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1、第五章 糖基磷脂酰肌醇化蛋白及有关糖复合物蛋白质锚定在膜表面的新方式还记得脂筏吗？膜蛋白的引渡船脂筏的组成成分n脂筏（lipid raft）是质膜上富含鞘糖脂、鞘糖脂、GPI蛋白和胆固醇蛋白和胆固醇的微结构域（microdomain）。蛋白质与膜表面的结合方式1,2：整合蛋白3,4： 锚定蛋白5,6： 外周蛋白糖基磷脂酰肌醇化蛋白一类由蛋白质、脂质和糖链三者共价结合的复杂的糖复合物糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)化蛋白。GPI蛋白的分布1985年以锥虫表面抗原为例阐明其结构GPI蛋白广泛存在于真核生物，包括原生动物、酵母、粘菌、无脊椎动物等以
2、及哺乳动物的血液、肝、肾、胎盘和脑等组织。目前已发现近百种GPI蛋白，包括多种水解酶、细胞粘附分子、哺乳动物细胞表面抗原和受体、原虫抗原、补体调节蛋白、朊病毒等。GPI化蛋白的种类和分布举例补体调节蛋白类粘附分子类酶类许多细胞和非造血细胞反应性溶血膜抑制物(CD59)许多细胞和非造血细胞衰变加速因子（CD55, DAF)神经细胞 、胶质细胞神经粘附因子许多造血细胞CD58 (LFA-3)哺乳动物组织5-核苷酸酶人及羊红细胞、电鳗电器管乙酰胆碱酯酶胎盘、肠等哺乳动物组织碱性磷酸酶GPI化蛋白的基本结构蛋白质：C末端残基与GPI锚相连，通常为Gly、Ala、Ser、Cys、Asp、Asn。有些本身
3、是糖蛋白。磷酸乙醇胺桥糖链: 接在肌醇磷酸的6位共有的四糖结构：Man-Man-Man-GlcN肌醇磷酸插入脂双层内的长脂肪链：脂酰甘油或甘油醚；极个别被神经酰胺取代。GPI锚GPI化蛋白的结构要点结构组成脂肪链与甘油的连接方式糖链的修饰变化糖链与肽链的连接极个别脂酰甘油被Ceramide代替其它GPI有关糖复合物存在于一些寄生性原虫表面：脂肽磷酸聚糖 (LPPG)糖肌醇磷酸聚糖 (GIPL)脂磷酸聚糖 (LPG)糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)三种致命的原虫布氏锥虫（ Trypanosoma brucei ）引起的非洲昏睡病在撒哈拉以南的非洲地区每年感染万人，如果得不到及时治疗，往
4、往会“杀人于昏睡之中”。枯氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起南美锥虫病，它由锥蝽叮咬人后排泄的粪便传播，在拉美地区每年导致万人死亡。硕大利什曼原虫（Leishmania major）引起的黑热病蔓延大洲、多个国家，是公共卫生的严重威胁。 锥虫(Trypanosomes)和昏睡症(Sleeping Sickness )非洲昏睡病锥虫寄生之谜锥虫本身对抗体和补体高度敏感它们却生活在布满免疫细胞的血液系统它们可引发强烈的免疫反应然而他们可以在同一宿主体内繁殖生活一年或更长，直至宿主死亡the GPI anchorGPI锚的加工是在翻译后立即添加的蛋白质的C端疏水区作为信号肽，可被切除然
5、后以转肽反应被糖脂取代，形成GPI化蛋白锥虫表面的抗原变化GPI锚可在锥虫表面形成高度密集的排列锥虫表面于是形成由可锥虫表面于是形成由可变表面糖蛋白（变表面糖蛋白（Variant Surface Glycoproteins, VSGs）组成的致密外壳这种外壳与利氏曼原虫表面的脂磷（酸）聚糖 相当锥虫的基因组与VSG锥虫为单细胞真核生物，其染色体为二倍体。布氏锥虫含有100个小染色体和20个较大染色体，编码VSG的基因在各种染色体上都有。锥虫基因组中的6-10%编码VSGs (more than 1000 genes)根据在染色体上的位置分为内部VSG基因和端粒VSG基因，VSG基因的表达总是在
6、端粒的表达位点（Expression site, ES）上进行。表达位点有多个，但一定时期只激活一个。在特定时期只有一种VSG基因表达，而其他999种都被关闭VSG基因表达的转换以很低几率发生，如果宿主产生了对前一种VSG的抗体，则新的表达型就会迅速扩增起来What is the advantage of expressing a single VSG?How is expression controlled?What mechanisms can you think of by which a cell could control gene expression and protein ab
7、undance?Antigenic variation所有的VSGs都是65 kDa的 GPI蛋白，在细胞表面呈二聚体蛋白的外端高度可变，但Cys的位置保守其他非可变蛋白如转铁蛋白受体或己糖转运体隐藏在表面外壳内部Antigenic variation锥虫基因组中有1000个基因编码表面抗原但每个特定时期只有一个VSG基因被表达启动子调节？基因的位置？其他机制？转座效应Transposition of VSG genes occurs by intra- or intermolecular recombinationThis explains switching but not really
8、why one gene is active and all the others are silent碱基的稀有修饰染色质修饰调控基因表达实际上发现失活和激活部位的一种特殊修饰（标记为J (b-glucosyl-hydroxy-methyluracil)有差异But is this a chicken or an egg?GPI抗原的“漂移”？在非洲锥虫病病人的红细胞膜上发现了锥虫的一种GPI蛋白表面抗原！GPI锚介导蛋白质在细胞表面转移细胞表面工程许多细菌、寄生虫毒性蛋白也是GPI蛋白，可把毒素转移给宿主细胞。如何抑制？GPI化蛋白的生物合成核糖体合成新生肽链内质网腔N-端去除1530aa
9、信号肽C-端去除1530个aa肌醇磷酸GPI锚GPI化蛋白细胞质逐个添加糖基磷酸乙醇胺运往质膜表面Biosynthetic pathway of GPI-anchorProteolytic cleavage at w siteAddition of preformed GPI anchor at C-terminus through an amide linkageto the ethanolamine of the GPI anchorProtein can be released by action of cell surface phospholipaseGPI = glycosylph
10、osphatidylinositol: lipid modification that anchors proteins to the cell surfaceGPI化标记GPI化蛋白运送到质膜表面的方式小窝蛋白GPI化蛋白的降解磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2) PLCIP3DAGPKCCa2+GPI蛋白PLCDAGGPI化蛋白的生物功能免疫及神经细胞活化：T细胞活化神经细胞表面的N-CAM和CNTF受体与信号转导：脂筏作为受体叶酸受体墨素转铁蛋白(melanotransferrin)GPI蛋白锚定的优势可能赋予膜蛋白的较大的横向运动性通过激活脂酶介导蛋白质的释放和分泌靶向膜蛋白使其定位于细
11、胞表面特定的区域通过内吞作用调节细胞表面蛋白质的周转参与受体介导的传递跨膜信号GPI锚定蛋白的鉴定水解细胞膜表面蛋白的GPI锚细菌中提取的PI-PLC锥虫中的GPI-PLC血清中GPI-PLD氢氟酸稀亚硝酸Western blot鉴定GPI裂解位点Enzymatic and chemical cleavage sites of GPI anchors useful in identifying GPI- anchored membrane proteins. (GPI-PLC) GPI-specific phospholipase C; (GPI-PLD) GPI-specific phosp
12、holipase D; (HF) hydrogen fluoride; (HONO) nitrous acid; (NaOH NH3) mild alkali treatment with either sodium hydroxide or ammonia; (PI-PLC) phosphatidylinositol-specific phospholipase C.GPI化蛋白与疾病和药物设计阵发性夜间血红蛋白尿症 (PNH)GPI化蛋白与细胞表面工程GPI化蛋白与抗感染药物设计通过抑制GPI锚结合蛋白从膜上释放而抑制病原毒素向宿主的转移GPI蛋白与细胞表面工程体外GPI化蛋白可从一个细胞
13、转移到另一个细胞表面细胞表面工程的步骤：把目的蛋白cDNA与GPI结合必需的C-端肽cDNA融合表达，即可形成新的GPI化蛋白。提取蛋白质与靶细胞保温，GPI蛋白即可自动组装到靶细胞上。细胞表面工程的优点制备较大量的GPI化蛋白可在一些难以基因转染的细胞表面表达目的蛋白可对细胞表面蛋白进行修饰多种GPI蛋白可以同时结合在一个细胞表面阵发性夜间血红蛋白尿症 (PNH)Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) ：成人发病率1/105106。是一种获得性溶血性贫血，其病因是细胞膜上缺失十几种GPI化蛋白，如作为补体调节蛋白的衰变加速因子(DAF)和补体C8的
14、结合蛋白等，使红细胞对补体敏感性增加而产生红细胞溶血。缺陷在于GPI生物合成的第一步，即GlcNAc向磷酸肌醇转移这一步，相关的基因是磷脂酰肌醇聚糖A(phosphatidylinositolglycan class A, PIG-A)基因。Haemoglobinuria: Urine passed 7am is dark containing a large amount of free haemoglobin which leaks out of PNH red-cells as they burst. The urine generally clears during the day.P
15、NH患者的血尿症状PNH机制PNH的治疗骨髓移植补体抑制剂：Alexion制药公司(Cheshire, CN, USA)获得了美国食品药品管理局 (FDA)批准使用Soliris (eculizumab)治疗PNH患者以降低溶血。 扩增正常细胞：生长因子？25% of PNH patients survive 25 years - one half of these go on to spontaneous remission将正常人红细胞释放的囊泡与PNH患者红细胞共置，回流。造血干细胞基因治疗思考题GPI蛋白的结构组成？GPI蛋白的生物合成过程？GPI蛋白在细胞表面的锚定方式与糖蛋白相比有什么优势？GPI蛋白的分布和主要生物功能GPI蛋白在生物工程中的应用
