《分子医学技能：实验六离子交换层析和紫外分光光度法测蛋白质》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子医学技能：实验六离子交换层析和紫外分光光度法测蛋白质（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、http:/ 2：离子交换层析：离子交换层析http:/ 分光光度法及其分类（分光光度法及其分类（比色法比色法比色法比色法） 透光度（透光度（T T）、吸光度（）、吸光度（A A）、光密度（）、光密度（ODOD，D D） Lambert-BeerLambert-Beer定律定律 D = -lg I/I o= -lgT= KCLD = -lg I/I o= -lgT= KCL 分光光度法的概念和相关知识分光光度法的概念和相关知识http:/ I0 0透射光透射光透射光透射光I It t反射光反射光反射光反射光I Ir r被被被被物物物物质质质质吸吸吸吸收收收收的的的的光光光光I Ia ahttp
2、:/ 一、一、紫外吸收法定量分析蛋白质的原理紫外吸收法定量分析蛋白质的原理 1. 1.原理：原理：酪氨酸、色氨酸的苯环共轭双键酪氨酸、色氨酸的苯环共轭双键，ODOD280280 2. 2.优点：优点：简单、快速、样品可以回收简单、快速、样品可以回收 3.3.缺点：缺点：有一定的误差（酪氨酸、色氨酸含量差异）；有一定的误差（酪氨酸、色氨酸含量差异）； 受核酸类物质干扰受核酸类物质干扰 4.4.注意：注意：石英杯的使用石英杯的使用http:/ 蛋白质溶液（牛血清白蛋白溶液）蛋白质溶液（牛血清白蛋白溶液） 生理盐水生理盐水2. 2. 设备设备 可见光分光光度计，比色杯可见光分光光度计，比色杯 移液管
3、移液管二、实验试剂及设备二、实验试剂及设备http:/ 100%键键6、置标尺为吸光度，空对照吸光度为、置标尺为吸光度，空对照吸光度为07、样品置入光路、样品置入光路8、读出数据、读出数据以上步骤重复以上步骤重复2 2次：在波长次：在波长260nm260nm（检测核酸）、（检测核酸）、280nm280nm（检测（检测蛋白质处分别测蛋白质样品的蛋白质处分别测蛋白质样品的ODOD值，每次以检测样品的溶剂作值，每次以检测样品的溶剂作为空对照调零。为空对照调零。 http:/ 1 1、ODOD2802800D0D2602601.51.5时，用时，用Lowry-KalokarLowry-Kalokar公
4、式：公式： 样本蛋白质含量样本蛋白质含量(mg(mgml)=1.5ml)=1.5ODOD2802800.750.75ODOD2602602 2、ODOD280280ODOD2602601.51.5时，用时，用Lamber-BeerLamber-Beer定律计算：定律计算： 样本蛋白质含量样本蛋白质含量(mg(mgml)ml)= =ODOD280280（K KL L） K K：克分子消光系数；：克分子消光系数；L L：溶液厚度：溶液厚度* * 本实验样品为牛血清白蛋白，本实验样品为牛血清白蛋白， K K0.630.63（mlmlcm. mgcm. mg），），L=1cmL=1cmhttp:/ 一
5、、层析法（色谱法）概念一、层析法（色谱法）概念http:/ 经经典典的的层层析析实实验验叶叶绿绿素素的的层层析析分分离离http:/ 1 固定相：固定相：固定不移动的一相，一般是指支持物中固定不移动的一相，一般是指支持物中固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂）或液体物固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂）或液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），阻止所分离质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），阻止所分离的样品向前移动（阻力）的样品向前移动（阻力） 2 2 流动相：流动相： 洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱液。不断洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱液。不断地前移，并带动所分离的样品向前移动（动力）地前移，并带
6、动所分离的样品向前移动（动力）http:/ 3 洗洗 脱：脱： 用洗脱液冲洗层析柱，使样品中不用洗脱液冲洗层析柱，使样品中不同组分得以分离的过程。同组分得以分离的过程。4 4 洗脱曲线：洗脱曲线：以洗脱的体积为横坐标，组分的浓以洗脱的体积为横坐标，组分的浓度为纵坐标作图所得的曲线。度为纵坐标作图所得的曲线。http:/ 薄膜层析薄膜层析柱层析柱层析洗脱液洗脱液样品样品填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱1 1、按固定相基质的形式分类、按固定相基质的形式分类http:/ 2、根据流动相的形式分类、根据流动相的形式分类液相层析：流动相为液相（液液相层析：流动相为液相（液-液层析，液液层析，液-
7、固层析）；固层析）；气相层析：流动相为气相（气气相层析：流动相为气相（气-液层析，气液层析，气-固层析）。固层析）。http:/ 3、按分离原理分类、按分离原理分类吸附层析吸附层析分配层析分配层析凝胶过滤（分子筛层析）凝胶过滤（分子筛层析）离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析 http:/ 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝 、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土 、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 琼脂糖琼脂
8、糖 、 葡聚糖葡聚糖离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、葡聚糖、纤维素、葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的琼脂糖或葡聚糖带配基的琼脂糖或葡聚糖 特殊亲和力特殊亲和力http:/ 离子交换层析离子交换层析（ion-change chromatography）http:/ 1. 原理原理 离离子子交交换换层层析析是是用用离离子子交交换换剂剂（具具有有离离子子交交换换性性能能的的物物质质）作作固固定定相相，利利用用它它与与流流动动相相中中的的离离子子能能进进行行可可逆逆的的交交换换性性质质来来分分离离
9、离离子子型型化化合合物物的的层层析析方法。方法。 即即溶溶液液中中的的离离子子同同离离子子交交换换剂剂上上功功能能基基团团交交换换反应的过程。反应的过程。 广广泛泛用用于于蛋蛋白白质质、氨氨基基酸酸、糖糖类类等等的的分分离离纯纯化化。http:/ 磺酸甲基纤维素磺酸甲基纤维素(SMC)(SMC) 羧甲基纤维素羧甲基纤维素(CMC)(CMC) 磷酸基纤维素磷酸基纤维素(PC)(PC)阴离子交换纤维素阴离子交换纤维素: pH8.6: pH8.6以下分离中性或酸性物质以下分离中性或酸性物质 二乙基胺乙基纤维素二乙基胺乙基纤维素(DEAEC)(DEAEC) 三乙基胺乙基纤维素三乙基胺乙基纤维素(TEA
10、EC)(TEAEC)http:/ 3）离子交换凝胶）离子交换凝胶 分离大分子物质分离大分子物质 葡聚糖（葡聚糖（SephadexSephadex） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAGPAG） 琼脂糖（琼脂糖（SepharoseSepharose）http:/ 4. 操作注意点操作注意点（一）离子交换剂的选择（一）离子交换剂的选择原原则则：根根据据被被分分离离物物质质的的性性质质选选择择同同一一性性质质离离子子交交换换剂剂中中选选用用对对被被分分离离物物质质各各组组分分之之间间结结合合力力差差异异大大的的型型号号交交换换剂剂，以以保保证证通通过过离离子子交交换换层层析析后后能得到比较满意的结果。能得
11、到比较满意的结果。http:/ 避免使样品变性避免使样品变性http:/ (三三) )洗脱剂洗脱剂 原则原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离 子或基团子或基团 改变改变pHpH或离子强度或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱http:/ 5. 应用应用分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子。生物分子。http:/ (每组一柱每组一柱) )原理：原理： 蛋白质的等电点一般低于蛋白质
12、的等电点一般低于8 8，在，在pHpH为为8 8的的弱离子强度溶液带负电荷，可以被阴离子交换树弱离子强度溶液带负电荷，可以被阴离子交换树脂吸附。当增加缓冲液离子强度或阴离子电负性脂吸附。当增加缓冲液离子强度或阴离子电负性时，可以将蛋白质成批量洗脱下来，达到蛋白质时，可以将蛋白质成批量洗脱下来，达到蛋白质浓缩的目的。浓缩的目的。 http:/ 1 1、 阴离子交换剂：纤维素阴离子交换剂：纤维素DE-52DE-52 2 2、 样品：样品： 低浓度蛋白质溶液低浓度蛋白质溶液 3 3、 上样缓冲液：低离子强度缓冲液上样缓冲液：低离子强度缓冲液0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0
13、磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.02mol/L NaCl0.02mol/L NaCl 4 4、 洗脱缓冲液：高离子强度缓冲液洗脱缓冲液：高离子强度缓冲液0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液1mol/L NaCl1mol/L NaClhttp:/ pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液浸泡磷酸盐缓冲液浸泡1 1小时，小时，真空抽气。真空抽气。试剂配制：试剂配制： NaNa2 2HPOHPO4 4.12H.12H2 2O 71.64 g O 71.64 g 定量至定量至1 L 1 L （0.2mol/L Na0.2mol/L Na2 2HP
14、OHPO4 4） NaHNaH2 2PO4.2HPO4.2H2 2O 31.21 g O 31.21 g 定量至定量至1 L 1 L （0.2mol/L NaH0.2mol/L NaH2 2POPO4 4） 91.5ml Na91.5ml Na2 2HPOHPO4 4 8.5ml NaH8.5ml NaH2 2POPO4 4 加水定量至加水定量至1L1L，配成，配成0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液。 1.15g NaCl 1.15g NaCl 1000ml 0.02mol/L pH8.01000ml 0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液
15、，配成磷酸盐缓冲液，配成0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.02mol/L NaCl0.02mol/L NaCl； 58.5g NaCl 58.5g NaCl 1000ml 0.02mol/L pH8.01000ml 0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液，配成磷酸盐缓冲液，配成0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液1mol/L NaCl1mol/L NaCl； 蛋白质溶液：蛋白质溶液：1g 1g 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓磷
16、酸盐缓冲液冲液 100ml100ml，配成，配成10mg/ml 10mg/ml 蛋白质溶液蛋白质溶液。 http:/ 装柱：装柱：关上出口阀门，在层析柱内装入关上出口阀门，在层析柱内装入1/31/3体积的体积的0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐磷酸盐缓冲液缓冲液0.02mol/L NaCl0.02mol/L NaCl，然后用一根玻璃棒将纤维素导入层析柱，不要，然后用一根玻璃棒将纤维素导入层析柱，不要带入气泡。然后打开出口阀门，保持带入气泡。然后打开出口阀门，保持1.5ml/min1.5ml/min的流速，使纤维素堆积。的流速，使纤维素堆积。待液面接近纤维素面时进
17、行平衡（保持不要干柱）。待液面接近纤维素面时进行平衡（保持不要干柱）。平衡：平衡：1 1倍纤维素体积的倍纤维素体积的0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.02mol/L NaCl0.02mol/L NaCl用玻棒引导沿壁缓慢倒入柱内，尽量勿将已堆积好的纤维素冲起。出口流用玻棒引导沿壁缓慢倒入柱内，尽量勿将已堆积好的纤维素冲起。出口流速可保持在速可保持在1.5ml/min1.5ml/min。加入样品：加入样品：取待浓缩取待浓缩蛋白质溶液蛋白质溶液2ml2ml在在752752分光光度计检测溶液的分光光度计检测溶液的ODOD280280读数读数（用平
18、衡液做溶剂对照调零）。（用平衡液做溶剂对照调零）。等步骤等步骤2 2的平衡结束后，待平衡液下降接的平衡结束后，待平衡液下降接近柱面时，将出口阀门关闭，然后将近柱面时，将出口阀门关闭，然后将50ml50ml的的蛋白质溶液蛋白质溶液小心加入柱内（保小心加入柱内（保护柱面），打开阀门，保持护柱面），打开阀门，保持1.5ml/min1.5ml/min的流速，使蛋白质溶液缓慢进入柱的流速，使蛋白质溶液缓慢进入柱内。内。平衡：平衡：两倍柱体积的两倍柱体积的0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.02mol/L NaCl0.02mol/L NaCl 流流过柱，
19、洗杂质。过柱，洗杂质。洗脱：洗脱：待平衡液下降接近柱面时，关上出口阀门，加入待平衡液下降接近柱面时，关上出口阀门，加入0.02mol/L pH8.00.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液1mol/L NaCl1mol/L NaCl洗脱蛋白，打开阀门，以洗脱蛋白，打开阀门，以1.5ml/min1.5ml/min的流速洗的流速洗脱，并开始用试管接流出溶液，收集脱，并开始用试管接流出溶液，收集5-85-8管，每管管，每管3ml3ml。用。用752752分光光度计分光光度计检测每管溶液的检测每管溶液的ODOD280280读数读数（用洗脱液做溶剂对照调零），（用洗脱液做溶剂对照调零），待待ODOD280280读数从峰读数从峰值降为值降为0.020.02时，停止洗脱，选取时，停止洗脱，选取ODOD280280读数最高的洗脱液为浓缩蛋白，计算读数最高的洗脱液为浓缩蛋白，计算浓缩倍数，作洗脱曲线。浓缩倍数，作洗脱曲线。
