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1、第二十六章毒理学实验基础第二十六章毒理学实验基础第一节毒理学实验设计要求第一节毒理学实验设计要求第二节第二节 实验动物的染毒和处置实验动物的染毒和处置第三节优良实验室规范第三节优良实验室规范1第一节毒理学实验设计要求第一节毒理学实验设计要求n目的和意义目的和意义n毒理学实验设计内容毒理学实验设计内容 确定实验动物及数量确定实验动物及数量确定剂量或浓度确定剂量或浓度 重复原则重复原则随机分组原则随机分组原则对照原则对照原则伦理原则伦理原则2一、确定实验动物一、确定实验动物（一）一）实验动物物种的选择实验动物物种的选择对实验动物物种选择的基本原则是：对实验动物物种选择的基本原则是：n选择对受试物在
2、代谢、生物化学和毒理学特征选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种；与人最接近的物种；n自然寿命不太长的物种；自然寿命不太长的物种；n易于饲养和实验操作的物种；易于饲养和实验操作的物种；n经济并易于获得的物种。经济并易于获得的物种。 3（二）实验动物品系的选择（二）实验动物品系的选择n品品系系(strain)是是指指用用计计划划交交配配的的方方法法，获获得得起起源于共同祖先的一群动物。源于共同祖先的一群动物。4作为一个品系应具备以下条件：作为一个品系应具备以下条件：相似的外貌特征相似的外貌特征独特的生物学特性独特的生物学特性稳定的遗传性能稳定的遗传性能具有共同遗传来源和一定的遗
3、传结构具有共同遗传来源和一定的遗传结构 51 1、实验动物按遗传学控制分类、实验动物按遗传学控制分类n n 近交系动物近交系动物n 远交系动物远交系动物n实验动物实验动物 突变系动物突变系动物n 杂交群动物杂交群动物n 6（1 1）近交系动物）近交系动物(inbred strain )(inbred strain )n近交系近交系( inbred strain )( inbred strain )： 指至少经连续指至少经连续2020代以上全同胞交配或亲子交配培育而成，代以上全同胞交配或亲子交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于品系内所有个体都可追溯到起源于2020代或以后代数的代或以后代
4、数的一对共同祖先，近交个体的基因纯合程度可达一对共同祖先，近交个体的基因纯合程度可达98.698.6以上的遗传群体。以上的遗传群体。7近交系的特征基因纯合性基因纯合性( homozygosity ) 遗传稳定性( stability )n遗传同源性( isogenicity )n表型一致性( uniformity )n个体性( individuality )n可分辨性( identification )n分布的广泛性n资料可查性 8n 近交系动物的应用近交系动物的应用 n与远交原种相比，近交系动物个体之间极为一致，对与远交原种相比，近交系动物个体之间极为一致，对实验反应一致，可以消除杂合遗传背
5、景对实验结果影实验反应一致，可以消除杂合遗传背景对实验结果影响。因此在实验中，实验组和对照组都只需少量的动响。因此在实验中，实验组和对照组都只需少量的动物。物。n在某些涉及组织、细胞或肿瘤移植的实验中，个体之在某些涉及组织、细胞或肿瘤移植的实验中，个体之间组织相容性一致与否是实验成败的关键，在这里，间组织相容性一致与否是实验成败的关键，在这里，近交系动物成为必不可少的实验材料。近交系动物成为必不可少的实验材料。 9n有些近交系具有一定的自发或诱发肿瘤发病率，或有些近交系具有一定的自发或诱发肿瘤发病率，或其他先天性异常，这些品系可能成为生理、胎胚发其他先天性异常，这些品系可能成为生理、胎胚发育和
6、医学研究的模型。育和医学研究的模型。n多个近交系同时使用，可使不同研究者分析不同遗多个近交系同时使用，可使不同研究者分析不同遗传组成对某项实验的影响，或者观察实验结果是否传组成对某项实验的影响，或者观察实验结果是否具有普遍意义。具有普遍意义。10（2 2）突变系动物）突变系动物 (mutant strain )(mutant strain )n 突变系动物是具有特殊突变基因、并伴有各种遗传突变系动物是具有特殊突变基因、并伴有各种遗传缺陷的品系动物。缺陷的品系动物。n在长期繁殖过程中，动物的子代突然发生变异，变异的基因位在长期繁殖过程中，动物的子代突然发生变异，变异的基因位点又可遗传下去，或者即
7、使没有明确的基因位点，经淘汰和选点又可遗传下去，或者即使没有明确的基因位点，经淘汰和选育后，仍能维持其稳定的遗传性状。这种变异并能继续保持遗育后，仍能维持其稳定的遗传性状。这种变异并能继续保持遗传基因特性的品系动物，称为突变系动物传基因特性的品系动物，称为突变系动物。11特点特点 突变系动物可以作为人类疾病的动物模型而在生物医突变系动物可以作为人类疾病的动物模型而在生物医学的研究中应用。学的研究中应用。n众多的突变系动物的出现给生物医学研究提供了重要的工具众多的突变系动物的出现给生物医学研究提供了重要的工具- -疾病模型，有不少突变品系动物的疾病与人类疾病极为相似。疾病模型，有不少突变品系动物
8、的疾病与人类疾病极为相似。n多为病态，生活能力较差，对饲养管理要求更为严格，多为病态，生活能力较差，对饲养管理要求更为严格，繁殖保种较为困难。繁殖保种较为困难。 12（3 3）封闭群动物（）封闭群动物（ closed colonyclosed colony）n封闭群动物又称远交系，是指一个动物种群，在封闭群动物又称远交系，是指一个动物种群，在5 5年以上未从年以上未从外部引进其他任何新血缘品系，是由同一血缘品系进行随机外部引进其他任何新血缘品系，是由同一血缘品系进行随机交配，并在固定场所保存繁殖的动物群。交配，并在固定场所保存繁殖的动物群。n常见者如：常见者如： NIH小鼠、小鼠、Wistar
9、大鼠、大鼠、KM小鼠、青紫蓝兔、小鼠、青紫蓝兔、新西兰兔和豚鼠等，均属这类动物。新西兰兔和豚鼠等，均属这类动物。n 13特点： 一定的杂合性：不引入新的基因，又不使一定的杂合性：不引入新的基因，又不使 群体内基因丢失。群体内基因丢失。 相对的稳定性：群体在一定范围内保持相相对的稳定性：群体在一定范围内保持相 对稳定的遗传特征。对稳定的遗传特征。 个体差异取决于祖代动物。个体差异取决于祖代动物。 较强的繁殖力、抗病力。较强的繁殖力、抗病力。 群体易保存有模型价值的突变基因。群体易保存有模型价值的突变基因。14（4 4）杂交群动物）杂交群动物(hybrid stock )(hybrid stock
10、 )n 杂交群动物又称异系杂交或系统杂交动物，是杂交群动物又称异系杂交或系统杂交动物，是两个近交品系动物间有计划进行交配获得的第两个近交品系动物间有计划进行交配获得的第一代动物，亦称杂交一代，简称一代动物，亦称杂交一代，简称F1代动物。代动物。15特点：na 杂交优势，克服了近交引起的近交衰退杂交优势，克服了近交引起的近交衰退nb b 遗传与表型上的均质性遗传与表型上的均质性nc 分布广泛分布广泛。 nd不具有育种功能不具有育种功能16（三）实验动物等级的选择（三）实验动物等级的选择 实验动物的微生物标准化程度。实验动物的微生物标准化程度。 17181 1、无菌动物无菌动物（germfree
11、animalgermfree animal，GFGF）：）： 指用现有检测技术在动物体内外的任何部位均检指用现有检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物。来源于剖不出任何活的微生物和寄生虫的动物。来源于剖腹产或无菌卵孵化，饲养于隔离系统中。腹产或无菌卵孵化，饲养于隔离系统中。192 2、悉生动物悉生动物(gnotobiotic animal GN)(gnotobiotic animal GN)n悉生动物悉生动物：或称已知菌动物，广义上把无菌动：或称已知菌动物，广义上把无菌动物、已知菌动物、无特定病原体动物统称悉生物、已知菌动物、无特定病原体动物统称悉生动物；狭义上指已
12、知菌动物。动物；狭义上指已知菌动物。203 3、无特定病原体动物无特定病原体动物 (SPF) :(SPF) : 指动物体内无特定的微生物、寄生虫存在，但带有指动物体内无特定的微生物、寄生虫存在，但带有非特定的微生物、寄生虫的动物。主要指不携带潜非特定的微生物、寄生虫的动物。主要指不携带潜在感染、条件致病和对实验干扰大的病原。来源于在感染、条件致病和对实验干扰大的病原。来源于剖腹产动物。剖腹产动物。 小鼠病原菌应排除小鼠病原菌应排除16种，病毒种，病毒11种；大鼠病原菌应种；大鼠病原菌应排除排除16种，病毒种，病毒7种。种。214 4、清洁动物清洁动物(Clean animal )(Clean
13、animal )n除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和对科学除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。来源于研究干扰大的病原。来源于SPF动物或剖腹产动物。动物或剖腹产动物。n血清病毒抗体检测可检测出一定滴度的抗体，病理切片应无血清病毒抗体检测可检测出一定滴度的抗体，病理切片应无病变。病变。n小鼠病原菌应排除小鼠病原菌应排除10种，病毒种，病毒5种；大鼠病原菌应排除种；大鼠病原菌应排除10种，种，病毒病毒2种。种。225 5、普通动物、普通动物(conventional animal CV(conventional animal CV ) ) 定义：不携带
14、人兽共患病病原和动物烈性传染病病原定义：不携带人兽共患病病原和动物烈性传染病病原的实验动物。的实验动物。n特点：特点：n微生物控制要求最低。微生物控制要求最低。n生理学特性：健康的外貌，生理学特性：健康的外貌，n 正常的饮食，正常的饮食， n 眼角、鼻腔眼角、鼻腔 无分泌物附着，无分泌物附着，n 尸检无眼观病灶。尸检无眼观病灶。23n（四）个体的选择n年龄和体重n性别n生理状态和健康状况 24（五）确定实验动物的数量（五）确定实验动物的数量n实验动物还需要有一定的数量，例数不能太少，也实验动物还需要有一定的数量，例数不能太少，也不宜过多。大样本的代表性优于小样本，但样本过不宜过多。大样本的代表
15、性优于小样本，但样本过大会加大工作量，而且成本也相应提高。大会加大工作量，而且成本也相应提高。n长期实验还应考虑实验动物因疾病或操作不当等原长期实验还应考虑实验动物因疾病或操作不当等原因引起的动物数量减少，应适当增加每组的动物数。因引起的动物数量减少，应适当增加每组的动物数。n一般来讲，每组小鼠和大鼠数一般不少于一般来讲，每组小鼠和大鼠数一般不少于1010只，犬只，犬一般不少于一般不少于6 6只。只。 25二、确定剂量或浓度二、确定剂量或浓度n不同实验方法、不同实验模型、不同动物实验所需化学物剂不同实验方法、不同实验模型、不同动物实验所需化学物剂量不同。毒理学研究所应用的剂量应产生下列作用：至
16、少有量不同。毒理学研究所应用的剂量应产生下列作用：至少有一个剂量产生明显的毒作用甚至可能发生死亡；至少有另一一个剂量产生明显的毒作用甚至可能发生死亡；至少有另一剂量产生轻度的毒性而不发生死亡；至少还有一个剂量不产剂量产生轻度的毒性而不发生死亡；至少还有一个剂量不产生可观察到的毒作用。生可观察到的毒作用。n对照组的动物可做相同的处理，但不给受试物。应尽量确定对照组的动物可做相同的处理，但不给受试物。应尽量确定不良反应的量效关系和时效关系（如不良反应的发生和持续不良反应的量效关系和时效关系（如不良反应的发生和持续时间）时间）.n至少应设三个剂量组。低剂量应相当于主要毒效学的有效剂至少应设三个剂量组
17、。低剂量应相当于主要毒效学的有效剂量，高剂量以不产生严重毒性反应为限。量，高剂量以不产生严重毒性反应为限。26n三、重复（三、重复（replication）原则）原则n任何毒理学实验必须用多于一个以上的实验单任何毒理学实验必须用多于一个以上的实验单位，如实验单位可为一个动物、一窝子代等。位，如实验单位可为一个动物、一窝子代等。由于实验单位存在一定变异，可引起实验效应由于实验单位存在一定变异，可引起实验效应的误差，因此只有达到或满足一定数量的实验的误差，因此只有达到或满足一定数量的实验单位才可提供更准确的实验效应。单位才可提供更准确的实验效应。27n四、随机化（四、随机化（randomizati
18、on）原则分组）原则分组n随机化是指用随机数字或其他随机化的电脑程序将随机化是指用随机数字或其他随机化的电脑程序将选定的实验单位进行随机分组或随机抽样。选定的实验单位进行随机分组或随机抽样。n实验设计中的随机化就是将实验单位进行随机分组。实验设计中的随机化就是将实验单位进行随机分组。例如，将一批受试者按等概率分为例如，将一批受试者按等概率分为A和和B两组，可两组，可以用随机数字的奇偶决定每个受试者的组别。以用随机数字的奇偶决定每个受试者的组别。28n五、对照（五、对照（control）原则）原则n毒理学中常用的对照形式毒理学中常用的对照形式n1. 空白对照空白对照 n2. 阳性对照阳性对照 n
19、3. 3. 阴性对照阴性对照n4. 4. 自身对照自身对照 n5. 5. 历史对照历史对照29六、六、 动物实验设计的伦理原则动物实验设计的伦理原则30n（一）动物福利法的起源（一）动物福利法的起源 n（二）动物福利的立法宗旨和福利标准二）动物福利的立法宗旨和福利标准 n根据各国现有的动物福利法的历史及渊源的考察，根据各国现有的动物福利法的历史及渊源的考察，满足动物的需求是动物福利法的首要原则。动物的满足动物的需求是动物福利法的首要原则。动物的需求主要表现在以下三个方面：需求主要表现在以下三个方面：维持生命需要，维维持生命需要，维持健康需要及维持舒适需要持健康需要及维持舒适需要。31n五大自由
20、是动物福利法的基本原则：五大自由是动物福利法的基本原则：n1.1.享有不受饥渴的自由；享有不受饥渴的自由；n2.2.享有生活舒适的自由；享有生活舒适的自由；n3.3.享有不受痛苦伤害和疾病的自由；享有不受痛苦伤害和疾病的自由；n4.4.享有生活无恐惧和悲伤感的自由；享有生活无恐惧和悲伤感的自由；n5.5.享有表达天性的自由。享有表达天性的自由。32（三）我国实验动物福利立法的有关问题（三）我国实验动物福利立法的有关问题n我国现行的有关动物保护的法律为数不多，动物保护的范围我国现行的有关动物保护的法律为数不多，动物保护的范围也过于狭隘，欠缺了哪一方面都不算完整的动物保护。除也过于狭隘，欠缺了哪一
21、方面都不算完整的动物保护。除野生动物保护法野生动物保护法、动物检疫法动物检疫法等几部单行法外，余等几部单行法外，余者只散见于者只散见于森林法森林法、渔业法渔业法、海洋环境保护法海洋环境保护法等若干零散条文中，没有一部专门的、完整的动物保护的总等若干零散条文中，没有一部专门的、完整的动物保护的总括性法律。因而，人们对于如何保护动物，以及保护动物的括性法律。因而，人们对于如何保护动物，以及保护动物的意义都缺乏整体的清晰印象。对实验动物来说，明确其法律意义都缺乏整体的清晰印象。对实验动物来说，明确其法律地位是解决福利问题先决条件。地位是解决福利问题先决条件。33n（四）动物实验的（四）动物实验的“3
22、R3R”原则原则 n1 1、动物实验替代方法（、动物实验替代方法（3R3R）理论的提出）理论的提出342、3 R的概念及内涵n3R3R是是ReductionReduction、ReplacementReplacement和和RefinementRefinement的简称。的简称。 （1 1） ReductionReduction（减少）是指在科学研究中，使用较少量的（减少）是指在科学研究中，使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的动物能获得更多动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的动物能获得更多实验数据的科学方法。实验数据的科学方法。 35n(2) Replacement(2)
23、Replacement（替代）是指使用其它方法而（替代）是指使用其它方法而不用动物所进行的试验或其他研究课题，达到不用动物所进行的试验或其他研究课题，达到某一试验目的。某一试验目的。n或者说是使用没有知觉的试验材料代替以往使或者说是使用没有知觉的试验材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎动物进行试验的一种科用神志清醒的活的脊椎动物进行试验的一种科学方法。学方法。 36n指在符合科学原则的基础上，通过改进条件，指在符合科学原则的基础上，通过改进条件，善待动物，提高动物福利；或完善实验程序和善待动物，提高动物福利；或完善实验程序和改进实验技术，避免或减轻给动物造成的与实改进实验技术，避免或减轻给动物造
24、成的与实验目的无关的疼痛和紧张不安的科学方法。验目的无关的疼痛和紧张不安的科学方法。 (3) Refinement（优化）（优化）37n3、3 R研究的意义研究的意义 n（1 1）作为提升突破技术壁垒能力的载体和具体体）作为提升突破技术壁垒能力的载体和具体体现现“标尺标尺”，在经济发展和国际贸易中发挥不可替，在经济发展和国际贸易中发挥不可替代的重要作用。代的重要作用。 （2 2）为科学发展提供了新思路和新方法）为科学发展提供了新思路和新方法 n（3 3）开展）开展“3R3R”研究，从保护动物，或是关注动研究，从保护动物，或是关注动物福利，这也是时代发展、社会进步在科学技术上物福利，这也是时代发展、社会进步在科学技术上的一种体现。的一种体现。38
