种碱基与这3个碱基又有个碱基又有12种组合

138、种组合( (即形成两个碱基锚定的即形成两个碱基锚定的oligo-d引物引物, ,也即双碱基锚定引物也即双碱基锚定引物) )，这样就可以将某一时间某一组织提，这样就可以将某一时间某一组织提取出来的所有取出来的所有mRNAmRNA反转录形成的反转录形成的cDNA分成分成12个亚群。由于这些个亚群。由于这些cDNA中中代表某一特定细胞类型或发育阶段的代表某一特定细胞类型或发育阶段的mRNAmRNA的含量相当低的含量相当低, ,故需通过故需通过PCRPCR进进行扩增。在行扩增。在PCR的扩增过程中除锚定引物外的扩增过程中除锚定引物外, ,还需要能与还需要能与cDNA 5- -端进行端进行退火反应的随机

139、引物。这样退火反应的随机引物。这样, ,用一定数量的锚定引物与随机引物组成的引用一定数量的锚定引物与随机引物组成的引物对就可以使不同长度的基因片段得以扩增。扩增后可利用高分辨率的物对就可以使不同长度的基因片段得以扩增。扩增后可利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳, ,电泳后经电泳后经X X光曝光光曝光, ,可发现有差异的可发现有差异的mRNA片段，经片段，经Northern杂交确认后，回收差异片段，用相同的锚定引物杂交确认后，回收差异片段，用相同的锚定引物- -随机引物对分随机引物对分离的片段进行二次扩增离的片段进行二次扩增, ,再进行测序再进行测序, ,并作进一步的深入研究。并

140、作进一步的深入研究。原理原理优点优点省时省时 灵敏度高灵敏度高高效高效 重复性好重复性好缺点缺点假阳性率高假阳性率高获取的差异性片段较短获取的差异性片段较短以以3端端24个碱基为锚定引物。个碱基为锚定引物。 以以8的非变性的非变性PAEG为电泳介质。为电泳介质。 用荧光标记代替同位素标记用荧光标记代替同位素标记方方法法改改进进 DDRT-PCR DDRT-PCR不仅可用于分析细胞分化、细胞周期、生命周期、细不仅可用于分析细胞分化、细胞周期、生命周期、细胞激活与信号表达、突变、营养与环境胁迫过程中差异表达的基因胞激活与信号表达、突变、营养与环境胁迫过程中差异表达的基因, ,以及以及低丰度样品与活

141、体表达基因的分析低丰度样品与活体表达基因的分析, ,分析所得的差显条带还具有作为分子分析所得的差显条带还具有作为分子标记的潜力。目前标记的潜力。目前, ,除应用于人、动物除应用于人、动物( (如鼠、牛、羊、猪等如鼠、牛、羊、猪等) )、昆虫、昆虫( (如如蜜蜂等蜜蜂等) )、微生物、微生物( (如蓝藻类细菌如蓝藻类细菌) )等领域的分子遗传学研究以外等领域的分子遗传学研究以外, ,近年来近年来已普遍应用于植物界，如拟南芥、水稻、小麦、大麦、芦笋、豌豆、大已普遍应用于植物界，如拟南芥、水稻、小麦、大麦、芦笋、豌豆、大豆、玉米、棉花、蚕豆、烟草、红花、草莓、膨大矮牵牛、兰花、冰叶豆、玉米、棉花、蚕

142、豆、烟草、红花、草莓、膨大矮牵牛、兰花、冰叶日中花、红藜、苜蓿、花菸草、番茄、芸苔、大戟、鸢尾、甜菜、干蔗、日中花、红藜、苜蓿、花菸草、番茄、芸苔、大戟、鸢尾、甜菜、干蔗、波菜、向日葵、土豆、白羽扇豆、白玉草及豆科植物根瘤的形成等波菜、向日葵、土豆、白羽扇豆、白玉草及豆科植物根瘤的形成等, ,其中其中以农作物、草本植物应用差显进行研究的实例居多。木本植物中差显的以农作物、草本植物应用差显进行研究的实例居多。木本植物中差显的应用较少。应用较少。 目前该技术已被应用于分离与研究水稻的抗盐基因、草莓成熟基因、目前该技术已被应用于分离与研究水稻的抗盐基因、草莓成熟基因、水稻蔗糖调节基因、水稻赤霉病菌诱

143、导基因、小麦热激蛋白基因、水稻水稻蔗糖调节基因、水稻赤霉病菌诱导基因、小麦热激蛋白基因、水稻稻瘟病菌诱导基因等。从烟草中利用该方法分离到了由病源激发子稻瘟病菌诱导基因等。从烟草中利用该方法分离到了由病源激发子（elicitorelicitor）诱导的具有）诱导的具有LRRsLRRs的蛋白基因。该基因与的蛋白基因。该基因与Cf-2/ Cf-5Cf-2/ Cf-5家族的家族的基因有高度的同源性。研究表明，此基因可能与烟草非寄主抗病性有关。基因有高度的同源性。研究表明，此基因可能与烟草非寄主抗病性有关。应应 用用第三节第三节 植物抗病基因的鉴定植物抗病基因的鉴定 鉴定抗病基因是将所克隆的基因序列转化

144、到感病植鉴定抗病基因是将所克隆的基因序列转化到感病植物品种中，研究其能否是感病表型互不为抗病表型。在物品种中，研究其能否是感病表型互不为抗病表型。在肯定一个克隆能互补植物感病表型为抗病表型后，则可肯定一个克隆能互补植物感病表型为抗病表型后，则可以用常规标准的程序鉴定基因的编码序列和常规序列，以用常规标准的程序鉴定基因的编码序列和常规序列，再通过与突变序列进行互补进行基因细微结构分析。再通过与突变序列进行互补进行基因细微结构分析。 在对大量克隆逐个进行互补试验时应考虑以下问在对大量克隆逐个进行互补试验时应考虑以下问题题（1）被引入的）被引入的DNA序列要尽量大。（序列要尽量大。（2）由根癌土壤）

145、由根癌土壤杆菌介导、杆菌介导、Ti质粒为载体的转化，并不能转移所有的插质粒为载体的转化，并不能转移所有的插入入DNA片段。因此对于每个抗病基因克隆应该获得多种片段。因此对于每个抗病基因克隆应该获得多种转化子，以保证其互补分析有效。转化子，以保证其互补分析有效。第四节第四节 植物抗病基因的结构和功能植物抗病基因的结构和功能 自自1992年成功克隆出第一个抗病基因（玉米年成功克隆出第一个抗病基因（玉米Hm1基因）以来，基因）以来，人们先后从人们先后从9种不同植物中成功地克隆出了种不同植物中成功地克隆出了22种种R基因。这些基因。这些R基因虽来自基因虽来自不同物种不同物种,介导对不同病原体的抗性介导

146、对不同病原体的抗性,但其编码产物均具有下列但其编码产物均具有下列5种保守结种保守结构构:亮氨酸富集重复序列域亮氨酸富集重复序列域(Leucine-rich repeats，LRR)、丝氨酸苏氨酸、丝氨酸苏氨酸激酶激酶(Serine threonine kinase，STK)、核苷酸结合位点、核苷酸结合位点(Nucleotide binding site，NBS)、亮氨酸拉链、亮氨酸拉链(Leucine zippers,LZs)和和toll白细胞介白细胞介素素-1受体类似结构受体类似结构(toll/interleukin receptor simility ,TIR)。根据基因产。根据基因产物编

147、码的保守结构的不同物编码的保守结构的不同,可把可把R基因分为基因分为5类类:（)编码含编码含LRR和和NBS的的胞质内受体相关蛋白胞质内受体相关蛋白;（)编码编码STK;（)编码具有胞质外编码具有胞质外LRR区域的跨区域的跨膜受体蛋白膜受体蛋白;（)编码具胞外编码具胞外LRR区域和胞内区域和胞内STK的跨膜受体蛋白的跨膜受体蛋白;（)编码毒素还原酶。编码毒素还原酶。结结 构构部分抗病基因的结构特征及其分类部分抗病基因的结构特征及其分类亮氨酸富集重复序列亮氨酸富集重复序列（LRR）LRR是连续重复的富含是连续重复的富含Leu的一段核苷酸序列，一般每的一段核苷酸序列，一般每个重复序列有个重复序列有

148、24个个AA残基组成，并在某些位置上有规律地残基组成，并在某些位置上有规律地含有含有Leu或其它疏水氨基酸。或其它疏水氨基酸。 研究表明，研究表明，LRR与蛋白质间相互识别有关。与蛋白质间相互识别有关。Bent，et al(1996)认为认为R基因产物中的基因产物中的LRR是病毒无毒基因产物的结是病毒无毒基因产物的结合区域，与植物抗病反应的识别有关。然而，某些合区域，与植物抗病反应的识别有关。然而，某些R蛋白的蛋白的LRR区域较大，若其以结合对应于无毒基因产物为唯一功区域较大，若其以结合对应于无毒基因产物为唯一功能则显得过大，因此有人推测，能则显得过大，因此有人推测，LRR可能还有促进可能还有

149、促进R基因产基因产物与植物抗病反应信号传导中的其它蛋白质之间互作的作物与植物抗病反应信号传导中的其它蛋白质之间互作的作用，从而参与识别后的信号传导。用，从而参与识别后的信号传导。丝氨酸苏氨酸激酶丝氨酸苏氨酸激酶(Serine threonine kinase，STK) 在已知的在已知的R基因中，以发现番茄基因中，以发现番茄Pto基因和水稻基因和水稻Xa21基因基因含有含有STK的保守序列。的保守序列。Pto基因产物基因产物N末端又以潜在的十四烷末端又以潜在的十四烷酰化位点，说明酰化位点，说明Pto蛋白可能以与十四烷酰化的酪氨酸蛋白蛋白可能以与十四烷酰化的酪氨酸蛋白激酶相似的方式结合膜，通过与膜

150、受体偶联参与磷酸化级联激酶相似的方式结合膜，通过与膜受体偶联参与磷酸化级联进行抗病信号传导；进行抗病信号传导；Xa21基因除编码基因除编码STK外，还编码外，还编码LRR。研究证明，研究证明，Xa21基因街道的抗性需要基因街道的抗性需要STK和和LRR互作完成。互作完成。Pto和和Xa21这种结构特征证明蛋白激酶在信号传导过程中具这种结构特征证明蛋白激酶在信号传导过程中具有核心地位。有核心地位。 近年来人们发现，近年来人们发现，SerSer和和ThrThr残基可被依赖残基可被依赖GaGa2+2+的蛋白激酶磷酸化，的蛋白激酶磷酸化，同时此类蛋白激酶又是感受胞内同时此类蛋白激酶又是感受胞内GaGa

151、2+2+变化的重要效应分子。而变化的重要效应分子。而GaGa2+2+作为细作为细胞重要信号分子已被证明在植物过敏性坏死反应中与胞重要信号分子已被证明在植物过敏性坏死反应中与K K+ +协同作用丝细胞协同作用丝细胞膜去极化最终导致细胞过敏性坏死。因此，膜去极化最终导致细胞过敏性坏死。因此，STKSTK的结构特征在一定程度上的结构特征在一定程度上证明了离子通道防卫模型。证明了离子通道防卫模型。核苷酸结合位点（核苷酸结合位点（NBS）在已克隆的在已克隆的19个具有个具有LRR的的R基因中，有基因中，有13个含编码个含编码NBS的序列。的序列。NBS在许多蛋白质中具有在许多蛋白质中具有ATP或或GTP

152、的结合和活性，如的结合和活性，如ATP合成酶的合成酶的亚基、核糖体延长因子等。尽管对亚基、核糖体延长因子等。尽管对NBS结构域在植物抗病中的作用机制结构域在植物抗病中的作用机制还不十分清楚，但实验证明，三磷酸核苷酸的结合对抗病蛋白功能的发还不十分清楚，但实验证明，三磷酸核苷酸的结合对抗病蛋白功能的发挥是必需的，核苷酸磷酸的结合可能改变挥是必需的，核苷酸磷酸的结合可能改变R基因产物与其它防御信号之基因产物与其它防御信号之间的相互作用。即磷酸化是间的相互作用。即磷酸化是R基因的重要功能之一。基因的重要功能之一。 蛋白质的磷酸化和去磷酸化可引起蛋白质构象的变化蛋白质的磷酸化和去磷酸化可引起蛋白质构象

153、的变化，在这些在这些构象变化的蛋白质中许多可能是构象变化的蛋白质中许多可能是R基因转录调控中的的调节因子，可通基因转录调控中的的调节因子，可通过核膜孔与基因顺式作用元件结合，从而调控基因的转录表达。因此，过核膜孔与基因顺式作用元件结合，从而调控基因的转录表达。因此，人们推测含人们推测含LRRNBS的的R基因产物在通过基因产物在通过LRR感受信号后可能利用感受信号后可能利用NBS参与基因转录的调控。参与基因转录的调控。 亮氨酸拉链亮氨酸拉链（LZ）LZ是指蛋白质一侧有规律地出现是指蛋白质一侧有规律地出现Leu残基，在残基，在螺旋螺旋中靠疏水作用两两相连而成为一排拉链式的构型。中靠疏水作用两两相连

154、而成为一排拉链式的构型。 LZ在真核生物转录子的同源及异源二聚体形成中起重在真核生物转录子的同源及异源二聚体形成中起重要作用，但它们在要作用，但它们在R基因功能中所起的作用尚不明确。基因功能中所起的作用尚不明确。 R基因基因PRS2、RPM1和和Prf都编码有都编码有LZ序列，同时在序列，同时在N末端还有末端还有LRR和和NBS，它们街道对，它们街道对P.syringae不同致病型的不同致病型的抗性。在许多需要二聚体形式的抗性。在许多需要二聚体形式的DNA结合蛋白质中，结合蛋白质中，LZ都都充当独立的二聚体形成区域。蛋白的二聚化和多聚化对激充当独立的二聚体形成区域。蛋白的二聚化和多聚化对激活细

155、胞膜受体及转录因子等有作用，因此推测，具有活细胞膜受体及转录因子等有作用，因此推测，具有LZ结结构的构的R基因可能以同源或异源二聚体或多聚体形式发挥功能，基因可能以同源或异源二聚体或多聚体形式发挥功能，LZ在其中起着促进聚合的作用，从而与识别病原体或信号在其中起着促进聚合的作用，从而与识别病原体或信号传导有关。传导有关。Toll白细胞介素白细胞介素-1-1受体类似结构受体类似结构(TIR)N、L6、RPP1和和RPP5基因编码的基因编码的N-末端区域与果蝇发末端区域与果蝇发育基因育基因Toll以及哺乳动物白细胞介素以及哺乳动物白细胞介素-受体受体(IL-1R)基因的基因的胞质信号区域同源。其中

156、胞质信号区域同源。其中IL-1R参与细胞因子参与细胞因子IL-1反应，激反应，激活活Rel家族的转录因子家族的转录因子NFB；而在果蝇背腹极性的发育过；而在果蝇背腹极性的发育过程中，程中，Toll是激活是激活Rel家族转录因子家族转录因子Dorsal的受体，获得激活的受体，获得激活的背腹极性。可见的背腹极性。可见Toll 、 IL-1R等在参与的反应中都激活了等在参与的反应中都激活了某些转录因子。因此某些转录因子。因此R N、L6基因的类似结构可能与激活防基因的类似结构可能与激活防卫基因的转录因子有关。并且卫基因的转录因子有关。并且N、L6等等R基因与基因与Toll 、 IL-1R所控制的途径

157、之间也有惊人的相似性，如促进活性氧的所控制的途径之间也有惊人的相似性，如促进活性氧的产生和被水杨酸类物质调节等。表明动、植物之间在病原体产生和被水杨酸类物质调节等。表明动、植物之间在病原体识别以及信号传递途径等方面都存在相似性，植物细胞防御识别以及信号传递途径等方面都存在相似性，植物细胞防御反应可能类似于脊椎动物和昆虫中的天然免疫反应。反应可能类似于脊椎动物和昆虫中的天然免疫反应。功功 能能B.Baker & K.E.Hammond-kosak et al(1997)， 分别从寄主病原物相互作用和克隆分离的抗病分别从寄主病原物相互作用和克隆分离的抗病基因结构特征阐述了植物抗病基因应该具备和可能

158、具备的功能。基因结构特征阐述了植物抗病基因应该具备和可能具备的功能。对病原菌的识别作用对病原菌的识别作用信号传递的作用信号传递的作用进化功能进化功能有待于进一步深入研究的问题有待于进一步深入研究的问题R基因产物中是那些结构（或基因产物中是那些结构（或AA）决定病原物的特异）决定病原物的特异性识别？性识别？ R基因产物进行信号传递的下游信号物质是什么，这些基因产物进行信号传递的下游信号物质是什么，这些物质又是如何激发多种防卫反应的？物质又是如何激发多种防卫反应的？被诱导的防卫反应对不同的病原物如何和为什么具有被诱导的防卫反应对不同的病原物如何和为什么具有特异性抗性？特异性抗性？ 以突变分析鉴定出

159、来的其它基因产物对基因基因介以突变分析鉴定出来的其它基因产物对基因基因介导的抗性有何影响，其作用机制是什么？导的抗性有何影响，其作用机制是什么？ 自然界中新的自然界中新的R基因是如何发生的？基因是如何发生的？ 第三章第三章 植物防卫反应基因植物防卫反应基因植物防卫基因是在病原物激发子（包括特异性激发子和非植物防卫基因是在病原物激发子（包括特异性激发子和非特异性激发子）诱导下，表达防卫反应功能的植物抗病基因。特异性激发子）诱导下，表达防卫反应功能的植物抗病基因。目前研究得比较多，且已经得到克隆的防卫反应基因目前研究得比较多，且已经得到克隆的防卫反应基因主要包括：涉及植保素和木质素合成的关键酶基因

160、主要包括：涉及植保素和木质素合成的关键酶基因, ,几丁质酶几丁质酶1 1，3 3葡聚糖酶基因，富含羟脯氨酸的糖蛋白（葡聚糖酶基因，富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGP）基）基因、富含因、富含Gly的糖蛋白（的糖蛋白（GRP）基因，病程相关蛋白基因以及）基因，病程相关蛋白基因以及一些功能未知的与防卫反应有关的一些功能未知的与防卫反应有关的cDNA等。此外，乙烯和酚等。此外，乙烯和酚类化合物合成酶基因、病原物与致病有关酶抑制剂基因等也已类化合物合成酶基因、病原物与致病有关酶抑制剂基因等也已经得到克隆。经得到克隆。1 1 防卫反应基因的特点防卫反应基因的特点1.1 防卫反应基因的结构特点防卫反应基因的结构

161、特点 防卫反应基因在植物中多以基因家族出现。防卫反应基因在植物中多以基因家族出现。 同一植物中常有多种同工酶，各种同工酶的基因也各同一植物中常有多种同工酶，各种同工酶的基因也各不相同，但它们常有相同的阅读框架（不相同，但它们常有相同的阅读框架（ORF）。此外，不）。此外，不同同工酶的基因在基因组中的拷贝数也不相同。同同工酶的基因在基因组中的拷贝数也不相同。 不同植物中编码同一诱导抗性因素的基因虽然具有保不同植物中编码同一诱导抗性因素的基因虽然具有保守性，但在守性，但在DNA碱基序列上可能也存在着一定的差异碱基序列上可能也存在着一定的差异。1.2 防卫反应基因的表达调控防卫反应基因的表达调控 防

162、卫反应基因对信号刺激的应答迅速。分子杂交证防卫反应基因对信号刺激的应答迅速。分子杂交证明，基因表达首先表现在明，基因表达首先表现在mRNA量的升高，进而导致其模量的升高，进而导致其模板活性升高和翻译速度增加。板活性升高和翻译速度增加。 各种防卫反应基因的表达具有组织和细胞类型的特各种防卫反应基因的表达具有组织和细胞类型的特异性以及相互间存在着时间上的差异。此外，基因表达的异性以及相互间存在着时间上的差异。此外，基因表达的强弱在不同植物中有所不同。强弱在不同植物中有所不同。 植物诱导型防卫反应基因表达除受体内调控因子调植物诱导型防卫反应基因表达除受体内调控因子调节外，还受体外因子的调节。节外，还

163、受体外因子的调节。1.3 防卫反应基因功能的多重性防卫反应基因功能的多重性 防卫反应基因的存在不单单是为防卫防卫反应基因的存在不单单是为防卫反应而准备的，在正常植物体内也需要其定反应而准备的，在正常植物体内也需要其定量的表达。量的表达。 编码一种因素的基因在植物防卫反应编码一种因素的基因在植物防卫反应中可受多种不同类型因子的诱导。中可受多种不同类型因子的诱导。2 2 防卫反应基因的研究策略与克隆防卫反应基因的研究策略与克隆 迄今为止，对植物诱导基因的研究主要有通过基迄今为止，对植物诱导基因的研究主要有通过基因克隆和序列分析，比较不同植物中相同类型基因的差因克隆和序列分析，比较不同植物中相同类型

164、基因的差异；通过基因转化和体外表达，研究它们在抗病中的功异；通过基因转化和体外表达，研究它们在抗病中的功能；用能；用Northern杂交鉴定杂交鉴定RNA转录物的合成量来分析基转录物的合成量来分析基因表达随植物发育的变化、在不同器官中的分布以及外因表达随植物发育的变化、在不同器官中的分布以及外界刺激后的诱导；用组织印迹杂交和组织印迹免疫反应界刺激后的诱导；用组织印迹杂交和组织印迹免疫反应等技术测定新合成的等技术测定新合成的RNA和蛋白质，确定基因表达组织和蛋白质，确定基因表达组织特异性和细胞类型特异性以及基因调控等。此外，通过特异性和细胞类型特异性以及基因调控等。此外，通过基因的体外表达以及利

165、用植物悬浮细胞，建立起较简单基因的体外表达以及利用植物悬浮细胞，建立起较简单的植物信号作用系统，并对二者互作关系进行研究。的植物信号作用系统，并对二者互作关系进行研究。 用精密电泳方法比较诱导前后植物蛋白质用精密电泳方法比较诱导前后植物蛋白质的差异的差异, ,将诱导后新增加的蛋白质进行纯化和序将诱导后新增加的蛋白质进行纯化和序列分析列分析, ,进一步根据蛋白质的氨基酸顺序推导出进一步根据蛋白质的氨基酸顺序推导出其部分或全部其部分或全部DNA序列序列, ,通过通过PCRPCR扩增或构建探扩增或构建探针分别在基因组文库或针分别在基因组文库或cDNA文库中扩增或钓取文库中扩增或钓取目的基因。目的基因

166、。 从从蛋蛋白白质质入入手手 根据植物诱导前后根据植物诱导前后mRNA的差异，找出诱导的差异，找出诱导前后增加的前后增加的mRNA ，以此，以此mRNA转录成转录成cDNA构建探针，从植物构建探针，从植物cDNA文库中钓取相应的基因。文库中钓取相应的基因。另外，还可以根据不同需要采取其它的基因克另外，还可以根据不同需要采取其它的基因克隆方法，为通过植物的突变体库来寻找防卫反隆方法，为通过植物的突变体库来寻找防卫反应基因。应基因。 从从mRNA入入手手3 3 防卫反应基因的主要类型防卫反应基因的主要类型3.1 3.1 病程相关蛋白病程相关蛋白（pathogensis-related protei

167、ns,PR）基因基因PR基因的表达和调节基因的表达和调节病原菌侵染病原菌侵染化学诱导因子化学诱导因子生理胁迫因子生理胁迫因子植物激素植物激素微生物激发子微生物激发子环环境境信信号号诱诱导导发育调节发育调节 在健康烟草中，开花后的衰老叶片中都在健康烟草中，开花后的衰老叶片中都 能检测到能检测到PR蛋白的积累。除去衰老叶片或摘蛋白的积累。除去衰老叶片或摘 除花序可以抑制某些酸性除花序可以抑制某些酸性PR蛋白的积累，说明蛋白的积累，说明PR基因表达基因表达需要复杂的发育信号。需要复杂的发育信号。 植物发育中植物发育中PR基因表达受器官或组织特异性的差异基因表达受器官或组织特异性的差异调控。调控。PR

168、-1、PR-2和和PR-3的碱性异构体基因在健康植株的碱性异构体基因在健康植株下部叶片中是低水平表达的，而在根部则是高水平表达的；下部叶片中是低水平表达的，而在根部则是高水平表达的；在茎、花和绿色果荚中的碱性几丁酯酶基因是中等表达的，在茎、花和绿色果荚中的碱性几丁酯酶基因是中等表达的，而在花器官组织中碱性而在花器官组织中碱性PR-1和碱性和碱性-1,3-1,3-葡聚糖酶基因是葡聚糖酶基因是中等表达的。中等表达的。基因水平调控基因水平调控 PR蛋白合成是诱导后在蛋白合成是诱导后在mRNA水平水平 上被调节的，用不同的上被调节的，用不同的PR蛋白基因蛋白基因家族家族cDNA探针进行研究表明，高水平

169、探针进行研究表明，高水平mRNA仅在诱导仅在诱导后发生。控制后发生。控制PR基因表达的基本机制是转录活化或基因表达的基本机制是转录活化或mRNA的稳定性。的稳定性。 用转基因技术分析了用转基因技术分析了PRPR蛋白基因和蛋白基因和GRPGRP基因转录活化基因转录活化所需的所需的DNADNA序列。通过构建嵌合基因把不同序列。通过构建嵌合基因把不同PRPR基因上游区基因上游区域与报道基因融合，以农杆菌介导转化烟草植物，然后分域与报道基因融合，以农杆菌介导转化烟草植物，然后分析转基因植物以析转基因植物以SASA和和TMVTMV处理后这些基因的表达情况。结处理后这些基因的表达情况。结果发现，与转录起始

170、点果发现，与转录起始点5 5端端300bp,900bp300bp,900bp和和2400bp2400bp相当的相当的基因片段可以被不同程度的诱导。基因片段可以被不同程度的诱导。3.2 3.2 水解酶基因水解酶基因在植物防卫反应中研究得比较多的水解酶是在植物防卫反应中研究得比较多的水解酶是1 1，3 3葡聚糖酶和几丁质酶，其作用是对真菌细胞壁组分葡聚糖酶和几丁质酶，其作用是对真菌细胞壁组分1 1，3 3葡聚糖和几丁质具有降解能力。葡聚糖和几丁质具有降解能力。1 1，3 3葡聚葡聚糖酶和几丁质酶在植物防卫反应中起作用的主要证据是糖酶和几丁质酶在植物防卫反应中起作用的主要证据是病毒、细菌和真菌的侵染

171、或激发子、胁迫、激素、乙烯病毒、细菌和真菌的侵染或激发子、胁迫、激素、乙烯处理都能诱导植物产生这两种酶。在被诱导植物所具有处理都能诱导植物产生这两种酶。在被诱导植物所具有的浓度下，几丁质酶特别是几丁质酶与的浓度下，几丁质酶特别是几丁质酶与1 1，3 3葡聚糖葡聚糖酶共同作用时表现明显的杀菌活性。此外，有些植物几酶共同作用时表现明显的杀菌活性。此外，有些植物几丁质酶还有溶菌酶活性从而表现对病原细菌侵染的保护丁质酶还有溶菌酶活性从而表现对病原细菌侵染的保护作用。作用。-1,3-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶基因葡聚糖酶和几丁质酶基因基因结构基因结构这两类基因已在许多植物中进行了广泛的研究，并这两类基因

172、已在许多植物中进行了广泛的研究，并在基因结构和遗传进化方面有比较深入的了解。目前已在基因结构和遗传进化方面有比较深入的了解。目前已报道了在报道了在5种植物上的种植物上的10几种几丁质酶及在几种几丁质酶及在3种植物上的种植物上的7种种-1,3-葡聚糖酶基因，但对不同基因结构进行比较并明葡聚糖酶基因，但对不同基因结构进行比较并明确其序列特征的仅有少数。确其序列特征的仅有少数。 5 5- -旁则序列：旁则序列：转录调节通常依赖编码序列转录调节通常依赖编码序列5段的顺段的顺势作用因子。在至少势作用因子。在至少11种植物中以测定了编码两种酶的种植物中以测定了编码两种酶的mRNA在稳定状态下的水平，结果表

173、明，植物在受病原在稳定状态下的水平，结果表明，植物在受病原菌或激发子处理后的菌或激发子处理后的mRNA含量均有增加，而已激素处含量均有增加，而已激素处理后则表现下降趋势。理后则表现下降趋势。 中介序列：中介序列：几丁质酶和几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶基因的编码序葡聚糖酶基因的编码序列常被带有典型内含子列常被带有典型内含子/外显子接头的中介序列所阻断。外显子接头的中介序列所阻断。 3 3- -旁则序列：旁则序列：几丁质酶和几丁质酶和-1，3-葡聚糖酶基因的葡聚糖酶基因的 3 3端不翻译区有两个有关的聚腺苷信号。烟草第端不翻译区有两个有关的聚腺苷信号。烟草第组组-1, 3-葡聚糖酶基因葡聚糖酶基因

174、GLA和和GLB中中3 3端序列有端序列有92.7的相同；的相同；第第组几丁质酶基因的组几丁质酶基因的3 3端序列有端序列有90的相同。在拟南芥的相同。在拟南芥和菜豆的和菜豆的组几丁质酶基因和烟草组几丁质酶基因和烟草组组-1,3-葡聚糖酶基因葡聚糖酶基因表达中需要两个聚腺苷位点。表达中需要两个聚腺苷位点。基因家族的进化基因家族的进化 几丁质酶和几丁质酶和-1,3-葡聚糖酶基因家族都不大，仅具有葡聚糖酶基因家族都不大，仅具有34个成员。基因家族的发生是由于重组和基因转换形成的个成员。基因家族的发生是由于重组和基因转换形成的单基因复制而成。随着时间推移，由于碱基对的随机置换、单基因复制而成。随着时

175、间推移，由于碱基对的随机置换、缺失和重排，从一个基因将会衍生出新的拷贝。因此，从缺失和重排，从一个基因将会衍生出新的拷贝。因此，从一个基因组可克隆出两个前后排列一致但不完全相同的几一个基因组可克隆出两个前后排列一致但不完全相同的几丁质酶和丁质酶和-1,3-葡聚糖酶基因。葡聚糖酶基因。3.3 3.3 硫素（硫素（Thionin）基因）基因硫素是一类含二硫键的环状多肽，根据硫素是一类含二硫键的环状多肽，根据AA的数目和的数目和二硫键的位置可分为二硫键的位置可分为5种类型。硫素类蛋白质主要分布在种类型。硫素类蛋白质主要分布在细胞壁中，也有分布在细胞内。在某些植物中含量十分丰细胞壁中，也有分布在细胞内

176、。在某些植物中含量十分丰富，是一类独特的蛋白。富，是一类独特的蛋白。硫素基因及其在防卫反应中的作用硫素基因及其在防卫反应中的作用小麦胚乳中小麦胚乳中I型分子的三种硫素异构体型分子的三种硫素异构体、1和和2编码基因编码基因pur-A1、pur-B1和和pur-D1分别位于染色体分别位于染色体1A、1B和和1D的长臂上。黑麦胚乳的硫素基因位于的长臂上。黑麦胚乳的硫素基因位于1R染色体的染色体的长臂上，大麦胚乳长臂上，大麦胚乳I型硫素型硫素-hordothionin基因已经克隆并基因已经克隆并完成序列分析，其它类型的基因尚在研究中。完成序列分析，其它类型的基因尚在研究中。 目前还没有关于硫素直接参与

177、防卫反应的证据，在目前还没有关于硫素直接参与防卫反应的证据，在小麦感染白粉病时可以看到该蛋白的小麦感染白粉病时可以看到该蛋白的mRNA的瞬间诱导，的瞬间诱导，但抗感品种并无明显的差别，同时抗病基因和硫素基因但抗感品种并无明显的差别，同时抗病基因和硫素基因并不在一个染色体上。并不在一个染色体上。3.4 3.4 HRGP积累过程中的基因及调控积累过程中的基因及调控 HRGP是一种存在于植物细胞壁上的糖蛋白质线性是一种存在于植物细胞壁上的糖蛋白质线性复合分子。碳水化合物主要是阿拉伯糖和半乳糖。肽的主要复合分子。碳水化合物主要是阿拉伯糖和半乳糖。肽的主要成分除羟脯氨酸和脯氨酸外，还含有各种不同的氨基酸

178、，如成分除羟脯氨酸和脯氨酸外，还含有各种不同的氨基酸，如Tyr、Lys、Ser等。肽与糖基以等。肽与糖基以O糖苷键连接。糖苷键连接。 根据结构、组分和功能，根据结构、组分和功能，HRGP分为四类：第一类是分为四类：第一类是伸展蛋白（伸展蛋白（extensin）。第二类是茄科植物凝聚素；第三类）。第二类是茄科植物凝聚素；第三类是半纤维素和阿拉伯半乳糖蛋白（是半纤维素和阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan protein）；）；第四类是富含羟脯氨酸和脯氨酸的蛋白质（第四类是富含羟脯氨酸和脯氨酸的蛋白质（Hydroxyproline-proline-rich protein,H/PRP）

179、。）。HRGP基因的克隆基因的克隆 已克隆的伸展蛋白的已克隆的伸展蛋白的cDNA克隆编码富含羟脯氨酸或脯克隆编码富含羟脯氨酸或脯氨酸的蛋白（氨酸的蛋白（H/PRP）。在目前已发现的）。在目前已发现的7个个H/PRP cDNA或基因组克隆中有或基因组克隆中有5种编码的种编码的H/PRP是糖基化的。是糖基化的。 伸展蛋白中肽链是一条高度有序的氨基酸重复序列，伸展蛋白中肽链是一条高度有序的氨基酸重复序列，重复序列中五肽顺序排列成如重复序列中五肽顺序排列成如Ser-(Pro)4-Ser-Pro-Ser-(Pro)4-(Tyr)3-Lys的高度有序的序列。的高度有序的序列。不同的不同的H/PRP序列也是

180、高度重复的，但与伸展蛋白不序列也是高度重复的，但与伸展蛋白不同的是，重复序列中完全不含有同的是，重复序列中完全不含有Ser-(Pro)4单元。如大豆的单元。如大豆的3个个cDNA克隆（克隆（SbPRP1、 SbPRP2 、SbPRP3 ）普遍存在）普遍存在Pro-Pro-Val-Tyr-Lys和和Pro-Pro-Val-Glu-Lys的五肽顺序。的五肽顺序。豆科植物受根瘤菌侵染后可产生豆科植物受根瘤菌侵染后可产生H/PRP，已获得，已获得的的cDNA克隆在重复单元上与上面几种克隆不同，差异主克隆在重复单元上与上面几种克隆不同，差异主要表现在五肽顺序上，而且多数还含有六肽重复单元。要表现在五肽顺

181、序上，而且多数还含有六肽重复单元。HRGP基因的表达调控基因的表达调控 HRGP的诱导合成被证明是在转录水平上调控的，的诱导合成被证明是在转录水平上调控的，作为信号因子有创伤、病原物侵染和来自寄主植物或病作为信号因子有创伤、病原物侵染和来自寄主植物或病原物的激发子、外源和内源激素等。原物的激发子、外源和内源激素等。 所有所有HRGP的编码基因都在染色体上排列成一个的编码基因都在染色体上排列成一个多基因簇，每个成员负责对某种刺激信号发生反应。多基因簇，每个成员负责对某种刺激信号发生反应。 个基因成员可以产生不止一种转录本，可对一种个基因成员可以产生不止一种转录本，可对一种以上的刺激信号作出反应。

182、以上的刺激信号作出反应。 基因转录激活后，从基因转录激活后，从mRNA的合成、积累到的合成、积累到HRGP的合成和积累有一定的时序关系（的合成和积累有一定的时序关系（ timeliness ）。）。第四章第四章 寄主病原物相互作用寄主病原物相互作用（自学）（自学）1、植物与病原真菌互作的分子生物学基础。、植物与病原真菌互作的分子生物学基础。2、植物与病原细菌互作的分子生物学基础。、植物与病原细菌互作的分子生物学基础。第五章第五章 植物抗病反应的信号识别与传导植物抗病反应的信号识别与传导1、与植物抗病相关的信号分子及其作用、与植物抗病相关的信号分子及其作用水杨酸（水杨酸（Salicylic ac

183、id,SA） 植物内源信号分子植物内源信号分子SASA在植物抗病信号传导过程中起重在植物抗病信号传导过程中起重要作用。研究表明，在病原物侵染后，烟草、黄瓜和其它植要作用。研究表明，在病原物侵染后，烟草、黄瓜和其它植物体内物体内SASA含量几百倍的增加，并且与含量几百倍的增加，并且与SARSAR及植物抗病性提高及植物抗病性提高有关。体内有关。体内SASA标记实验证明，标记实验证明，TMVTMV侵染的烟草和侵染的烟草和TNVTNV侵染的黄侵染的黄瓜叶片中产生的瓜叶片中产生的SASA被运转到植物全身并且在植物未感染部位被运转到植物全身并且在植物未感染部位也有也有SASA的积累。由此推断，的积累。由此

184、推断，SASA可能是从感染部位传导至植物可能是从感染部位传导至植物其它部位激发其它部位激发SARSAR反应的信号。反应的信号。 也有实验证明，也有实验证明，SASA不能进行长距离的信号转导。表明不能进行长距离的信号转导。表明SASA或者不是长距离传导的信号，且少量的或者不是长距离传导的信号，且少量的SASA不足以引起不足以引起SARSAR，必然在信号传递下游有一个长距离信号分子协同作用。必然在信号传递下游有一个长距离信号分子协同作用。水杨酸在防卫反应中起作用的证据：水杨酸在防卫反应中起作用的证据： J.Ryals（19941994）及其同事证明烟草用）及其同事证明烟草用SASA处理后在处理后在

185、TMVTMV侵侵染点及后来的整株植物所活化的染点及后来的整株植物所活化的PRPR蛋白基因是相同的；转蛋白基因是相同的；转NahG基因烟草在侵染基因烟草在侵染TMVTMV后不积累或很少积累后不积累或很少积累SASA，因而不，因而不能形成能形成SARSAR。SASA在烟草抗病中的作用可归纳如下：在烟草抗病中的作用可归纳如下： 使用外源使用外源SASA能诱导防卫基因表达和对病害产生部分能诱导防卫基因表达和对病害产生部分保护效果。保护效果。 内源内源SASA增加的水平与防卫基因和抗病性发展平行。增加的水平与防卫基因和抗病性发展平行。 SASA诱导的基因与受诱导的基因与受TMVTMV侵染后系统活化的侵染

186、后系统活化的9 9个基因是个基因是相同的。相同的。 SASA水解酶在转基因烟草中的表达能阻断水解酶在转基因烟草中的表达能阻断SASA的积累和的积累和阻止阻止SARSAR的发生。的发生。乙烯（乙烯（Ethylene，ET） 通常植物产生的通常植物产生的ET量很小，但当植物受到病量很小，但当植物受到病原物侵染时，原物侵染时， ET的产生急剧增加。在烟草中，的产生急剧增加。在烟草中， ET的的产生与病毒引起的过氧化酶活性增加和产生与病毒引起的过氧化酶活性增加和PRP有关，这些有关，这些蛋白质的合成与植物蛋白质的合成与植物SAR有密切关系，因为没有感染的有密切关系，因为没有感染的植株存在植株存在PRP

187、-mRNA，但不翻译，但不翻译， ET可使可使mRNA进行进行翻译；同样，外源应用翻译；同样，外源应用ET诱发拟南芥植株系统性积累诱发拟南芥植株系统性积累防卫素，不应用防卫素，不应用ET处理的拟南芥突变株处理的拟南芥突变株cin2接种后不积接种后不积累防卫素，也不表现累防卫素，也不表现SAR，表明，表明ET可在拟南芥植株产可在拟南芥植株产生对生对A. brassicicola的的SAR中起重要作用。中起重要作用。茉莉酸（茉莉酸（Jas monate acid ,JA） JA及其甲酯（及其甲酯（JA-Me）是一类脂肪酸衍生物。）是一类脂肪酸衍生物。机械伤害，草食动物、昆虫伤害，病原物侵染等对机械

188、伤害，草食动物、昆虫伤害，病原物侵染等对JA的合成有促进作用，而且反应迅速。如烟草受伤后的合成有促进作用，而且反应迅速。如烟草受伤后90 min内叶片中内叶片中JA含量增加了含量增加了10倍，倍，180min后根中的后根中的JA含量增加了含量增加了3.5倍。用单克隆抗体可检测到防卫反应中倍。用单克隆抗体可检测到防卫反应中JA信号分子快速而短暂的增加；此外，用信号分子快速而短暂的增加；此外，用JA处理可以处理可以提高欧芹细胞对真菌激发子的敏感性，用提高欧芹细胞对真菌激发子的敏感性，用JA-Me 预先预先处理小麦幼苗，再用小麦白粉病菌接种，植株的抗性有处理小麦幼苗，再用小麦白粉病菌接种，植株的抗性

189、有很大的提高。很大的提高。活性氧（活性氧（Active oxygen species,AOS） 植物和病原菌的相互识别会诱导植物和病原菌的相互识别会诱导AOS的产生，的产生，AOS 迸发（迸发（oxidative burst）被认为是过）被认为是过HR的特征性反应，也的特征性反应，也是植物早期抗病反应之一。植物中是植物早期抗病反应之一。植物中AOS主要包括超氧阴离主要包括超氧阴离子子(O2 -)、羟基自由基、羟基自由基(-OH)和过氧化氢（和过氧化氢（H2O2）。）。 研究表明，研究表明，AOS在植物抗病反应中的作用主要有：杀在植物抗病反应中的作用主要有：杀死入侵的病原菌、引起细胞膜脂过氧化、

190、介导死入侵的病原菌、引起细胞膜脂过氧化、介导HR、促进细、促进细胞壁氧化交联以强化细胞壁从而延缓或阻止病原物的入侵胞壁氧化交联以强化细胞壁从而延缓或阻止病原物的入侵和扩散、诱导植物保护素的合成等等。和扩散、诱导植物保护素的合成等等。钙离子（钙离子（Ca2+） 细胞内外细胞内外Ca2+的浓度变化也是植物对病原物侵染早的浓度变化也是植物对病原物侵染早期反应之一。研究表明，期反应之一。研究表明，Ca2+对于植物防卫基因的诱导和对于植物防卫基因的诱导和植保素的积累是必需的；大麦对霜霉病的抗性表现与细胞植保素的积累是必需的；大麦对霜霉病的抗性表现与细胞间间Ca2+的浓度有很大的相关性。此外，许多实验证明

191、激发的浓度有很大的相关性。此外，许多实验证明激发子集器的信号通过离子通道的传导都与子集器的信号通过离子通道的传导都与Ca2+密切相关，推密切相关，推测测Ca2+的作用是活化信号传递系统中的蛋白激酶，因为在的作用是活化信号传递系统中的蛋白激酶，因为在无无Ca2+的介质中激发子诱导的蛋白磷酸化明显减少。的介质中激发子诱导的蛋白磷酸化明显减少。2 2 植物抗病信号传导途径及其相互作用植物抗病信号传导途径及其相互作用 在植物抗病反应过程中，抗病信号必须由内源信在植物抗病反应过程中，抗病信号必须由内源信号分子从受侵染部位传导至整株植物，引起相应的系统号分子从受侵染部位传导至整株植物，引起相应的系统性抗性

192、，因而内源信号分子在植物抗病信号传导途径中性抗性，因而内源信号分子在植物抗病信号传导途径中起重要作用。目前研究较多的植物内源信号分子是起重要作用。目前研究较多的植物内源信号分子是SA、JA和和ET。SAR和和HR需要需要SA介导，称之为介导，称之为SA-依赖性途依赖性途径径(SA dependent pathway)，这一途径中，这一途径中PR-1蛋白协同蛋白协同表达；表达；ISR则是通过植物激素则是通过植物激素JA和和ET介导。介导。Morriseey和和Osbourn用用JA和和ET处理可降解转基因拟南芥的处理可降解转基因拟南芥的SA，并诱，并诱导产生系统性抗性，说明该途径与导产生系统性抗

193、性，说明该途径与SA无关，称之为无关，称之为SA-非依赖性途径非依赖性途径(SA independent pathway)。2.12.1 经典的信号传导模式经典的信号传导模式水水稻稻白白叶叶枯枯病病系系统统不不亲亲和和互互作作模模型型欧欧 芹芹 细细 胞胞 中中 激激 发发 子子 信信 号号 转转 导导 途途 径径 模模 型型膜质过氧化过敏反应膜质过氧化过敏反应受受 体体（受体）（受体） 抗病基因产物抗病基因产物 PLC cAMP G蛋白蛋白PIP2IP2+DAGCa2+/H+内渗内渗Ca2+/H+内渗内渗PK/PP转录因子转录因子?O2O2NAD(P)H氧化酶氧化酶SODH2O2胞壁加固胞壁

194、加固（抗菌）（抗菌）JAMeJA，SAMeSA 形成形成转录因子转录因子？凋亡基因激活凋亡基因激活防卫基因激活（防卫基因激活（PAL,CHS,PRP,LOX,PLS，thionon)信号放大信号放大保卫基因激活（保卫基因激活（POX,GP,GST）病原或激发子信号病原或激发子信号CWCPCN2.22.2 SA-依赖性途径依赖性途径(SA dependent pathway) SA在在SAR和植物抗病方面起着重要作用。当烟草或黄和植物抗病方面起着重要作用。当烟草或黄瓜受病原菌侵染后，瓜受病原菌侵染后，SA 含量成倍增加，从而诱导产生含量成倍增加，从而诱导产生SAR，说明说明SA的积累可作为一种内

195、源信号使局部抗性转化为的积累可作为一种内源信号使局部抗性转化为SAR。 研究表明，研究表明，SA不是长距离信号分子，且少量的不是长距离信号分子，且少量的SA不足以诱发不足以诱发SAR。因而因而SA要诱导产生要诱导产生SAR，必须要在信号传递下游有一个长距离信号分子，必须要在信号传递下游有一个长距离信号分子协同作用。有证据表明，协同作用。有证据表明，H2O2是继是继SA后的第二个信使。的第二个信使。后的第二个信使。的第二个信使。Chen等从烟草中鉴定出一种可溶性等从烟草中鉴定出一种可溶性SA结合蛋白结合蛋白(SA binding protein, SABP)，具有，具有CAT活性。而活性。而SA

196、和具有生理活性的和具有生理活性的SA类似物能抑制该酶的类似物能抑制该酶的活性，导致活性，导致H2O2水平升高，激活水平升高，激活PR-1基因表达，从而建立基因表达，从而建立SAR。余迪求。余迪求等发现氧化态的等发现氧化态的SA启动膜质过氧化反应并修饰其它大分子，诱导脂质过启动膜质过氧化反应并修饰其它大分子，诱导脂质过氧化，进而激活抗性基因的表达。氧化，进而激活抗性基因的表达。SARSARNPR1PBS3Compound (Fe )Compound (Fe )SA*SA胶胶 质质脂脂 质质过氧化过氧化RPP1,RPP5,RPS4 RPS2, RPS5 RPP7, RPP8 NBS LRR NBS

197、 LRR NBS LRRTIRLZLZEDSPBS4PBS2NDR1SID1/EDS 5SID2SANahGRPP：抗寄生霜霉基因抗寄生霜霉基因RPS：抗丁香霜霉基因抗丁香霜霉基因EDS：感病增强突变体感病增强突变体PBS：引物结合位点突变体引物结合位点突变体SID：SA诱导缺陷突变体诱导缺陷突变体NahG：水杨酸水解酶基因水杨酸水解酶基因NPR：PR基因非表达突变体基因非表达突变体2.32.32.32.3 SA- SA-非依赖性途径非依赖性途径非依赖性途径非依赖性途径(SA independent pathway)(SA independent pathway) 研究发现，植物抵抗病原物侵染

198、时需要植物创伤反应调节因子研究发现，植物抵抗病原物侵染时需要植物创伤反应调节因子JA；ET的作用更多的是控制病害症状。的作用更多的是控制病害症状。A. brassicicola导致拟南芥产生坏死斑，导致拟南芥产生坏死斑，激发内源激发内源JA、ET水平提高，水平提高，PDF1.2积累，从而产生抗性。对影响积累，从而产生抗性。对影响JA、TE和和SA途径的拟南芥突变体进行研究，实验证明，外源途径的拟南芥突变体进行研究，实验证明，外源JA和和ET同时存在可诱同时存在可诱导导PDF1.2 mRNA和蛋白质水平提高，但和蛋白质水平提高，但SA却不能。所有却不能。所有npr1或或NahG 的的PAF1.2

199、表达对表达对A. brassicicola的抗性没有影响，而的抗性没有影响，而JA的反应调节子的反应调节子Coll的突变的突变体却没有抗性，且积累体却没有抗性，且积累PDF1.2 mRNA，这正是，这正是SA非依赖型抗性机理的基非依赖型抗性机理的基础。础。 用用ET和和JA处理拟南芥不能诱导处理拟南芥不能诱导camalexin合成，而合成，而SA积累却是诱导积累却是诱导camalexin所必需的，但效率不高。所必需的，但效率不高。PAD3基因编码基因编码camalexin合成酶，虽然合成酶，虽然camalexin在其它植物与病原菌互作中的作用还不清楚，但可以肯定，在其它植物与病原菌互作中的作用

200、还不清楚，但可以肯定， camalexin在拟南芥与在拟南芥与A. brassicicola互作过程中是一种起决定性的抗真菌化互作过程中是一种起决定性的抗真菌化合物。合物。拟南芥拟南芥（A. Brassicicola） ETJASAROIPAD 3ETR 1EIN 2PAD3JAmybcamalexinPDF1.2/PR-3/PR-4ISRROI:过氧化介导过氧化介导PAD:植保素缺陷型植保素缺陷型Jamyb:JA-介导抗性基因介导抗性基因PDF1.2:植物防卫素植物防卫素1.2ETR:乙烯受体基因乙烯受体基因EIN:乙烯非敏感性基因乙烯非敏感性基因2.42.42.42.4 植物防卫反应信号传

201、导的互作植物防卫反应信号传导的互作植物防卫反应信号传导的互作植物防卫反应信号传导的互作 SA和和JA参与不同的信号传导途径。研究发现，参与不同的信号传导途径。研究发现， SA和和JA诱导的基因表达间存在拮抗作用，因此，植物可通过动力诱导的基因表达间存在拮抗作用，因此，植物可通过动力学微小差异积累或特殊信号传导分子的运输及时进行有效的防学微小差异积累或特殊信号传导分子的运输及时进行有效的防卫反应。卫反应。Beymond & Farmer 提出一个精确刻度提出一个精确刻度（tunabledial）模型对交叉途径作出了准确的描述。即通过信）模型对交叉途径作出了准确的描述。即通过信号分子间相对浓度的变

202、化产生协调或拮抗作用，拟南芥确实可号分子间相对浓度的变化产生协调或拮抗作用，拟南芥确实可同时激发同时激发SA依赖型依赖型SAR和和JA/ET依赖性依赖性ISR反应，提高植反应，提高植物对病原菌物对病原菌P. syringae pv. tomato的抗性。的抗性。 在在HR反应中，要有效地激发防卫反应，使死亡细胞控制反应中，要有效地激发防卫反应，使死亡细胞控制在一定的区域，则需要有正向或负向调节子的共同参与，精确在一定的区域，则需要有正向或负向调节子的共同参与，精确控制信号流量和方向。控制信号流量和方向。SSL1非病原性根围细菌非病原性根围细菌病原菌病原菌JAETSAJA/ETJAR1ETR1E

203、IN 2NPR1ISRSAR植物防植物防卫反应卫反应CPR1COL1EIN 2ETR1EDS 1PAD4EDS5/SID3SID2CPR5CPR6EDS5JAR:茉莉酸受体基因茉莉酸受体基因ETR:乙烯受体基因乙烯受体基因NPR:PR-非表达因子基因非表达因子基因EDS:感病性增强因子感病性增强因子PAD:植保素缺陷型基因植保素缺陷型基因SID:SA诱导缺陷型诱导缺陷型CPR:PR-组成型表达基因组成型表达基因EIN:乙烯非敏感型基因乙烯非敏感型基因总而言之，植物与病原菌的互作是一个复杂的级链总而言之，植物与病原菌的互作是一个复杂的级链反应。对于每一个病害来说，由于病原菌的侵染行为不反应。对于

204、每一个病害来说，由于病原菌的侵染行为不同，侵染后的识别存在着各自的特性，但是，随后所引同，侵染后的识别存在着各自的特性，但是，随后所引起的信号在多数病害中都有共同的组分和传导途径。不起的信号在多数病害中都有共同的组分和传导途径。不同病原菌的无毒基因之间尽管已发现有同源性但其差异同病原菌的无毒基因之间尽管已发现有同源性但其差异性终究是普遍存在的，而来自不同作物赋予对不同类型性终究是普遍存在的，而来自不同作物赋予对不同类型病害抗性的植物抗病基因之间都表现出惊人的结构和功病害抗性的植物抗病基因之间都表现出惊人的结构和功能上的保守性。这说明不同病害抗性中可能存在着共同能上的保守性。这说明不同病害抗性中

205、可能存在着共同的信号传递机制。如果能对这些共同机制进行深入研究，的信号传递机制。如果能对这些共同机制进行深入研究，从信号传递的不同过程进行人为控制，将会在病害抗性从信号传递的不同过程进行人为控制，将会在病害抗性研究中产生重要突破。研究中产生重要突破。第六章第六章 植物抗病基因工程的基本植物抗病基因工程的基本原理与方法原理与方法 植物抗病基因工程是通过分子生物学技术获得对植物病植物抗病基因工程是通过分子生物学技术获得对植物病害（病毒、细菌、真菌、线虫等病害）具有一定抗性的转基害（病毒、细菌、真菌、线虫等病害）具有一定抗性的转基因植株。因植株。 1983年首例转基因烟草问世。年首例转基因烟草问世。

206、 1994年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准进行商品化生产。目前，国内外已报道的转基因作物有进行商品化生产。目前，国内外已报道的转基因作物有1 6种种70多个品系。多个品系。 自自1986年年3月以后，我国已研究的转基因作物月以后，我国已研究的转基因作物47类，涉及的转基因类，涉及的转基因103种。正式公布的转基因作物：棉花、大豆、西红柿、青椒和矮牵牛。种。正式公布的转基因作物：棉花、大豆、西红柿、青椒和矮牵牛。 目前，已经商品化的转基因作物所转入的外源基因主要是抗性基目前，已经商品化的转基因作物所转入的外源基因主要是抗性基

207、因，只有少数是改良作物品种性状的。因，只有少数是改良作物品种性状的。 1 1 植物抗病基因工程策略植物抗病基因工程策略1.1 1.1 导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因在植物抗性基因的利用方面在植物抗性基因的利用方面 根据已有的根据已有的R基因结构特征，设计新的基因结构特征，设计新的R基因。基因。 异源表达异源表达R基因。基因。 向同一株植物中导入多个向同一株植物中导入多个R基因。基因。在病原菌无毒基因的利用方面在病原菌无毒基因的利用方面 转病原菌无毒基因。转病原菌无毒基因。 将病原菌无毒基因和相应的将病原菌无毒基因和相应的R基因一起导入植物。基因

208、一起导入植物。 导入与植物抗病信号有关的基因。导入与植物抗病信号有关的基因。1.2 1.2 导入植物防卫基因导入植物防卫基因 Broglie(1991),et al. 在克隆菜豆几丁质基因的基础上将在克隆菜豆几丁质基因的基础上将CH5B基因修饰改造，通过基因修饰改造，通过Ti质粒转化烟草，获得几丁质酶质粒转化烟草，获得几丁质酶高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。 M.J.Carmona(1993),et al.，将来源于大麦基因组克隆，将来源于大麦基因组克隆的硫素基因和来源于小麦的硫素基因和来源于小麦cDNA克隆的硫素基因转化到烟

209、草克隆的硫素基因转化到烟草中，获得了对中，获得了对P.s.pv.tabaci具有较高抗性的植株。具有较高抗性的植株。 美国孟山都（美国孟山都（Monsanto）公司将真菌编码葡萄糖氧化）公司将真菌编码葡萄糖氧化酶基因导入马铃薯中，获得了对酶基因导入马铃薯中，获得了对Ecc引起的细菌性软腐病具引起的细菌性软腐病具有良好抗性的植株。有良好抗性的植株。1.3 1.3 导入降解病原物致病因子基因导入降解病原物致病因子基因 H. Anzai(1989),et al.分离到了抗烟毒素分离到了抗烟毒素（tabtoxin）的基因）的基因ttr，将基因，将基因ttr与与CaMV 35S启动子融启动子融合成嵌合基

210、因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获合成嵌合基因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得得ttr高表达量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染高表达量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良好的抗性。均表现出良好的抗性。 菜豆毒素（菜豆毒素（phaseolotoxin）是一种非寄主专化性毒）是一种非寄主专化性毒素，产菜豆毒素的素，产菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通过菌株通过argK基因基因合成一种不被菜豆毒素抑制的合成一种不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒酶，从而对该毒素不敏感。将素不敏感。将argK基因导入烟草和菜豆，获得的转基因基因导入烟草和菜豆，获得

211、的转基因烟草和菜豆对烟草和菜豆对P.s.pv.phaseolicola有较高的抗性。有较高的抗性。1.4 1.4 导入其它蛋白基因导入其它蛋白基因 贾士荣贾士荣,等等(1993)和和M.Hassan (1993),et al.向马铃薯向马铃薯导入导入cecropin基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。 J.M.Jaynes(1993),et al.将将cecropinB基因导入烟草基因导入烟草后获得的转基因植株，提高了其对后获得的转基因植株，提高了其对R.solanacearum引起引起病害的抗性。病害的抗性。 黄大年黄大年,等等(1997)将将cecropin

212、B和和cecropinD基因导入基因导入水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻白叶枯病的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻白叶枯病的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻白叶枯病的高抗品系。白叶枯病的高抗品系。2 2 植物抗病基因工程的技术环节植物抗病基因工程的技术环节 至今已分离的供植物基因工程应用的目的至今已分离的供植物基因工程应用的目的基因有基因有100多个，其中研究得比较多的是抗病毒、多个，其中研究得比较多的是抗病毒、细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的基因，能抵抗各种除草剂的

213、基因，能抗逆境如干基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有少数是人工合成的。少数是人工合成的。2.1 2.1 目的基因的分离和鉴定目的基因的分离和鉴定 对已知序列进行分子克隆对已知序列进行分子克隆 从蛋白质到基因序列从蛋白质到基因序列 PCR扩增扩增构建构建cDNA文库文库构建基因组文库构建基因组文库 与已知基因紧密连锁基因的分离与已知基因紧密

214、连锁基因的分离 根据植株或细胞表型变异进行基因分离根据植株或细胞表型变异进行基因分离 转座子标签法转座子标签法图位克隆法图位克隆法基因挽救技术基因挽救技术基因组相减法基因组相减法cDNA差式显示差式显示转座子导入细胞转座子导入细胞目的形状突变株目的形状突变株构建核构建核DNA文库文库用转座子序列作用转座子序列作探针进行杂交探针进行杂交分析转座子两侧序分析转座子两侧序列并以此作探针列并以此作探针野生型野生型细胞核细胞核DNA构建构建 核核DNA 文库文库完整的目的完整的目的性状基因性状基因转座子标签法流程图转座子标签法流程图2.2 2.2 表达载体的构建表达载体的构建 目的基因分离后，往往需要经

215、过修饰才能应用于目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的5端加上启动子，在基因的端加上启动子，在基因的3端加上中止子，以便使外源端加上中止子，以便使外源基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。加入启动子区加入启动子区 目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要有有3类：第一类是从类：第一类是从Ti质粒的质粒的T-DNA序列上分离的启动序列上分离的启动区。具有真核生物转基因起始所需的区。具有真核生物转基因起始所需的

216、TATA盒和盒和CAT盒；盒；第二类是第二类是CaMV的的35S和和19S启动子；第三类是从植物启动子；第三类是从植物本身分离出来的启动子。本身分离出来的启动子。加入转录的加尾序列加入转录的加尾序列 真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一方面保证形成有活性的方面保证形成有活性的mRNA链。植物基因工程中常链。植物基因工程中常用的加尾序列是用的加尾序列是AATAAA。插入内含子插入内含子 内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因内含子是真核生物基因组结

217、构的特点之一。在基因工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。但是在实际操作中，如果在目的基因适当的位置插入这但是在实际操作中，如果在目的基因适当的位置插入这种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此，有人种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此，有人推测，内含子可能在基因翻译中起增强子的作用。推测，内含子可能在基因翻译中起增强子的作用。加入翻译起始密码子加入翻译起始密码子 由于植物中由于植物中mRNA的翻译起始密码子多数也是的翻译起始密码子多

218、数也是AUG，因此，要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当，因此，要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当的核苷酸序列。的核苷酸序列。加入终止密码子加入终止密码子 植物基因工程中所使用的植物基因工程中所使用的mRNA翻译终止密码子有翻译终止密码子有UAA、UAG、UGA三种。一般在目的基因功能蛋白的三种。一般在目的基因功能蛋白的编码序列后直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用编码序列后直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用的是的是Ti质粒中的质粒中的Nos终止子。终止子。加入增强序列加入增强序列加入与植物中特定加入与植物中特定DNA同源的序列同源的序列 为了实现将目的基因和植物基因组有效整合

219、，植物基因为了实现将目的基因和植物基因组有效整合，植物基因工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同源序列的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达源序列的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。加入报道基因加入报道基因 常用的报道基因

220、：常用的报道基因：lacZ、ocs、cat、npt、lux和和gus2.3 2.3 目的基因向植物的转化目的基因向植物的转化 近年来，植物的遗传转化技术得到了迅近年来，植物的遗传转化技术得到了迅速的发展，已建立了多种转化系统，如以农杆速的发展，已建立了多种转化系统，如以农杆菌菌Ti质粒及质粒及Ri质粒为载体的转化系统，以质粒为载体的转化系统，以PEG介导的原生质化学导入法、电激法、基因枪法、介导的原生质化学导入法、电激法、基因枪法、花管导入法等等。总之，植物细胞遗传转化系花管导入法等等。总之，植物细胞遗传转化系统可分为两大类：以载体为介导的基因转化统可分为两大类：以载体为介导的基因转化（vec

221、tor mediated gene transfer）和）和DNA直接直接转化（转化（naked DNA transfer）。）。 2.4 2.4 转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定 植物外植体经过农杆菌或植物外植体经过农杆菌或DNA直接转化后，大部分直接转化后，大部分细胞是没有转化的，只有极少数是转化的，这就需要采用细胞是没有转化的，只有极少数是转化的，这就需要采用特定的的方式将未转化细胞与转化细胞区分开来，淘汰未特定的的方式将未转化细胞与转化细胞区分开来，淘汰未转化的细胞，然后利用植物细胞的全能性在适宜的环境条转化的细胞，然后利用植物细胞的全能性在适宜

222、的环境条件下使转化的细胞再生成可育的转基因植株。件下使转化的细胞再生成可育的转基因植株。 目前，转化细胞与非转化细胞的区分及非转化细胞目前，转化细胞与非转化细胞的区分及非转化细胞的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草剂基因，总称筛选的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草剂基因，总称筛选标记。植物基因工程中常用的筛选标记是标记。植物基因工程中常用的筛选标记是npt（neomycin phosphotransferase）基因和）基因和cat（chloramphenicol acetyltr-ansferase ）基因）基因第七章第七章 转基因作物及其外源转基因作物及其外源抗性基因检测技术抗性基因检测技术

223、概概 况况世界上已批准世界上已批准 进行商品化转基因进行商品化转基因作物：作物：大豆、玉米、棉花、大豆、玉米、棉花、 西红柿、西红柿、马铃薯、甜椒、西马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜等，其中葫芦、木瓜、甜菜、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜等，其中前四种超过了前四种超过了99，种植面积最大的是转基因大豆，种植，种植面积最大的是转基因大豆，种植面积为面积为3650万公顷，占万公顷，占62，其次是转基因玉米，种植面，其次是转基因玉米，种植面积为积为1240万公顷，占万公顷，占21，第三是转基因棉花，种植面积，第三是转基因棉花，种植面积为为680万公顷，占万公顷，占12，第四是转基

224、因油菜，种植面积，第四是转基因油菜，种植面积300万公顷，占万公顷，占5。目前已经商品化的转基因作物所转入的外源功能目前已经商品化的转基因作物所转入的外源功能基因主要是抗性基因，即耐除草剂、抗虫、抗病毒、基因主要是抗性基因，即耐除草剂、抗虫、抗病毒、抗真菌、抗细菌、抗线虫等，只有少数是改良作物品抗真菌、抗细菌、抗线虫等，只有少数是改良作物品种性状的基因。种性状的基因。1 1 以商品化转基因作物及其转入的外源基因种类以商品化转基因作物及其转入的外源基因种类商品化转基因玉米及外源抗性基因种类商品化转基因棉花及其外源抗性基因种类商品化转基因大豆及其外源抗性基因种类商品化转基因油菜及其外源抗性基因种类

225、商品化转基因马铃薯及其外源抗性基因的种类商品化的其它转基因作物及其外源抗性基因种类2 2 转基因作物外源基因检测技术及其研究进展转基因作物外源基因检测技术及其研究进展 目前已经发展并广泛应用的转基因作物外源基因目前已经发展并广泛应用的转基因作物外源基因检测技术有检测技术有DNA检测法和蛋白质检测法。检测法和蛋白质检测法。2.12.1 DNA检测法检测法定性定性PCR定性定性PCR检测方法可以判断待检测样品检测方法可以判断待检测样品 中是否含有转基因成分。目前有筛选和中是否含有转基因成分。目前有筛选和鉴定检测方法。最初的研究基本集中在转基因产品的筛鉴定检测方法。最初的研究基本集中在转基因产品的筛

226、选检测上，目前则重点研究转基因产品的鉴定检测方法。选检测上，目前则重点研究转基因产品的鉴定检测方法。CaMV35S、NOS和和NPT是筛选检测最常用的标记；鉴是筛选检测最常用的标记；鉴定检测多为边界序列的检测，即检测外源基因和自身基定检测多为边界序列的检测，即检测外源基因和自身基因之间的边界序列，或两个特异性的外源基因之间的边因之间的边界序列，或两个特异性的外源基因之间的边界序列。界序列。定性定性PCRPCRPAGEPCR-ELISAPCR-GeneScan实时荧光实时荧光PCR定量定量PCR常规常规PCR由于扩增效率的问题而不能准由于扩增效率的问题而不能准 定量。从理论上讲，如果每一个扩增循

227、定量。从理论上讲，如果每一个扩增循环的效率是恒定的，那么原始目标环的效率是恒定的，那么原始目标DNA的量。但实际上的量。但实际上扩增效率并不是一个恒定的参数，在不同的反应批次间扩增效率并不是一个恒定的参数，在不同的反应批次间以及同一反应批次内，都可能不一样。尤其是以及同一反应批次内，都可能不一样。尤其是PCR反应反应后期，扩增效率已不是对数形式。传统定量方法都是终后期，扩增效率已不是对数形式。传统定量方法都是终点检测，即点检测，即PCR达到平台期后进行检测，而达到平台期后进行检测，而PCR经过对经过对数期的扩增到达平台期时，其扩增效率受反应体系中残数期的扩增到达平台期时，其扩增效率受反应体系中

228、残留的留的DNA聚合酶、聚合酶、PCR产物及非特异性产物等多种因素产物及非特异性产物等多种因素影响，因此，定量检测的重复性极差。影响，因此，定量检测的重复性极差。竞争性竞争性PCR QC-PCR(Quantitative competitive PCR)是指是指在同一支反应管中，未知含量待测模板与已知含在同一支反应管中，未知含量待测模板与已知含量内标模板（竞争性模板）用同一引物同时扩增，扩增后用量内标模板（竞争性模板）用同一引物同时扩增，扩增后用内切酶消化内切酶消化PCR产物。竞争性模板的产物可被酶解为两个产物。竞争性模板的产物可被酶解为两个片段，而待测模板不被切割，可以通过凝胶电泳或高效液相

229、片段，而待测模板不被切割，可以通过凝胶电泳或高效液相将两种产物分开，测定各自的荧光强度，根据已知模板推测将两种产物分开，测定各自的荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。由于测定未知模板的起始拷贝数。由于测定PCR反应产物浓度时，反应产物浓度时，待测模板和内标的扩增产物在待测模板和内标的扩增产物在PCR反应阶段都有着相同的反应阶段都有着相同的扩增效率，因此，受干扰因素较小，定量较准确。扩增效率，因此，受干扰因素较小，定量较准确。PCRELISA 将磷酸化或氨基化反向引物共价结将磷酸化或氨基化反向引物共价结合在处理过的合在处理过的PCR管上，在核酸粗提液中特异性地与目的管上，在核酸粗提液

230、中特异性地与目的片段核酸杂交，以除去杂质、聚合酶抑制物质及非目标核片段核酸杂交，以除去杂质、聚合酶抑制物质及非目标核酸。酸。PCR扩增中，该引物也参与扩增，在扩增中，该引物也参与扩增，在Taq酶的作用下，酶的作用下，沿引物方向延伸，形成一条固定在管壁上的双链。将双链沿引物方向延伸，形成一条固定在管壁上的双链。将双链变性后用变性后用DIG或生物素标记的探针与固定在管壁上的单链或生物素标记的探针与固定在管壁上的单链杂交，在用碱性磷酸酶进行杂交，在用碱性磷酸酶进行ELISA反应。同时对液相产物反应。同时对液相产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。进行琼脂糖凝胶电泳检测。 PCR-ELISAPCR-ELISA相

231、对于凝胶光密度定量来说，无论是灵相对于凝胶光密度定量来说，无论是灵敏度、特异性、准确度上都用很大的提高。它为敏度、特异性、准确度上都用很大的提高。它为PCRPCR提供提供了第一个严格意义上的定量方法，并且对仪器要求较低，了第一个严格意义上的定量方法，并且对仪器要求较低，只需要只需要PCRPCR仪和酶标仪就可以进行。仪和酶标仪就可以进行。实时荧光实时荧光PCR 是指在是指在PCR反应体系中加反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线与未知模板进行进程，最后通过标准曲线与未知模板进行定量分析的方法。该方法采用一个双标记荧

232、光定量分析的方法。该方法采用一个双标记荧光探针来检测探针来检测PCR产物的积累，可以非常精确地产物的积累，可以非常精确地定量基因拷贝数，从而实现了定量基因拷贝数，从而实现了PCR从定性到定从定性到定量的飞跃。由于采用完全闭管检测，无需量的飞跃。由于采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了其它检测方法存在的交叉污染后处理，避免了其它检测方法存在的交叉污染的问题。的问题。基因芯片法基因芯片法生物芯片可以粗略地分为细胞芯片、蛋生物芯片可以粗略地分为细胞芯片、蛋 白质芯片和基因芯片等，由于其高通量白质芯片和基因芯片等，由于其高通量和快速检测的优点，已成为和快速检测的优点，已成为21世纪生物工程的前沿

233、科技。世纪生物工程的前沿科技。 基因芯片又称寡核苷酸阵列或杂交阵列分析，它是基因芯片又称寡核苷酸阵列或杂交阵列分析，它是根据根据DNA双螺旋原理而发展的核酸链间分子杂交的技术。双螺旋原理而发展的核酸链间分子杂交的技术。它在芯片表面制备成千上万的基因单元作为配基，对待它在芯片表面制备成千上万的基因单元作为配基，对待测基因进行筛选。测基因进行筛选。 按基因芯片上探针的长度可分为寡核苷酸芯片和按基因芯片上探针的长度可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。按照基因芯片的用途可分为表达谱芯片和诊芯片。按照基因芯片的用途可分为表达谱芯片和诊断芯片。表达谱芯片是目前比较成熟、应用最广泛的一断芯片。表达谱芯片是目前

234、比较成熟、应用最广泛的一种基因芯片，主要用于检测基因的差异性表达、寻找新种基因芯片，主要用于检测基因的差异性表达、寻找新基因和研究基因功能。基因和研究基因功能。DNA指纹技术指纹技术质质 谱谱 法法采用质谱法检测采用质谱法检测DNA比常规的分子生比常规的分子生 物学检测方法灵敏度高，并且能提高检测的物学检测方法灵敏度高，并且能提高检测的自动化程度和检测通量。但检测费用昂贵，且容易受自动化程度和检测通量。但检测费用昂贵，且容易受污染物影响。污染物影响。 2.2 2.2 蛋白质检测法蛋白质检测法（ELISA法法） 蛋白质检测方法是针对转基因植物所转入的外蛋白质检测方法是针对转基因植物所转入的外源基

235、因表达产物进行检测的方法（源基因表达产物进行检测的方法（Steinkeliner,1998）。）。 在进行转基因产品检测时，抗原是转基因产品在进行转基因产品检测时，抗原是转基因产品中新基因的表达蛋白，因此建立转基因产品免疫学检中新基因的表达蛋白，因此建立转基因产品免疫学检测方法必须有两个先决条件：首先是要研究制备出可测方法必须有两个先决条件：首先是要研究制备出可以针对新表达的外源基因的特异性抗体；其次是待测以针对新表达的外源基因的特异性抗体；其次是待测样品和或蛋白质不能被降解或破坏。样品和或蛋白质不能被降解或破坏。 2.3 2.3 其它检测方法其它检测方法 色谱法色谱法色谱法色谱法 近红外光谱

236、法近红外光谱法近红外光谱法近红外光谱法 生物传感器法生物传感器法生物传感器法生物传感器法 纳米转基因检测技术纳米转基因检测技术纳米转基因检测技术纳米转基因检测技术未经许可的基因品系种未经许可的基因品系种已获许可的基因品系种已获许可的基因品系种样样 品品阴性阴性阳性阳性PCR、实时荧光、实时荧光PCR、基因芯片、基因芯片定性筛选检测定性筛选检测比比 对对 试试 验验PCR、实时荧光、实时荧光PCR、基因芯片、基因芯片品种系鉴定品种系鉴定低限量低限量高限量高限量实时定量实时定量PCR贴标识贴标识定量检测定量检测实时荧光实时荧光PCR（Real Time PCR） 实时荧光实时荧光PCR是是1996

237、年由美国年由美国Applied Biosystems公司推出的，以其快速、敏感、不公司推出的，以其快速、敏感、不需要后续电泳步骤、不易污染检测环境和便需要后续电泳步骤、不易污染检测环境和便于进行实验室规划管理等优点，已在医学及于进行实验室规划管理等优点，已在医学及动植物食物安全检测领域显示出明显的优势。动植物食物安全检测领域显示出明显的优势。通过筛选出待测基因的特异性引物和探针，通过筛选出待测基因的特异性引物和探针，其检测的敏感性比常规其检测的敏感性比常规PCR技术高出技术高出100倍左倍左右，并且能实现实时观察、监控整个检测的右，并且能实现实时观察、监控整个检测的动态过程。动态过程。原原 理

238、理 在在PCRPCR反应体系中加入荧光集团，反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号积累实时监测整个利用荧光信号积累实时监测整个PCRPCR过程，最过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 目前使用实时荧光目前使用实时荧光PCRPCR检测仪与光学系统检测仪与光学系统及电脑相连及电脑相连, ,将检测到的荧光信号数据通过数将检测到的荧光信号数据通过数学模式计算后绘制出曲线学模式计算后绘制出曲线, ,根据标准曲线判断根据标准曲线判断检测样品的阴阳性和未知样品中待测基因的含检测样品的阴阳性和未知样品中待测基因的含量量( (拷贝数拷贝数) )。探针种类探针种类 目

239、前实时荧光目前实时荧光PCR所用荧光探针主要所用荧光探针主要有三种：有三种：TaqMan荧光探针、杂交双探针和分子信标探针，荧光探针、杂交双探针和分子信标探针，其中其中TaqMan荧光探针使用最为广泛。荧光探针使用最为广泛。TaqMan荧荧光光探探针针 TaqMan荧光探针为寡核苷酸，荧光探针为寡核苷酸，5端标记有一个端标记有一个荧光报告基团（荧光报告基团（Reporter），），3端标记有一个荧光淬端标记有一个荧光淬灭基团（灭基团（Quencher）。当探针完整时，报告基团发出）。当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，此时检测不到荧光信号；的荧光信号被淬灭基团吸收，此时检测不到

240、荧光信号；当当PCR扩增时，随着产物沿着模板的延伸，扩增时，随着产物沿着模板的延伸，Taq酶具酶具有有53外切酶活性，可将位于扩增片段内的探针外切酶活性，可将位于扩增片段内的探针5端报告基团切下，端报告基团切下，切下的报告基团脱离切下的报告基团脱离3端淬灭基团的淬灭作用而发出荧光，切下的报端淬灭基团的淬灭作用而发出荧光，切下的报告基团数量与扩增产物呈一对一的关系，即告基团数量与扩增产物呈一对一的关系，即PCR反应每进行一个循环，反应每进行一个循环，扩增一条扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。随着链，就有一个荧光分子形成。随着PCR反应的循环往复，反应的循环往复，在合成在合成N条条DNA链的

241、同时，也水解了链的同时，也水解了N条探针，释放了相应数量的荧条探针，释放了相应数量的荧光基团。应关信号的积累与光基团。应关信号的积累与PCR产物形成完全同步。通过检测产物形成完全同步。通过检测PCR反反应导致的荧光值变化，即可准确判断扩增产物的量。应导致的荧光值变化，即可准确判断扩增产物的量。杂杂交交双双探探针针 杂交双探针又叫荧光能量转移（杂交双探针又叫荧光能量转移（Fluorescence resonance energy transfer）探针）探针，时将荧光基，时将荧光基团和淬灭基团分别标记在两个不同的探针上团和淬灭基团分别标记在两个不同的探针上（发光探针和淬灭探针）发光探针的（发光探

242、针和淬灭探针）发光探针的5端连接端连接荧光基团，淬灭探针的荧光基团，淬灭探针的3端连接淬灭基团。由于两个探针端连接淬灭基团。由于两个探针设计时可与模板一条链相邻设计时可与模板一条链相邻 的序列杂交，杂交时两个探针的序列杂交，杂交时两个探针的荧光分子和淬灭分子便紧密相邻，从而发生能量转移使的荧光分子和淬灭分子便紧密相邻，从而发生能量转移使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此进行进行PCR定量分析。定量分析。 由于两个探针结合于模板上影响扩增效率，并且由于两个探针结合于模板上影响扩增效率，并且合成的两个探针较长，因此检测成本相对较高。

243、合成的两个探针较长，因此检测成本相对较高。分分 子子信信 标标荧荧 光光PCR Tyagi & Krammer（1996）首次建立了分子）首次建立了分子信标荧光信标荧光PCR技术技术(Molecular beacons PCR)。分子信标为一环形法夹型探针，其分子信标为一环形法夹型探针，其5和和3末端末端自身可形成一个含有自身可形成一个含有8bp左右的法夹结构，其发左右的法夹结构，其发夹环状部分与靶序列互补，为与主干部分的夹环状部分与靶序列互补，为与主干部分的5和和3末端分末端分别标记荧光基团和淬灭基团。正常时，法夹呈环形关闭状别标记荧光基团和淬灭基团。正常时，法夹呈环形关闭状态。态。PCR扩

244、增时，溶液中有模板序列，探针环序列与模板扩增时，溶液中有模板序列，探针环序列与模板杂交，探针的发夹结构被破坏而呈线性展开，此时，报告杂交，探针的发夹结构被破坏而呈线性展开，此时，报告荧光和淬灭荧光距离拉开，而释放荧光。荧光强度的增加荧光和淬灭荧光距离拉开，而释放荧光。荧光强度的增加与与PCR产量成正比。产量成正比。对实时荧光对实时荧光PCR技术的评价技术的评价关于鉴定转基因作物边界序关于鉴定转基因作物边界序列片段的必要性列片段的必要性基因芯片（基因芯片（Gene Chip）技术）技术 基因芯片技术的产生可以追溯到上世纪基因芯片技术的产生可以追溯到上世纪70年年代的代的southern blot

245、 杂交技术。自杂交技术。自1993年美国埃菲公司年美国埃菲公司科研人员首电脑芯片启示首次开发出基因芯片，科研人员首电脑芯片启示首次开发出基因芯片，1995年年Stanford大学的大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因芯片后，基因芯片以其技术所难以比璃为载体的基因芯片后，基因芯片以其技术所难以比拟的高通量、高速度和低成本等优点而在不到十年的拟的高通量、高速度和低成本等优点而在不到十年的时间以惊人的速度迅速发展，德国弗赖堡基因扫描公时间以惊人的速度迅速发展，德国弗赖堡基因扫描公司已经研制出以玻璃为材料的基因芯片并已投放市场，司已经研制出以玻璃为材料的基因芯

246、片并已投放市场，这种芯片在几小时内就能准确查清牛奶等食品基础原这种芯片在几小时内就能准确查清牛奶等食品基础原料中所含有害细菌。据专家预测，世界基因芯片产业料中所含有害细菌。据专家预测，世界基因芯片产业将以每年增长将以每年增长30的速度发展，的速度发展，2005年全球基因芯片年全球基因芯片总营业额将从总营业额将从1998年的年的180亿美元增长到亿美元增长到400亿美元，亿美元，诊断的种类将从目前的诊断的种类将从目前的100多种扩大到多种扩大到5000多种，其多种，其发展将带来医疗技术的革命。发展将带来医疗技术的革命。 将探针将探针DNADNA有序地固定于玻片或其它有序地固定于玻片或其它固相载体

247、上，待测样品核酸分子经过标记与固固相载体上，待测样品核酸分子经过标记与固定在载体上的定在载体上的DNADNA阵列中的探针按碱基配对原则阵列中的探针按碱基配对原则同时进行杂交，洗去未互补结合的片段。然后同时进行杂交，洗去未互补结合的片段。然后通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，检测杂交信号的强弱，用计算机软件进行数据检测杂交信号的强弱，用计算机软件进行数据分析，从而获取样品分子的数量和序列信息。分析，从而获取样品分子的数量和序列信息。 基因芯片的操作分为基因芯片的操作分为芯片的制备芯片的制备芯片的制备芯片的制备和和样本的样本的检测检测两个部分。两个

248、部分。原原 理理基因芯片技术的应用及其存在的问题基因芯片技术的应用及其存在的问题 在人体重要病害诊断方面：在人体重要病害诊断方面：该技术已用于癌症的诊该技术已用于癌症的诊断、血友病的诊断、艾滋病的诊断、肝炎的诊断等等。断、血友病的诊断、艾滋病的诊断、肝炎的诊断等等。 在科研方面：在科研方面：该技术已用于后基因组的研究、基因该技术已用于后基因组的研究、基因表达谱的分析、突变体的检测、多态性分析、基因文库作图、表达谱的分析、突变体的检测、多态性分析、基因文库作图、杂交测序等。杂交测序等。 在药物设计、筛选和开发方面：在药物设计、筛选和开发方面：目前国内外已大量目前国内外已大量应用该技术来寻求药物靶

249、标，检查药物的毒性或副作用等。应用该技术来寻求药物靶标，检查药物的毒性或副作用等。 在农业、食品工业和环境保护方面：在农业、食品工业和环境保护方面：用于抗性基因用于抗性基因的检测、有害微生物的检测、环境安全评价等。的检测、有害微生物的检测、环境安全评价等。 基因芯片技术对转基因作物及其产品检测能够高通量、基因芯片技术对转基因作物及其产品检测能够高通量、平行化、自动化、综合型地同时检测大量基因，而且还具有平行化、自动化、综合型地同时检测大量基因，而且还具有快速准确敏感的特点。然而，由于基因芯片是一个高新生物快速准确敏感的特点。然而，由于基因芯片是一个高新生物技术，仍然处于不断的发展阶段，因此，仍

250、存在许多不足之技术，仍然处于不断的发展阶段，因此，仍存在许多不足之处如基因芯片的稳定性、重复性、敏感性问题还需要进一步处如基因芯片的稳定性、重复性、敏感性问题还需要进一步的实验来完善。其检测成本也相对较高。的实验来完善。其检测成本也相对较高。能否筛选到稳定可靠的探针。能否筛选到稳定可靠的探针。针对探针设计的引物是否稳定，扩增效率是否高。针对探针设计的引物是否稳定，扩增效率是否高。基因芯片的制备是否成功基因芯片的制备是否成功。反应体系和反应条件是否合适。反应体系和反应条件是否合适。杂交温度是否适宜，杂交时间长短是否合适。杂交温度是否适宜，杂交时间长短是否合适。清洗是否充分、均匀。清洗是否充分、均匀。杂交过程是否避光。杂交过程是否避光。