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1、2.3 动物的克隆第一课时思考：思考：离体的植物细胞和组织可以通过组织培离体的植物细胞和组织可以通过组织培养技术克隆成完整的植株，那么动物细胞和组养技术克隆成完整的植株，那么动物细胞和组织能否也进行同样的克隆？织能否也进行同样的克隆？不能。动物细胞的全能性受到限制，到现在为止将离体的动物细胞直接克隆成个体还很困难，所以动物细胞和组织不能进行与植物一样的个体克隆。动物克隆的动物克隆的技术基础技术基础： 动物细胞、组织培养动物细胞、组织培养（1）离体的动物细胞能否正常地生活、表现出正常的生命活动？原理：只要条件适合就能表现出正常的生命活动，如细胞的分裂、生长等。动物细胞以有丝分裂的方式进行增殖。（
2、2）是不是所有的动物细胞都能在离体的情况下表现出生命活动？材料：越是幼嫩的细胞越容易培养并表现出正常的生命活动，因此在细胞培养时一般选择用动物胚胎或出生不久的幼龄动物的细胞。2、适宜的环境条件、适宜的环境条件无菌、无毒环境：无菌、无毒环境：加抗生素，定期更换培养液加抗生素，定期更换培养液适宜的温度和适宜的温度和pH值：值：温度：温度：36.50.5 pH值：值：7.2-7.4适宜的气体环境：适宜的气体环境：O2和和CO2（95%空气和空气和5%CO2）适宜的渗透压等适宜的渗透压等动物细胞培养动物细胞培养条件条件成分：无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素和动物血清等1、含全部营养物质的培养液、含全部营
3、养物质的培养液胰蛋白酶胰蛋白酶单细胞悬液单细胞悬液传入特殊培养液传入特殊培养液中进行中进行原代培养原代培养原代培养物原代培养物将原代细胞将原代细胞分装到多个分装到多个卡式瓶中进卡式瓶中进行行传代培养传代培养离体动物细胞的生长特性：离体动物细胞的生长特性：（1 1）贴壁生长： 悬浮液中分散的细胞紧贴培养瓶内壁才能生长。（2 2）接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂。（3 3）正常的生命活动： 生长、分裂、有规律的衰老、死亡等生命活动现象。细胞贴壁过程细胞贴壁过程 细胞在细胞在贴壁生长贴壁生长过过程中程中, ,随着细胞分裂随着细胞分裂, ,数数量不断增加量不断增加, ,
4、最后最后形成形成一个单层一个单层, ,此时细胞间此时细胞间相互接触相互接触, ,细胞分裂和细胞分裂和生长停止生长停止。接触抑制如何界定原代培养和传代培养？如何界定原代培养和传代培养？为什么要传代培养？为什么要传代培养？细胞细胞悬浮液悬浮液转入特殊培养液转入特殊培养液首次培养首次培养换瓶后培养换瓶后培养原代培养原代培养传代培养传代培养为什么？为什么？如果不进行分离培养，到一定时期培养的细胞就会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。当细胞分裂贴满整个平面后，会产生接触抑制，细胞就不能再分裂增殖。原代培养原代培养传传代代培培养养原代培养物原代培养物细胞系：细胞系：可可传代传代的细胞。的
5、细胞。原代培养物在原代培养物在首次传代首次传代时就成为细胞系。时就成为细胞系。能连续能连续培养的培养的 连续细胞系连续细胞系不能连续不能连续培养的培养的 有限细胞系有限细胞系（异倍体核型细胞）（异倍体核型细胞）（二倍体细胞）（二倍体细胞）恶性细胞系，异体致瘤性恶性细胞系，异体致瘤性不死性，保留接触抑制，不致癌不死性，保留接触抑制，不致癌2、细胞株： 通过一定的通过一定的选择或纯化选择或纯化方法，从方法，从原代培养原代培养物或细胞系物或细胞系中获得的中获得的具有特殊性质具有特殊性质的细胞系。的细胞系。 如：单抗细胞株如：单抗细胞株 细胞株一般具有恒定的染色体组型、同功细胞株一般具有恒定的染色体组
6、型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等。酶类型、病毒敏感性和生化特性等。连续细胞株：可连续连续细胞株：可连续多次传代多次传代的细胞株。的细胞株。有限细胞株：传代有限细胞株：传代次数有限次数有限的细胞株的细胞株细胞系：细胞系：泛指可传代的细胞。泛指可传代的细胞。细胞株细胞株: : 具有特殊性质的细胞系。具有特殊性质的细胞系。从动物胚胎或幼龄动物组织切片中取小片样品转入特殊培养液原代培养分装到多个卡氏瓶中传代培养单个细胞悬浮液CO2培养箱中培养箱中保温培养保温培养细胞系机械消化或胰酶消化（胰蛋白酶）动物细胞培养过程动物细胞培养过程 原代培养物选择或纯化选择或纯化细胞株细胞株1 1、动物细胞培养：体
7、外培养分散后的体外培养分散后的单个单个细胞，细胞，使其得以生存，并保持生命活动现象。使其得以生存，并保持生命活动现象。像体内一样呈现一定的像体内一样呈现一定的组织特性组织特性。2 2、动物组织培养：体外培养：体外培养动物组织，动物组织，使使其维持生活状态或生长特性。可以伴随组其维持生活状态或生长特性。可以伴随组织分化，但长期培养一般织分化，但长期培养一般只能保留单一类只能保留单一类型细胞型细胞，最终成为，最终成为细胞培养细胞培养。3 3、动物器官培养：体外培养体外培养动物器官原基、动物器官原基、部分或整个器官，部分或整个器官，使之得以保存、生长，保使之得以保存、生长，保持器官的结构、功能及分化
8、能力。持器官的结构、功能及分化能力。 组组织织培培养养二、克隆培养法（细胞克隆）1、概念：把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。2、特点：遗传性状均一、表现的性状相似，便于研究异质性细胞系克隆培养纯系（克隆）3、最基本要求: 保证所建成的克隆来源于单个细胞4、适合于克隆的细胞：群体细胞群体细胞 单细胞单细胞无限细胞系、转化或肿瘤细胞无限细胞系、转化或肿瘤细胞 原代细胞、有限细胞系原代细胞、有限细胞系对环境有较大对环境有较大适应适应范围和具有较强独立范围和具有较强独立生存生存能力的细胞能力的细胞5.提高细胞克隆形成率的措施选择适宜的培养基选择适宜的培养基添加血清
9、（添加血清（胎牛血清胎牛血清） 以以滋养细胞滋养细胞（如经射线照射本身失去增殖力的（如经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞小鼠成纤维细胞）支持生长）支持生长激素（激素（胰岛素等胰岛素等）刺激）刺激使用使用COCO2 2培养箱培养箱调节调节pH pH pHpH值：值：7.2-7.47.2-7.4保证细胞顺利的生长增殖维持培养液的pH6、细胞克隆的主要用途：从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。用于研究细胞的遗传规律和生理特性。6.1951年，海拉细胞系的建成。 1.18851.1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。2.1903年，皮肤及白细胞在腹
10、水及血清中存活一个月，且观察到细胞分裂。 3.19073.1907年，蛙胚神经管在蛙淋巴液中悬浮培养，成功看到神年，蛙胚神经管在蛙淋巴液中悬浮培养，成功看到神经末端的阿米巴运动。经末端的阿米巴运动。4.1912年，鸡胚浸出液对鸡胚心脏组织块进行原代培养和传代培养。 5.19435.1943年，获得长期培养细胞系（可连续传代）和细胞克隆。年，获得长期培养细胞系（可连续传代）和细胞克隆。“组织培养”一词产生真正的组织培养开始；创立了悬浮培养法成功进行了传代培养；发明了卡氏瓶；标志着组织培养工作进入全新阶段三、动物组织培养技术的发展三、动物组织培养技术的发展练习练习1 1、用于动物细胞培养的组织和细
11、胞大都取自胚胎、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞是这样的组织细胞 （ ） A A、容易产生各种变异、容易产生各种变异 B B、具有更强的全能性、具有更强的全能性 C C、取材十分方便、取材十分方便 D D、分裂增殖的能力强、分裂增殖的能力强D D2 2、用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是正确的是A A都需用都需用COCO2 2培养箱培养箱 B B都须用液体培养基都须用液体培养基 C C都要在无菌条件下进行都要在无菌条件下进
12、行 D D都可体现细胞的全能性都可体现细胞的全能性3 3、动物细胞克隆是指动物细胞克隆是指 A A一个单细胞培养成一个新的细胞群的技术一个单细胞培养成一个新的细胞群的技术 B B一个重组细胞经分裂、分化发育成一个动物个体的一个重组细胞经分裂、分化发育成一个动物个体的技术技术 C C几个同种动物的细胞培养成一个新的细胞群的技术几个同种动物的细胞培养成一个新的细胞群的技术 D D一个卵裂球经胚胎分割发育成四个细胞群的技术一个卵裂球经胚胎分割发育成四个细胞群的技术CA4 4、某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞准备对某种动物的
13、肝肿瘤细胞( (甲甲) )和正常肝细胞和正常肝细胞( (乙乙) )进行动物细胞培养。下列说法正确的是进行动物细胞培养。下列说法正确的是 ( () )A.A.在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理胃蛋白酶处理B.B.细胞培养应在含细胞培养应在含5%CO5%CO2 2的恒温培养箱中进行，的恒温培养箱中进行，COCO2 2的的作用是刺激细胞的呼吸作用是刺激细胞的呼吸C.C.甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象停止增殖的现象D.D.仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒仅用该培养液也能用来
14、培养乙肝病毒C5.5.下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是 ( () )A.A.培养中的人效应培养中的人效应T T细胞能产生单克隆抗体细胞能产生单克隆抗体B.B.培养中的人培养中的人B B细胞能够无限地增殖细胞能够无限地增殖C.C.人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株D.D.用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞D诱导方式物理法：化学法：生物法：灭活仙台病毒聚乙二醇电刺激三、动物细胞融合技术及其应用1 1、定义：细胞融合指两个或多个细胞融合成、定义：细胞融合指两个或多个细胞融合成一个细胞的现象
15、一个细胞的现象2 2、优点、优点：克服了远缘杂交不亲和的问题：克服了远缘杂交不亲和的问题灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞细胞融合可以在基因型相同或不同的细胞间进行，细胞融合可以在基因型相同或不同的细胞间进行，其中基因型不同的细胞间的融合就是其中基因型不同的细胞间的融合就是细胞杂交细胞杂交由于细胞杂交中染色体容易丢失，利用杂交细胞检由于细胞杂交中染色体容易丢失，利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物（蛋白质）减少测特定染色体丢失与特定基因产物（蛋白质）减少的对应关系可以进行的对应关系可以进行基因定位基因定位主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用
16、途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较单克隆抗体动物细胞融合的重要应用1.什么是抗体？2.什么是单克隆抗体？3.如何制备单克隆抗体？在特定的培养基中培养在特定的培养基中培养筛选杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞克隆上述杂交瘤细胞克隆上述杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞筛选产生特定抗体的筛选产生特定抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞（抗原（抗原抗体反应）抗体反应）（1 1）给小鼠抗原注射的目
17、的是什）给小鼠抗原注射的目的是什么？么？诱导小鼠体内的特异性免疫应答，诱导小鼠体内的特异性免疫应答，分化出浆细胞。分化出浆细胞。（2 2）两次筛选的目的相同吗？）两次筛选的目的相同吗？不同，第一次筛选是为了筛选杂不同，第一次筛选是为了筛选杂交瘤细胞，第二次筛选是做抗体交瘤细胞，第二次筛选是做抗体检验，筛选产生特异性抗体的细检验，筛选产生特异性抗体的细胞。胞。（3 3）最后培养有几种方案？）最后培养有几种方案？两种，体内培养和体外培养。两种，体内培养和体外培养。（4 4）如何提取单克隆抗体？）如何提取单克隆抗体？3、杂交瘤细胞制备单抗的最大优点可以从特异性抗原成分比例极少的抗原混合物中获得单抗4
18、 4、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用: :疾病的诊断、治疗和预防。单抗可作为特异探针，研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及其功能。4 4、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用: :实例:各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断；在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士,能识别“自己”与“异己”，一旦发现致病因素便与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。动物的克隆繁殖动物的克隆繁殖理论上，分化的动物细胞能像植物细胞一样脱分化、再分化成一个动物体吗？动物细胞实际上表现出全能性的情况如何呢？1
19、1、动物细胞全能性的表现程度：、动物细胞全能性的表现程度：三、动物的克隆繁殖三、动物的克隆繁殖受精卵二分裂球细胞多能细胞单能细胞已分化细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能（全能性）具有全能性，能发育成完整个体具有分化出多种组织细胞的潜能只分化为一种细胞不再分化为其他细胞，甚至终生不再分裂受精卵 胚胎干细胞多能干细胞 单能干细胞 体细胞在动物的发育过程中，细胞的发育潜能逐渐变窄。1 1、动物细胞全能性的表现程度：、动物细胞全能性的表现程度：低等动物细低等动物细胞的全能性胞的全能性一般比较容一般比较容易体现。易体现。癌细胞仍能癌细胞仍能逆转为正常逆转为正常细胞。细胞。 无论是分化还是癌变，变化的都
20、是表现无论是分化还是癌变，变化的都是表现型，型，基因组成的完整性并没有改变基因组成的完整性并没有改变。三、动物的克隆繁殖三、动物的克隆繁殖（二）动物难以克隆的根本原因（二）动物难以克隆的根本原因基因已经进行了选择性表达，使得细胞中合成了专一基因已经进行了选择性表达，使得细胞中合成了专一的蛋白质，即动物细胞已经发生了分化，基因组中的的蛋白质，即动物细胞已经发生了分化，基因组中的基因活动很不完全，不能像受精卵那样发挥细胞的全基因活动很不完全，不能像受精卵那样发挥细胞的全能性。能性。动物基因组动物基因组一类基因是维持生存的，各种一类基因是维持生存的，各种细胞中都处于活动状态细胞中都处于活动状态另一类
21、基因随着组织器官和发育阶另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。段不同而选择性表达。四、核移植和动物的克隆四、核移植和动物的克隆去去去去 核核核核注注注注 核核核核重组细胞重组细胞重组细胞重组细胞1.核移植：利用一个细胞的细胞核（供体核）,来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”（重组细胞），使发育成一个新的个体。3 3、细胞核移植实验和动物的克隆繁殖：、细胞核移植实验和动物的克隆繁殖：胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞。核移植核移植肠上皮细胞肠上皮细胞囊胚囊胚1%1% 2%2%紫外线紫外线50%50%囊胚囊胚核移植核移植囊胚囊胚卵细胞卵细胞.说出说出“多莉多莉”的产生过程
22、的产生过程.多莉的成功证明了什么？多莉的成功证明了什么？.多莉羊的培育用到了哪些多莉羊的培育用到了哪些细胞工程技术细胞工程技术? ?动物细胞、组织培养；胚胎移植；核移植动物克隆动物克隆卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程融合后的卵细胞融合后的卵细胞3.体细胞克隆羊的培育成功，证明了：高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源的细胞核）发育的作用。多莉和提供细胞核的母
23、羊表现型有差异的原因：多莉和提供细胞核的母羊表现型有差异的原因： 基因突变基因突变 细胞质基因表达细胞质基因表达 受环境的影响受环境的影响多莉长得像哪只羊？它们完全一样吗？克隆羊成功的部分原因：经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核DNADNA被重新编排，细胞开始表达自己的基因。被重新编排，细胞开始表达自己的基因。重组卵细胞最初分裂时虽然复制了重组卵细胞最初分裂时虽然复制了DNADNA，但，但基因的转录并未开始基因的转录并未开始供体核供体核DNADNA丢失来源于乳腺细胞的调节蛋白丢失来源于乳腺细胞的调节蛋白1、有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育2、对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩群有重要意义3、降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率应用：
