光谱分析法刘芸

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1、仪器分析方法分类仪器分析方法分类：2. 电化学分析法电化学分析法: 依据物质的电化学性质及其变化依据物质的电化学性质及其变化4. 质谱法、热分析法、放射化学法等质谱法、热分析法、放射化学法等非光谱法非光谱法 （折射法，浊度法，旋光法）（折射法，浊度法，旋光法）（不以光的波长为特征讯号）（不以光的波长为特征讯号）光谱法光谱法分子光谱法分子光谱法 UV/Vis,IR,MFS,MPS原子光谱法原子光谱法 AAS,AES, AFS（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过检测光谱的波长以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）和强度来进行定性和定量的方

2、法）光光学学分分析析法法1. 光学分析法光学分析法: 基于电磁辐射与物质的相互作用基于电磁辐射与物质的相互作用3. 色谱法色谱法: 气相色谱法、液相色谱法气相色谱法、液相色谱法1第三章第三章 光谱分析法光谱分析法（ Spectrum Analysis ）2本章提要本章提要第一节第一节 光谱分析法概论光谱分析法概论第二节第二节 紫外紫外/ /可见光吸收光谱法可见光吸收光谱法!光谱分析法及其特点光谱分析法及其特点!电磁辐射的基本性质电磁辐射的基本性质!电磁辐射的特性电磁辐射的特性!光谱分析法的分类光谱分析法的分类!分子光谱法分子光谱法!基本原理基本原理!紫外紫外/可见分光光度计构造可见分光光度计构

3、造!紫外紫外/可见分光光度计类型可见分光光度计类型3第三节第三节 分子发光光谱法分子发光光谱法! 光致发光光致发光! 分子荧光和磷光光谱基本原理分子荧光和磷光光谱基本原理! 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素! 分子荧光光谱仪分子荧光光谱仪! 分子荧光光谱法的应用分子荧光光谱法的应用! 磷光光谱法磷光光谱法! 化学发光法化学发光法4本章提要本章提要第一节第一节 光谱分析法概论光谱分析法概论5是电磁辐是电磁辐射按照波射按照波长的有序长的有序排列。排列。光谱光谱光谱光谱(spectrum)(spectrum)：第一节第一节 光谱分析法概论光谱分析法概论6一、一、光谱分析法及其特点光谱分析法及其特

4、点 光光谱谱分分析析 (spectral analysis)： 对对物物质质发发射射辐辐射射能能的的能能谱谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。 电磁辐射范围：电磁辐射范围：射线（射线（10-10m）无线电波（）无线电波（103m）所有范围；所有范围； 相相互互作作用用方方式式：发发射射、吸吸收收、反反射射、折折射射、散散射射、干干涉涉、衍射等；衍射等； 应应用用：光光谱谱分分析析法法在在研研究究物物质质组组成成、结结构构表表征征、表表面面分分析析等等方方面具有其他方法不可区代的地位；面具有其他方法不可区代的地位；7（1 1）能源

5、提供能量；）能源提供能量；（2 2）能量与被测物之间的相互作用；）能量与被测物之间的相互作用；（3 3）产生信号。）产生信号。 基本特点：基本特点：（1 1）所有光分析法均包含三个基本过程；）所有光分析法均包含三个基本过程；（2 2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3 3）涉及大量光学元器件。）涉及大量光学元器件。三个基本过程：三个基本过程：一、一、光谱分析法及其特点光谱分析法及其特点8二、电磁辐射的基本性质二、电磁辐射的基本性质 电磁辐射（电磁波）：电磁辐射（电磁波）：以接近光速（真空中为光速）以接近光速（真空中为光速）传播

6、的能量；传播的能量； c = =/ E = h = h c / c：光速；光速；：波长；波长；：频率；频率；：波数：波数 ； E ：能量；：能量； h：普朗克常数：普朗克常数 电磁辐射具有波动性和微粒性电磁辐射具有波动性和微粒性（波粒二象性）；（波粒二象性）；9三、辐射能的特性：三、辐射能的特性： (1) 吸收吸收 物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；迁到高能级； (2) 发射发射 将吸收的能量以光的形式释放出；将吸收的能量以光的形式释放出； (3) 散射散射 由传播介质的不均匀性引起的光线向四周射去由传播介质的不均匀性引起的光线

7、向四周射去； (4) 折射折射 折射是光在两种介质中的传播速度不同；折射是光在两种介质中的传播速度不同； (5) 反射反射 光射到不同的介质介面时，部分光自介面射回原介质光射到不同的介质介面时，部分光自介面射回原介质中；中； (6) 干涉干涉 干涉现象；干涉现象； (7) 衍射衍射 光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象；光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象； (8) 偏振偏振 只在一个固定方向有振动的光只在一个固定方向有振动的光。10常用三种光常用三种光分析法测量分析法测量过程示意图过程示意图 11四、光谱分析分类四、光谱分析分类光谱分析法光谱分析法原原子子发发射射原原子子吸吸收收原原子子荧荧

8、光光X X射射线线荧荧光光原原子子吸吸收收紫紫外外可可见见红红外外可可见见核核磁磁共共振振紫紫外外可可见见红红外外可可见见分分子子荧荧光光分分子子磷磷光光核核磁磁共共振振化化学学发发光光原原子子发发射射原原子子荧荧光光分分子子荧荧光光分分子子磷磷光光X射射线线荧荧光光化化学学发发光光吸收光谱法吸收光谱法发射光谱法发射光谱法原子光谱法原子光谱法分子光谱法分子光谱法12五、分子光谱法五、分子光谱法物质分子内部运动形式及其对应能级物质分子内部运动形式及其对应能级1. 电子相对于原子核的运动电子相对于原子核的运动-电子能级电子能级; 单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反单重态：激发态与基态中的电子

9、自旋方向相反. . 三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同. . 2. 原子核在其平衡位置附近的相对振动原子核在其平衡位置附近的相对振动 -振动能级振动能级; 3. 分子本身绕其重心的转动分子本身绕其重心的转动-转动能级转动能级.13分子的能级图与跃迁分子的能级图与跃迁S Sn n: : 电子能级电子能级V Vn n: : 振动能级振动能级J Jn n: : 转动能级转动能级分子的总能量分子的总能量 = E电子电子+ E振动振动+ E转动转动14 分子光谱分析法的分类分子光谱分析法的分类分分子子光光谱谱分子吸收分子吸收分子发光分子发光光致发光光致发光其

10、它发光形式其它发光形式UV-Vis （紫外（紫外-可见）可见）IR（红外）（红外）如：荧光和磷光如：荧光和磷光如：化学发光等如：化学发光等15第二节第二节 紫外紫外/ /可见光吸收光谱法可见光吸收光谱法16紫外紫外/ /可见光吸收光谱分析法可见光吸收光谱分析法： 利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长强度变化可进行定量分析。强度变化可进行定量分析。属于分子吸收光谱法，分析波属于分子吸收光谱法，分析波长范围一般为长范围一般为200800nm。历

11、史悠久、应用广泛：历史悠久、应用广泛：分析化学分析化学药物分析药物分析临床检验等临床检验等第二节第二节 紫外紫外/ /可见光吸收光谱法可见光吸收光谱法17 即光吸收基本定律即光吸收基本定律即光吸收基本定律即光吸收基本定律即光吸收基本定律即光吸收基本定律朗伯定律朗伯定律:(1760):(1760) A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的当入射光的当入射光的当入射光的 、吸光物质的、吸光物质的、吸光物质的、吸光物质的c c 一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度A A与液与液与液与液层厚度层厚度层厚度层厚度b b成正比。成正比。成正比。成正比。比尔定律

12、比尔定律( (1852)1852) A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的当入射光的当入射光的当入射光的 、液层厚度、液层厚度、液层厚度、液层厚度b b 一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度A A与吸光与吸光与吸光与吸光物质的物质的物质的物质的c c成正比。成正比。成正比。成正比。一、一、基本原理基本原理I0It入射光入射光透过光透过光18朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律 意义意义意义意义: : : : 当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。吸光度

13、与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。A=lg(I0/It)=kbc一、一、基本原理基本原理19透光率（透射比）透光率（透射比）透光率（透射比）透光率（透射比）T T（TransmittanceTransmittance） A = lg(I0/It) = lg(1/T) = -lgT = kbc吸光度吸光度吸光度吸光度A A （AbsorbanceAbsorbance）一、一、基本原理基本原理20吸光度吸光度吸光度吸光度A A、透射比透射比透射比透射比T T 与与与与浓度浓度浓度浓度c c 的关系的关系的关系的关系AT (%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100 80 60 4

14、0 20一、一、基本原理基本原理21k k 吸光系数吸光系数吸光系数吸光系数 （AbsorptivityAbsorptivity） （1）当）当c的单位用的单位用gL-1表示时，用表示时，用a 表示，表示， Aa b ca 的单位的单位: Lg-1cm-1 的单位的单位: Lmol-1cm-1（2）当）当c的单位用的单位用molL-1表示时，用表示时，用表示，表示， A b c （3） 当当c的单位用的单位用g100mL-1表示时，用表示时，用 表示表示, A bc， 叫做比吸光系数。叫做比吸光系数。一、一、基本原理基本原理22吸光度与光程的关系吸光度与光程的关系吸光度与光程的关系吸光度与光程

15、的关系 A A = = a ab bc c 0.10b0.202b0.00光源光源检测器检测器显示器显示器参参比比一、一、基本原理基本原理23吸光度与浓度的关系吸光度与浓度的关系吸光度与浓度的关系吸光度与浓度的关系 A A = ab = abc c0.10c0.202 2c0.00光源光源检测器检测器显示器显示器参参比比一、一、基本原理基本原理24吸光度与波长的关系吸光度与波长的关系吸光度与波长的关系吸光度与波长的关系 A A = = a abcbc0.00红红0.10红红0.00光源光源检测器检测器显示器显示器参参比比蓝绿光蓝绿光红光红光一、一、基本原理基本原理25溶液浓度的测定溶液浓度的测

16、定A b c工作曲线法工作曲线法(校准曲线校准曲线)朗伯朗伯朗伯朗伯- -比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)A。 。 。 。*0.800.600.400.200.00Axcx一、一、基本原理基本原理26朗伯朗伯朗伯朗伯- -比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件1. 单色光单色光 应选用应选用 max处或处或肩峰处肩峰处测定。测定。3. 稀溶液稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强。浓度增大，分子之间作用增强。2. 吸光质点形式不变吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线

17、性关系离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件应控制条件(酸度、浓度、介质等酸度、浓度、介质等)。一、一、基本原理基本原理27吸光度的加和性与吸光度的测量吸光度的加和性与吸光度的测量吸光度的加和性与吸光度的测量吸光度的加和性与吸光度的测量 A = A1 + A2 + +An 用参比溶液调用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。一、一、基本原理基本原理28二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件光源光源单色器单色器吸

18、收池吸收池检测系统检测系统分光光度计的基本组成分光光度计的基本组成 习惯上将工作波段在习惯上将工作波段在200nm800nm的分光光度的分光光度计称为紫外计称为紫外-可见分光光度计。可见分光光度计。优点：优点：优点：优点： 通过色散原件（棱镜或光栅）得到一束近似的单色光。通过色散原件（棱镜或光栅）得到一束近似的单色光。 波长可调波长可调, 故选择性好故选择性好, 准确度高。准确度高。29 /nm钨灯（热辐射光源）钨灯（热辐射光源）40040060060080080010001000氙灯氙灯氢灯氢灯强强度度光源光源（发出所需波长范围内的连续光谱）发出所需波长范围内的连续光谱）发出所需波长范围内的

19、连续光谱）发出所需波长范围内的连续光谱） 可见光区：可见光区：钨灯，卤钨灯钨灯，卤钨灯(3202500nm) 紫外区：紫外区： 氢灯氢灯 (180375nm) 氙灯、汞灯氙灯、汞灯：紫外、可紫外、可见光区均可用作光源见光区均可用作光源要求要求：有足够的光强度，稳定。有足够的光强度，稳定。二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件30氙灯氙灯氢灯氢灯钨灯钨灯31单色器单色器（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）棱镜棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射

20、率不同。依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。玻璃玻璃3503200nm, 石英石英1854000 nm入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 500400二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件32光栅光栅：（利用光通过光栅时发生利用光通过光栅时发生衍射衍射和和干涉干涉现象而分光的装置现象而分光的装置）光栅衍射示意图光栅衍射示意图光屏光屏透透镜镜平面透平面透射光栅射光栅M1M2出出射射狭狭缝缝在镀铝的玻璃表面刻有数在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的量很大的等宽度等间距等宽度等间距条条痕痕(600、12

21、00、2400条条/mm )。优点：优点：优点：优点：波长范围宽，波长范围宽，波长范围宽，波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，色散均匀，分辨性能好，色散均匀，分辨性能好，色散均匀，分辨性能好，使用方便。使用方便。使用方便。使用方便。二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件33检流计检流计检流计检流计（指示器）：（指示器）：（指示器）：（指示器）：低档仪器：刻度显示低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录中高档仪器：数字显示，自动扫描记录检测器检测器检测器检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。：利用光电效应，将光能转换成

22、电流讯号。：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。如：如：如：如：光电池，光电管，光电倍增管光电池，光电管，光电倍增管吸收池吸收池吸收池吸收池（比色皿）：用于盛待测（比色皿）：用于盛待测（比色皿）：用于盛待测（比色皿）：用于盛待测及参比溶液。及参比溶液。及参比溶液。及参比溶液。二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件341. 单光束分光光度计单光束分光光度计可变波长单光束紫外可变波长单光束紫外- -可见分光光度计示意图可见分光光度计示意图三、紫外三、紫外/可见分光光度计的基本类型可见分光光度计的基本类型352. 双光束分光光度计双光束分光光度计参比池参比池检测器检测器滤光片

23、或滤光片或单色器单色器放大器放大器样品池样品池光源光源 hv光子检测器光子检测器反光镜反光镜反光镜反光镜透明部分透明部分扇形镜扇形镜 正面图正面图扇形镜扇形镜反光镜反光镜栅镜栅镜双光束型可以消除光源强度变化的影响。双光束型可以消除光源强度变化的影响。可变波长双光束紫外可变波长双光束紫外-可见分光光度计示意图可见分光光度计示意图36第三节第三节 分子发光光谱法分子发光光谱法37分子发光分子发光光致发光光致发光化学发光化学发光生物发光生物发光光致发光（光致发光（Photoluminescence）: 物质当受到光的照射吸收了某种波长的光后，会发射出波长相物质当受到光的照射吸收了某种波长的光后，会发

24、射出波长相同或比吸收波长更长的光，这种现象称为光致发光。同或比吸收波长更长的光，这种现象称为光致发光。PhotoluminescenceMolecular Luminescence ChemiluminescenceBioluminescence38u1575年，西班牙医生年，西班牙医生N.Monardes发现。发现。u1852年，年，George Stokes对荧光产生的机理作了解对荧光产生的机理作了解释，并提出了释，并提出了“荧光荧光”。u1867年，分子荧光首次用于分析测定。年，分子荧光首次用于分析测定。u1928年，年，Jette和和West提出第一台光电荧光计。提出第一台光电荧光计。

25、u1952年，商品荧光分光光度计出现。年，商品荧光分光光度计出现。 分子荧光技术的发展分子荧光技术的发展39The Discovery and Development of the Green Fluorescent Protein,（GFP ）绿色荧光蛋白）绿色荧光蛋白2008诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖Osamu Shimomura 1960sMartin Chalfie 1990sRoger Y. Tsiens, today40一、分子荧光（磷光）发生的原理一、分子荧光（磷光）发生的原理41 。 物质的基态分子受一激发光源的照射被激发至激发物质的基态分子受一激发光源的照射被激发至激发态后，电

26、子由态后，电子由第一激发态的最低振动能级回到基态的各第一激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级个振动能级，以，以光的形式光的形式放出末态两个能级的能量差额放出末态两个能级的能量差额称为称为荧光荧光。 基于化合物的荧光测量而建立基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为起来的分析方法称为分子荧光光分子荧光光谱法谱法。 421. 1. 分子的多重态：分子的多重态：单线态、激发单线态、激发三线态单线态、激发单线态、激发三线态单线态单线态(S0) 一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。多数有机物分子的基态是单线态多数有机物分子的基态是单线态。当基态一对电

27、子的一个被激发到较高能级时当基态一对电子的一个被激发到较高能级时，激发单线态激发单线态(S) 自旋方向不改变，分子仍处于单线态。自旋方向不改变，分子仍处于单线态。激发三线态激发三线态(T) 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。有两个电子的自旋不配对而平行的状态。分子的激发与失活分子的激发与失活43S0ST分子的多重态分子的多重态ET1 kkf f，不出现荧光发射；不出现荧光发射；荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系 （1 1）具有合适的结构；）具有合适的结构； （2 2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率荧光量子产率（ f）：）：57某些化合物的荧

28、光效率某些化合物的荧光效率化合物化合物 荧光效率荧光效率 溶剂溶剂荧光素荧光素 0.92 （0.1MNaOH）曙红曙红 0.19 （0.1MNaOH）罗丹明罗丹明B 0.97 （乙醇）（乙醇）蒽蒽 0.31 （己烷）（己烷）核黄素核黄素 0.26 （水，（水，pH7.0）菲菲 0.10 （乙醇）（乙醇）萘萘 0.12 （乙醇）（乙醇）酚酚 0.22 （水）（水）叶绿素叶绿素 0.32 （苯）（苯）58化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光l 具有共轭双键体系的分子具有共轭双键体系的分子化合物化合物（环己烷中）（环己烷中）结结 构构荧光效率荧光效率 荧光波长荧光波长（nm）苯苯0.07283联苯联

29、苯0.18316对对-联三苯联三苯0.9334259（a）萘：）萘： 荧光效率为荧光效率为0.29； 荧光波长为荧光波长为310 nm。（b）蒽：）蒽：荧光效率为荧光效率为0.46；荧光波长为荧光波长为400 nm。 多环芳烃是重要的环境污染物，可用多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定。荧光法测定。 ex = 386 nm ex = 386 nm em = 430 nm em = 430 nm3，4 - 苯并苯并芘芘强致癌物强致癌物!60l具有刚性不饱和平面结构的分子具有刚性不饱和平面结构的分子化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光例例例例61反式：反式：平面构型平面构型 强荧光体强荧光体

30、顺式：顺式：非平面构型非平面构型 非荧光体非荧光体例例例例 1 1，2 - 2 - 二苯乙烯二苯乙烯二苯乙烯二苯乙烯62例例例例 金属螯合物金属螯合物金属螯合物金属螯合物滂铬滂铬BBRBBR本身不发荧光本身不发荧光AlAl3+3+滂铬滂铬BBRBBR发红色荧光发红色荧光63l苯环上取代基的类型：苯环上取代基的类型：化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光给电子基团常使荧光增强：给电子基团常使荧光增强：-OH、-OR、-NH2、-CN等。等。吸电子基团会使荧光减弱：吸电子基团会使荧光减弱：-COOH、-NO2、-SH、-X等。等。化合物化合物 相对荧光强度相对荧光强度 苯苯 10 10 C6H5CO

31、OHC6H5NO230C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020C6H5ClC6H5BrC6H5I750 卤素取代基卤素取代基: 随着取代基中卤随着取代基中卤原子系数的增加，原子系数的增加，使系间窜跃加强使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。物质的荧光减弱，而磷光增强。64温度：温度：温度温度越高越高，荧光，荧光降低降低环境对荧光的影响环境对荧光的影响溶剂：溶剂：极性极性增加增加，荧光，荧光增强增强，荧光波长发生，荧光波长发生红移红移pH值：值：电离平衡的电离平衡的改变改变导致荧光强度的导致荧光强度的差异差异猝灭剂：猝灭剂：动态猝灭、静态猝灭

32、、自猝灭动态猝灭、静态猝灭、自猝灭表面活性剂：表面活性剂：保护保护处于激发单重态的荧光物质分子，处于激发单重态的荧光物质分子， 提高提高荧光效率。荧光效率。65pHpH对荧光强度的影响对荧光强度的影响 共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。光效率和荧光波长。离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无荧光无荧光66四、荧光光谱仪四、荧光光谱仪67测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激

33、激发发光光源源、样样品品池池、双双单单色色器器系统、检测器。系统、检测器。 特殊点：特殊点：1.1.有两个单色器有两个单色器2.2.光光源源与与检检测测器器通通常常成成直角。直角。仪器结构仪器结构69荧光光度计光路图荧光光度计光路图电源电源光度计光度计记录仪记录仪光电倍增管光电倍增管试样液池试样液池光源光源光栅光栅光栅光栅反射镜反射镜反射镜反射镜激发单色器激发单色器发射单色器发射单色器9070 荧光分光光度计的的主要部件荧光分光光度计的的主要部件n激发光源：激发光源：稳定、具有一定强度（稳定、具有一定强度（300400nm)n样品池：样品池：低荧光材料，常用石英池，方形低荧光材料，常用石英池，

34、方形n检测器：检测器：较高灵敏度较高灵敏度n单色器单色器（激发单色器和发射单色器）：（激发单色器和发射单色器）：光栅光栅仪器结构仪器结构711个光子可产生个光子可产生106107个电子个电子光电倍增管光电倍增管(Photomultiplier Tube, PMT)72仪器的使用维护仪器的使用维护注意事项注意事项n电源：电源：触发电压、工作电流、稳定性触发电压、工作电流、稳定性n光源：光源：启动预热、冷却重启、保持清洁启动预热、冷却重启、保持清洁n单色器：单色器：防潮、防尘、防污和防机械损伤防潮、防尘、防污和防机械损伤n光电倍增管：光电倍增管：避免高压时受到外来光线直射避免高压时受到外来光线直射

35、n样品池：样品池：插放方向、避免摩擦、清洗插放方向、避免摩擦、清洗n个人防护个人防护 ： 避免紫外线损伤避免紫外线损伤 73五、荧光分析方法与应用五、荧光分析方法与应用74优点：优点： （1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高23个数量级；个数量级； （2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少）试样量少 、方法简便、提供比较多的物理参数方法简便、提供比较多的物理参数 缺点：缺点： 应用范围小。应用范围小。 60余种元素，尤其适用于有机物和生物大分子的检测。余种元素，尤其适用于

36、有机物和生物大分子的检测。荧光分析法的特点荧光分析法的特点75荧光信号荧光信号u荧光寿命荧光寿命u荧光光谱荧光光谱u荧光强度随光谱变化荧光强度随光谱变化u成像（荧光物质在样本中分布的空间信息）成像（荧光物质在样本中分布的空间信息）u强度强度u寿命寿命76可获得的信息可获得的信息u分子结构信息：分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等u分子浓度信息分子浓度信息：荧光强度增强或猝灭荧光强度增强或猝灭u分子在溶剂中的状态：分子在溶剂中的状态：荧光光谱的红移或者蓝移，静态荧光光谱的红移

37、或者蓝移，静态或动态猝灭，荧光寿命的变化等等或动态猝灭，荧光寿命的变化等等u分子间的相互作用：分子间的相互作用：荧光猝灭，荧光寿命，共振能量转荧光猝灭，荧光寿命，共振能量转移、新的荧光峰的产生移、新的荧光峰的产生u分子的大小：分子的大小：分子的转动速度对偏振光的消偏等分子的转动速度对偏振光的消偏等77荧光分析法对物质的定性或定量分析荧光分析法对物质的定性或定量分析 定性分析：定性分析：依据不同结构的物质所吸依据不同结构的物质所吸收波长和发射的荧光波长不同；收波长和发射的荧光波长不同； 定量分析：定量分析：同种物质的稀溶液，其同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。产生的荧光强度与浓

38、度呈线性关系。78 任何荧光化合物都具有两种任何荧光化合物都具有两种特征光谱：特征光谱：u 荧光激发光谱（吸收光谱）荧光激发光谱（吸收光谱）固定某一发射波长，测定该波长固定某一发射波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发波长变化下的荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱。所得的光谱。u 荧光发射光谱（荧光光谱）荧光发射光谱（荧光光谱）固定某一激发波长，测定荧光发固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化得到的光谱。射强度随发射波长变化得到的光谱。荧光分析法定性依据荧光分析法定性依据79(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 F正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率

39、 f ： F = f Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia =I0-I=I0 (1-10- l c ) F= f I0(1-10- l c ) = f I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低（浓度很低（ l c 0.05）时，）时，将括号项近似处理后：将括号项近似处理后： F= 2.3 f I0 l c = K c 荧光分析法定量依据和方法荧光分析法定量依据和方法80荧光的定量分析荧光的定量分析荧光强度与溶液浓度的关系：荧光强度与溶液浓度的关系：F=KcF=KcI0IFIa条件条件: : 溶液浓度较稀溶液浓度较稀81一般当一般当b c 0.05 时时, F与与c呈线性关系呈线性关系浓

40、度对荧光强度的影响浓度对荧光强度的影响Fc82定量分析方法定量分析方法标准曲线法标准曲线法比例法比例法解线性方程法解线性方程法83标准曲线法标准曲线法荧光强度荧光强度浓度浓度FXCX84比例法比例法 FS=KCS FX=KCX Fs F0 CS Fx F0 CX CX CS (Fx F0 )/ (Fs F0 )85解线性方程法解线性方程法 多组分混合物的荧光分析也可以象吸收多组分混合物的荧光分析也可以象吸收分光光度法一样利用荧光强度的加和性质，采分光光度法一样利用荧光强度的加和性质，采用解线性方程组的方法、双波长及多波长等方用解线性方程组的方法、双波长及多波长等方法从混合物中不经分离即可测得被

41、测组分的含法从混合物中不经分离即可测得被测组分的含量。量。86荧光分析法的应用荧光分析法的应用 单组分的荧光直接测定和间接测定单组分的荧光直接测定和间接测定 多组分的荧光测定多组分的荧光测定87单组分的荧光直接测定和间接测定单组分的荧光直接测定和间接测定荧光物质大多数无机和有机化合物化学反应荧光猝灭88(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 可测量约60多种元素： 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光配合物分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光配合物分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光

42、法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。 单组分的荧光测定单组分的荧光测定89(2) 有机化合物的分析有机化合物的分析 芳香族化合物具有共轭不饱和体系，多能发生荧光。芳香族化合物具有共轭不饱和体系，多能发生荧光。 脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。 胺类、甾族化合物、蛋白质、酶和辅酶、维生素等均胺类、甾族化合物、蛋白质、酶和辅酶、维生素等均可以用荧光法分析。可以用荧光法分析。

43、被测物质被测物质试剂试剂雌激素雌激素H2SO4质甾族质甾族H2SO4氨基酸氨基酸邻苯二醛（缩合）邻苯二醛（缩合）维生素维生素B1Fe(CN)63- 或或Hg2+ (氧化至硫胺荧氧化至硫胺荧) 90多组分混合物的荧光分析多组分混合物的荧光分析两组分的荧光光谱峰不重叠：两组分的荧光光谱峰不重叠：可选用不同可选用不同的的发射波长发射波长来测定各组分的荧光强度来测定各组分的荧光强度两组分的荧光光谱峰重叠或接近：两组分的荧光光谱峰重叠或接近：可选可选用不同的用不同的激发波长激发波长来测定来测定91六、磷光光谱法六、磷光光谱法92磷光光谱法磷光光谱法 磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有磷光分析法是以分子磷

44、光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法。机化合物和进行定量分析的一种方法。93磷光光谱法磷光光谱法 磷光光谱分析法的分类磷光光谱分析法的分类u 低温磷低温磷光光u 室温磷室温磷光光1、固体表面室温磷光法（、固体表面室温磷光法（SS-RTP）2、胶束增稳室稳磷光法（、胶束增稳室稳磷光法（MS-RTP）94样品管样品管镀银镀银未镀银未镀银Io液氮1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 2.2.农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床分析 磷光光谱法的应用磷光光谱法的应用95七、化学发光光谱法七、化学发光光谱法96基本原理基本原理

45、在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，称发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，称为化学发光。为化学发光。 A +B = C + D* D* D + h 97化学发光的特点化学发光的特点uu能够发光的化合物大多为能够发光的化合物大多为能够发光的化合物大多为能够发光的化合物大多为有机化合物有机化合物有机化合物有机化合物，芳香族，芳香族，芳香族，芳香族化合物；化合物；化合物；化合物；uu化学发光反应多为化学发光反应多为化学发光反应多为化学发光反应多为氧化还原反应氧化还原反应氧化还原反应氧化还原反应，激发能

46、与反，激发能与反，激发能与反，激发能与反应能相当应能相当应能相当应能相当 E E=170=170300 kJ/mol300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；位于可见光区；位于可见光区；uu发光发光发光发光持续时间较长持续时间较长持续时间较长持续时间较长，反应持续进行；，反应持续进行；，反应持续进行；，反应持续进行； 98化学发光的效率化学发光的效率化学效率：化学效率：发光效率：发光效率：99 时刻时刻t t的的化学发光强度化学发光强度( (单位时间发射的光量子数单位时间发射的光量子数) )：化学发光的效率化学发光的效率100 是与分析物有关的化学发光效率是与分析物有关的化学发光效率;

47、 dc/dt 分析物参加反应的速率；分析物参加反应的速率；cl 化学发光分析法定量分析依据：化学发光分析法定量分析依据： 从上式可以看出：发光总强度与分析物浓度成正比。从上式可以看出：发光总强度与分析物浓度成正比。直接发光直接发光A + B C* + D C* C + h 化学发光反应类型化学发光反应类型1. 直接化学发光和间接化学发光直接化学发光和间接化学发光间接发光间接发光A + B C* + DC*+F F* + E F* F + h 2. 气相化学发光和液相化学发光气相化学发光和液相化学发光101u 灵敏度极高灵敏度极高u 仪器设备简单仪器设备简单u 发射光强度测量无干扰发射光强度测量

48、无干扰u 线性范围宽线性范围宽u 分析速度快分析速度快化学发光分析法的特点化学发光分析法的特点102内容小结内容小结第一节第一节 光谱分析法概论光谱分析法概论 光谱分析光谱分析 (spectral analysis)： 对物质发射辐射能的能谱分对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。（三个基本过程、三个特点）（三个基本过程、三个特点）电磁辐射具有波粒二象性：电磁辐射具有波粒二象性：波动性波动性波动性波动性和和和和微粒性微粒性微粒性微粒性 c = =/ E = h = h c /物质分子内部运动形式及其对应能级物质分

49、子内部运动形式及其对应能级光谱分析法分类光谱分析法分类（吸收光谱法吸收光谱法/发射光谱法发射光谱法；原子光谱法原子光谱法/分子光谱法分子光谱法）内容小结内容小结第二节第二节 紫外紫外/可见光吸收光谱法可见光吸收光谱法定量分析的依据定量分析的依据朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律A=lg(I0/It)=kbc（朗伯（朗伯（朗伯（朗伯- - - -比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用/ / / /适用条件）适用条件）适用条件）适用条件）分光光度计的基本组成分光光度计的基本组成光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测系统检测系统紫外紫外/ /可见分光光度计的类型可见分光光

50、度计的类型内容小结内容小结第一激发第一激发单线态单线态基态分子基态分子光光辐辐射射激发态激发态振动驰豫振动驰豫内转换内转换荧光发射荧光发射荧光发射荧光发射第一激发第一激发三线态三线态体体系系间间跨跨越越磷光发射磷光发射磷光发射磷光发射第三节第三节 分子荧光和分子磷光光谱法分子荧光和分子磷光光谱法分分子子荧荧光光和和磷磷光光发发生生的的机机理理内容小结内容小结u Stokes位移位移u 发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关u 镜像规则镜像规则激发光谱与荧光激发光谱与荧光( (磷光磷光) )光谱光谱荧光的产生与荧光的产生与分子结构分子结构的关系的关系内容小结内容小结分子产生荧光

51、必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件荧光量子产率荧光量子产率 f合适的结构合适的结构u 苯环上取代基的类型苯环上取代基的类型u具有刚性平面结构的分子具有刚性平面结构的分子环境环境对荧光的影响对荧光的影响（温度、溶剂、（温度、溶剂、pHpH值、表面活性剂、猝灭剂）值、表面活性剂、猝灭剂）u具有共轭双键体系的分子具有共轭双键体系的分子内容小结内容小结荧光光谱仪荧光光谱仪检测器光源激发单色器样品池发射单色器分类分类主要部件主要部件使用和维护使用和维护荧光定量分析荧光定量分析荧光强度与溶液浓度的关系：荧光强度与溶液浓度的关系：F=KC内容小结内容小结荧光定性分析荧光定性分析荧光激发光谱荧光激发光谱

52、荧光发射光谱荧光发射光谱标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法比例法比例法比例法比例法解线性方程法解线性方程法解线性方程法解线性方程法分析方法分析方法内容小结内容小结l磷光光谱法磷光光谱法荧光分析法的应用荧光分析法的应用单组分的荧光直接测定单组分的荧光直接测定单组分的荧光直接测定单组分的荧光直接测定和间接测定和间接测定和间接测定和间接测定多组分的荧光测定多组分的荧光测定多组分的荧光测定多组分的荧光测定分类、仪器特点及其应用分类、仪器特点及其应用分类、仪器特点及其应用分类、仪器特点及其应用l化学发光光谱法化学发光光谱法基本原理、特点、化学发光效率、反应类型基本原理、特点、化学发光效率、反应类型

53、基本原理、特点、化学发光效率、反应类型基本原理、特点、化学发光效率、反应类型复习思考题复习思考题l 什么叫做光谱分析？其主要过程和特点有哪些？什么叫做光谱分析？其主要过程和特点有哪些？l 紫外紫外/可见分光光度法的基本原理是什么？可见分光光度法的基本原理是什么？l 紫外紫外/可见分光光度计的主要构造是怎样的？可见分光光度计的主要构造是怎样的？l 分子的去活化过程有哪些？分子的去活化过程有哪些？l 什么是物质的激发光谱和荧光光谱？二者之间有什么什么是物质的激发光谱和荧光光谱？二者之间有什么 关关系？系？l 影响荧光强弱的因素有哪些？影响荧光强弱的因素有哪些？l分子磷光和化学发光法的特点有哪些？分子磷光和化学发光法的特点有哪些？个人观点供参考，欢迎讨论