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1、LOGO新疆驴皮肤组织新疆驴皮肤组织RNA的提取与检测的提取与检测 姓姓 名：热孜万古丽名：热孜万古丽.米吉提米吉提 班班 级：动医（级：动医（132） 学学 号：号：2011108212指导老师：王艳萍指导老师：王艳萍塔里木大学塔里木大学13届毕业生论文答辩届毕业生论文答辩1动医132热孜万古丽。米吉提毕业论文1LOGO目的及意义目的及意义1材料与方法材料与方法2结果结果3结论结论4汇报内容汇报内容2动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO目的和意义目的和意义 目的： 用Trizol法，从健康成年的新疆驴不同部位皮肤组织提取的RNA，纯度和完整性检测，为后
2、续有关新疆驴皮肤组织分子生物学方面的研究基础。 意义： 阿胶为我国药、食两用传统中药材，使用马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮，浓缩制成。阿胶主要功能是有补血，滋阴润燥，止血等。驴皮是生产阿胶的唯一原料。因此，从驴皮肤组织中获取纯度高、完整性好的总 是结合现代生物学的知识，来提高驴皮的利用率和开发新的阿胶生产途径等研究方面的基础。 3动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO材料与方法材料与方法2.1.1 实验动物 阿克苏驴屠宰场的待屠宰的健康驴。2.1.2 样本的采集与处理 采样部位剃毛消毒后，用取皮器采集1cm2的皮肤组织，装入1.5mL的冻存管，迅速投入液氮
3、罐中进行速冻保存。2.1.3 主要实验仪器 超净工作台,高速冷冻离心机,高压锅, 恒温干燥箱，微量紫外分光光度计，可调微量移液枪，电泳仪，凝胶样品梳，琼脂糖凝胶成像仪,研钵,枪头盒,1.5ml离心管等。4动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO2.1.4 主要的实验试剂 Tirzol分装瓶,75%乙醇,0.1%DEPC水，氯仿，异丙醇，液氮,TBE，EB，超纯水；2.1.5 实验试剂的配制 1)0.1%DEPC水的配置： 2）无RNA酶灭菌水： 3）75%乙醇: 4）琼脂糖凝胶的配置： 5）电泳缓冲液（5TBE）的制备：5动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽
4、。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO2.2.1实验前的准备玻璃器皿180的高温下干烤4h或更长时间。塑料器皿用0.1% DEPC水浸泡12小时后，高压灭菌后备用。凡RNA提取用到的试剂，必须用无RNA 酶灭菌水配置。实验前一天用84消毒液对实验室进行彻底消毒；用75%酒精擦拭超净工作台面，并开紫外灯照射2h。操作前再次用75%酒精擦拭台面，操作人员必须戴无RNA酶手套、口罩和帽子，操作时经常更换一次性手套和口罩。6动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO2.2.2 Trizol法提取RNA的操作步骤1)液氮研磨：向研钵中加入液氮降温研钵3次。加入液氮，在
5、液氮中将组织敲碎后用力研磨，待组织变软时，再加少量液氮，研磨成粉末状，按每50-100mg组织加入1.5mlTrizol，继续研磨后轻轻混匀，转移入1.5ml离心管。2）室温裂解：室温放置5min，使其充分裂解。3）4，12000rpm离心10min，取上清液于另一离心管。室温放置5min，使其充分裂解。7动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO4）按300ul氯仿/1.5mLTrizol加入氯仿，盖紧离心管，漩涡振荡混匀离心管15秒，室温放置5分钟。5）4,12000rpm离心15min 。6）管子倾斜45度，用移液管吸取上层水相，至另一新的离心管中。按0
6、.75ml异丙醇/1.5mLTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。7）4,12000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。8）按1mLTrizol加入1.5mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。8动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO 4,7500rpm离心5min。此步骤重复两次。9）小心弃去上清液，再用小离心机离心数秒，用20ul的枪移走剩余的水，然后室温或真空干燥5-10分钟。10）用无酶水20uL吹打几次，溶解RNA，并用封口胶封住EP管的口，必要时可55-60水溶10-15分钟。2.3 RNA的纯度检测 取1ul样品,用
7、微量紫外分光光度计测定浓度和吸光度。2.4 RNA完整性鉴定 用1的琼脂糖凝胶电泳，来检测所提总RNA的质量。9动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO3.3.结果结果 由表一可以看出，四岁新疆驴皮肤组织不同部位RNA浓度在239.6396.8ng/L，OD260/280值在1.821.87之间，OD260/230值在1.952.20之间，表明本次实验所提取的RNA的纯度较好，蛋白质、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等杂质的含量低，可以做cDNA和荧光定量等后续实验。 Sample ID Nucleic Acid Nucleic Acid Conc./ng/lConc
8、./ng/lA260A260A280A280 260/280260/280 260/230260/230 背部396.88.419 4.505 1.869 2.20腿部239.65.3892.909 1.852 2.11颈部335.76.9923.889 1.815 2.05 腹部338.77.0673.906 1.826 1.95 表一表一 四岁新疆驴皮肤组织不同部位RNA浓度检测结果3.1 新疆驴皮肤组织RNA浓度检测10动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO3.2 提取RNA的电泳分析图 28s RNA18s RNA5s RNA28s RNA18s
9、RNA5s RNA28s RNA18s RNA5s RNA18s RNA28s RNA5s RNA 图1 四岁驴腹部皮肤组织 图2 四岁驴腿部皮肤组织图3 四岁驴颈部皮肤组织 图4 四岁驴背部皮肤组织11动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO结果表明，RNA完美提出来的话应该是三条带：28S rRNA，18S rRNA和5S rRNA。在琼脂糖凝胶电泳图1和图3看到28S rRNA条带不清晰，比18S rRNA条带暗，说明完整性不太好。在图2和图4上可以清晰地看到28S和18S rRNA，说明RNA完整性和质量较好。5S基本很模糊。12动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO4 4结论结论 本实验结果表明在RNA提取整个实验过程中，必须在低温，无酶条件下快速进行。本实验用Trizol法，从健康成年的新疆驴不同部位真皮组织提取的RNA，纯度和完整性均比较好，可以进行后续的基因荧光定量和基因克隆等分子生物学实验。13动医动医132热孜万古丽。热孜万古丽。米吉提毕业论文米吉提毕业论文1LOGO感谢各位指导老师的指正感谢各位指导老师的指正谢谢大家谢谢大家14动医132热孜万古丽。米吉提毕业论文1
