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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光，利用荧光信号累积信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通过标进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 应用应用 绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究相对
2、定量(Relative Quantification，RQ) 高通量基因检测方法的验证 药物疗效考核 耐药性研究实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 应用应用 中国人终末期肝病组织中乙肝病毒转录体的检测中国人终末期肝病组织中乙肝病毒转录体的检测摘要目的摘要目的: 探讨肝组织中HBV DNA 和病毒转录体与终末期肝病的关系. 方法方法: 用TRIzol 从肝组织中提取组织核酸,PCR 及RT PCR 扩增HBV XDNA, XRNA, fRNA 和trRNA, 琼脂糖凝胶电泳显示产物, Southern blot 杂交验证PCR 扩增的可靠性. 结果结果: 27 例HBsAg ( +
3、 ) 肝组织, 19 例HBx DNA/ RNA 检测均为阳性, 其中HBeAg ( + ) 者fRNA 检出率较HBeAg( - ) 者高; 22 例HBsAg ( - ) 肝组织, 有16 例可检测到HBx DNA 或RNA,HBsAg( - ) 的隐匿性感染在中国人终末期肝病中有较高的检出率72. 7%; HBV 病毒转录体trRNA 在肝癌及肝硬化组织中的检出率明显高于其他肝脏疾病( P 0. 05) . 结论结论: HBV隐匿性感染与中国人终末期肝病的发生密切相关, 肝组织中HBV trRNA 也与终末期肝病关系密切.实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 应用应用 实时荧
4、光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 应用应用 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 实时原理实时原理 常常 规规 PCRPCR技术：技术： 对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量实时定量PCRPCR技术：技术： 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每每一个循环扩增产物量的变化一个循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标准曲线和标准曲线的分析对的分析对起始模板起始模板进行
5、进行定量分析定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率非非特异性荧光标记：特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记： 2、TaqMan
6、实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - DNA - DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1 -1 -SYBR Green 法SYBR Green SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作
7、原理工作原理5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitationSYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非非特异性产物特异性产物SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不
8、准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer 体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因型的分析q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品相对定量中的内标相对定量中的内标 内标通常是内标通常是-actin、GAPDH、18S rRNA基因等看家基因基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒已知拷贝数的质粒DNA DNA
