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1、第七章第七章 动物细胞基因操作动物细胞基因操作动物细胞基因操作动物细胞基因操作n动物细胞基因操作的必须性动物细胞基因操作的必须性: :可进行细菌和真菌可进行细菌和真菌细胞所无法进行的真正的翻译后修饰细胞所无法进行的真正的翻译后修饰n载体载体 1) 1) 非复制质粒载体非复制质粒载体 2) 2) 带有病毒复制子的质粒带有病毒复制子的质粒 3) 3) 病毒转导载体病毒转导载体n细胞：与细胞本身特性、载体、转移、应用相细胞：与细胞本身特性、载体、转移、应用相关关n转移：转移技术、瞬时与稳定转染、共转染转移：转移技术、瞬时与稳定转染、共转染n应用：细胞研究、蛋白表达、体内基因治疗、应用：细胞研究、蛋白
2、表达、体内基因治疗、转基因动物转基因动物第一节第一节 动物细胞动物细胞DNA转移技术转移技术动物细胞基因转移的途径动物细胞基因转移的途径=转转基因技术基因技术n直接直接DNADNA转移：外源转移：外源DNADNA通过物理转化直通过物理转化直接进入细胞接进入细胞 如显微注射、含如显微注射、含DNADNA颗粒轰击、颗粒轰击、n转染：化学转染技术、脂质体、电穿孔转染：化学转染技术、脂质体、电穿孔n转导：通过动物病毒包裹，利用病毒可转导：通过动物病毒包裹，利用病毒可以自然感染细胞并将自身核酸分子转入以自然感染细胞并将自身核酸分子转入细胞的能力。细胞的能力。转染技术转染技术n化学转染技术化学转染技术(
3、(利用胞吞作用利用胞吞作用) )1) DNA/1) DNA/磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法 适用于单层生长细胞，不适用于悬浮或成团生长的细胞适用于单层生长细胞，不适用于悬浮或成团生长的细胞 对某些细胞有毒性，难以转染对某些细胞有毒性，难以转染2) 2) 二乙氨乙基葡聚糖二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-(DEAE-dextrandextran) ) 可溶性聚阳离子制剂，不能用于形成稳定的细胞系可溶性聚阳离子制剂，不能用于形成稳定的细胞系n脂质体脂质体( (利用胞吞作用利用胞吞作用) ) 低毒性，易操作，效率高，适用细胞类型多，甚至可转染活低毒性，易操作，效率高，适用细胞类型多，甚至可转染活体细胞体细胞
4、n电穿孔电穿孔( (利用电脉冲在细胞膜上形成瞬时的纳米大小的孔）利用电脉冲在细胞膜上形成瞬时的纳米大小的孔）转移后转移后DNADNA的命运的命运n具备在宿主细胞内发挥功能的复制起始子，具备在宿主细胞内发挥功能的复制起始子，可以稳定复制可以稳定复制( (稳定转染稳定转染) )n可以整合到基因组可以整合到基因组DNADNA上，稳定复制上，稳定复制( (稳定稳定转染转染) )n不具备在宿主细胞内发挥功能，也没有整不具备在宿主细胞内发挥功能，也没有整合到基因组合到基因组DNADNA上，瞬时保留上，瞬时保留( (瞬时转染）瞬时转染）nDNADNA转入细胞的效率远高于转入细胞的效率远高于DNADNA整合的
5、效率整合的效率n两个物理上不相连的基因可以发生共转染，两个物理上不相连的基因可以发生共转染，甚至可以都整合到基因组甚至可以都整合到基因组DNADNA上上第二节第二节 动物细胞载体动物细胞载体动物细胞载体动物细胞载体n非复制型载体非复制型载体 瞬时转染的载体瞬时转染的载体( (启动子功能分析的载体启动子功能分析的载体) ) 选择标记选择标记DNADNAn带有病毒复制子的质粒带有病毒复制子的质粒 SV40SV40、BPVBPV、EBVEBVn病毒转导载体病毒转导载体 腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、LentivirusLentivirus等等瞬时转染的非复制型载体瞬时转染的
6、非复制型载体n载体无法复制，也不载体无法复制，也不整合于基因组上整合于基因组上n在宿主细胞中往往只在宿主细胞中往往只能保持能保持1-2d1-2d的稳定的稳定n可以进行基因的表达可以进行基因的表达n载体上往往具有报告载体上往往具有报告基因，能够报告表达基因，能够报告表达的发生的发生启动子功能分析与报告基因启动子功能分析与报告基因选择标记基因选择标记基因n未经克隆的含未经克隆的含TKTK基因的外源基因的外源DNADNA使一些摄使一些摄入细胞具有了入细胞具有了在选择培养基在选择培养基上生存的能力，上生存的能力，这样的基因称这样的基因称为选择性标记为选择性标记基因基因转染实验转染实验TK 胸苷激酶胸苷
7、激酶核苷酸从头合成和补救途径：编码补核苷酸从头合成和补救途径：编码补救途径的酶的基因救途径的酶的基因(Hprt,Tk)可以用可以用作选择标记作选择标记共转化与选择标记共转化与选择标记n两个物理上不相连的基因通过共转染，共同整两个物理上不相连的基因通过共转染，共同整合到基因组中的现象合到基因组中的现象n这是由于发生了整合之前的这是由于发生了整合之前的DNADNA融合融合n只要能同时转入一个选择标记基因，共转化现只要能同时转入一个选择标记基因，共转化现象就可以使任何外源象就可以使任何外源DNADNA序列稳定转入哺乳动物序列稳定转入哺乳动物细胞细胞n根据标记基因筛选方法，选择标记可以分为：根据标记基
8、因筛选方法，选择标记可以分为：内源性选择标记、显性选择标记、扩增选择标内源性选择标记、显性选择标记、扩增选择标记记内源性选择标记内源性选择标记n来自于动物细胞内来自于动物细胞内的标记基因，大多的标记基因，大多数涉及与冗余内源数涉及与冗余内源核苷酸生物合成途核苷酸生物合成途径径n内源性选择标记的内源性选择标记的缺点：只能用于那缺点：只能用于那些对应基因不具有些对应基因不具有功能的突变细胞。功能的突变细胞。显性选择标记显性选择标记n显性选择标记：往往显性选择标记：往往来自于细菌来自于细菌( (外源外源) )，因此其所提供的表型因此其所提供的表型对于细胞来说是全新对于细胞来说是全新的，可用于任何细胞
9、。的，可用于任何细胞。这些标记通常是细菌这些标记通常是细菌的抗药基因，因此阳的抗药基因，因此阳性细胞可以在适当的性细胞可以在适当的药物浓度的培养基上药物浓度的培养基上进行筛选。进行筛选。扩增选择标记扩增选择标记n当动物细胞暴露在某当动物细胞暴露在某种药物的有毒浓度中，种药物的有毒浓度中，少数个别细胞由于自少数个别细胞由于自发的、扩增性的抗药发的、扩增性的抗药突变而存活，这样的突变而存活，这样的DNADNA上的扩增性标记，上的扩增性标记，称为扩增选择标记称为扩增选择标记n出现扩增选择性标记出现扩增选择性标记的细胞栽种群中是随的细胞栽种群中是随机出现的，可进行高机出现的，可进行高浓度抗药性的筛选浓
10、度抗药性的筛选n侧翼侧翼DNADNA序列可随标序列可随标记基因一起扩增记基因一起扩增氨基蝶呤氨基蝶呤DHFR叶酸叶酸扩增选择标记扩增选择标记n扩增选择扩增选择标记也常标记也常可用于内可用于内源或显性源或显性选择标记，选择标记，但常常用但常常用于扩增选于扩增选择的药物择的药物不同不同扩增选择标记常用于外源基因扩增选择标记常用于外源基因的高效表达的高效表达复制子载体：带有病毒复制子复制子载体：带有病毒复制子的载体的载体n病毒基因组具有在宿主细胞内独立复制的能力病毒基因组具有在宿主细胞内独立复制的能力n可能造成溶解性感染，使宿主细胞裂解，如可能造成溶解性感染，使宿主细胞裂解，如SV40SV40，由于
11、宿主细胞的裂解，实现的是一种高，由于宿主细胞的裂解，实现的是一种高水平瞬时表达水平瞬时表达n可能造成潜伏性感染，从而并不影响宿主细胞可能造成潜伏性感染，从而并不影响宿主细胞生长，实现稳定转染，如生长，实现稳定转染，如EBVEBV和和PBVPBV，其中，其中EBVEBV载体相对于载体相对于PBVPBV载体复制更加稳定载体复制更加稳定SV40SV40（猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA）病毒转导载体病毒转导载体n外源外源DNADNA分子包入病毒粒子分子包入病毒粒子( (通过连接或同源重通过连接或同源重组的方式插入病毒载体），后者吸附到细胞表组的方式插入病毒载体），后者吸附到细胞表面从而进入细胞面从而进入细
12、胞n效率很高，而且具有高效复制与高水平表达基效率很高，而且具有高效复制与高水平表达基因的潜能因的潜能n不仅可用于培养细胞，也可用于活体细胞不仅可用于培养细胞，也可用于活体细胞n腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、LentivirusLentivirus等等可复制病毒载体与复制缺陷型可复制病毒载体与复制缺陷型病毒载体病毒载体n当转移基因插入到基因组中或它所替换的基因当转移基因插入到基因组中或它所替换的基因对于在宿主细胞中的感染周期不是必需时，载对于在宿主细胞中的感染周期不是必需时，载体可以独立的增殖，称为可复制的或不依赖辅体可以独立的增殖，称为可复制的或不依赖辅助病毒载体。助
13、病毒载体。n当转入基因替换了病毒的必需基因时，这样的当转入基因替换了病毒的必需基因时，这样的载体则称为复制缺陷型或辅助病毒依赖性载体。载体则称为复制缺陷型或辅助病毒依赖性载体。因为它们失去的功能需要通过共转入携带有载因为它们失去的功能需要通过共转入携带有载体所缺失基因的辅助病毒来提供。体所缺失基因的辅助病毒来提供。可复制病可复制病毒载体与毒载体与复制缺陷复制缺陷型病毒载型病毒载体体: :以杆以杆状病毒为状病毒为例例无内含载体无内含载体n不具有所有病毒编码序列的载体，只含有包装不具有所有病毒编码序列的载体，只含有包装和基因组扩增所必需的顺式作用元件。和基因组扩增所必需的顺式作用元件。n优点优点:
14、 : 1) 1) 可容纳高容量的外源可容纳高容量的外源DNADNA 2) 2) 不产生病毒基因产物，对细胞无毒性不产生病毒基因产物，对细胞无毒性第三节第三节 细胞与应用细胞与应用正常动物细胞生长特性正常动物细胞生长特性宿主动物细胞所需特性宿主动物细胞所需特性正常细胞生长特性和宿主细胞所需特性正常细胞生长特性和宿主细胞所需特性上的差异某种程度上造成了各种表达系上的差异某种程度上造成了各种表达系统对宿主细胞选择和应用的差异统对宿主细胞选择和应用的差异第四节第四节 动物基因操作动物基因操作动物基因工程动物基因工程动物基因工程动物基因工程动物基因工程动物基因工程动物细胞基因工程动物细胞基因工程转基因动
15、物个体转基因动物个体动物工程细胞动物工程细胞动物遗传性状改良动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型人体基因治疗人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型动物基因工程动物基因工程n哺乳动物哺乳动物 转基因小鼠转基因小鼠 胚胎干细胞胚胎干细胞 同源重组同源重组 基因寻靶基因寻靶 克隆羊克隆羊 核移植核移植n其他脊椎动物其他脊椎动物 爪蟾爪蟾n无脊椎动物无脊椎动物 果蝇果蝇产生转基因哺乳动物的方法产生转基因哺乳动物的方法n体细胞体细胞- -卵卵细胞核替细胞核替换换n显微注射显微注射受精卵受精卵n反病毒侵反病毒侵染胚胎干染胚胎干细
16、胞或早细胞或早期胚期胚转基因小鼠转基因小鼠n大多数动物细胞在发育能力上受到限制，不能大多数动物细胞在发育能力上受到限制，不能产生转基因动物：分化的细胞无法完全去分化产生转基因动物：分化的细胞无法完全去分化和重复发育和重复发育n动物中实现生殖细胞系转化的唯一途径就是在动物中实现生殖细胞系转化的唯一途径就是在形成生殖细胞系的发育阶段之前把形成生殖细胞系的发育阶段之前把DNADNA导入全导入全能细胞能细胞n胚胎干细胞胚胎干细胞(Es Cells)(Es Cells)是这样一个动物体特殊是这样一个动物体特殊的全能细胞的全能细胞转基因小鼠中的转基因小鼠中的DNADNA转移方法转移方法n直接显微注射：注入
17、刚受精卵细胞的直接显微注射：注入刚受精卵细胞的雄或雌性原核中雄或雌性原核中n重组反转录病毒：不适宜产生完全的重组反转录病毒：不适宜产生完全的转基因动物，可用于形成胚转基因部转基因动物，可用于形成胚转基因部分分nEsEs细胞转染：可利用标准标记进行筛细胞转染：可利用标准标记进行筛选选 胚胎干细胞胚胎干细胞(Es Cells)(Es Cells)n取自生殖细胞发育前的早期胚取自生殖细胞发育前的早期胚n具有发育成动物的所有组织的能力具有发育成动物的所有组织的能力n受同源重组影响显著，可以用于基因寻受同源重组影响显著，可以用于基因寻靶，即可用外源靶，即可用外源DNA的同源片段精确地的同源片段精确地替换
18、内源基因组的片段。替换内源基因组的片段。EsEs细胞的基因寻靶细胞的基因寻靶n外源外源DNADNA的同源片段精确替换内源基因组片的同源片段精确替换内源基因组片段的过程段的过程n由于同源重组的几率远低于随机整合，进行由于同源重组的几率远低于随机整合，进行寻靶的细胞需要有较高的同源重组能力寻靶的细胞需要有较高的同源重组能力n体外操作的多能性、可操作性以及同源重组体外操作的多能性、可操作性以及同源重组的能力使的能力使EsEs细胞成为唯一适合于产生定向突细胞成为唯一适合于产生定向突变小鼠的细胞，即在每个细胞中携带有相同变小鼠的细胞，即在每个细胞中携带有相同突变并能将其传递给生殖细胞系的小鼠。突变并能将
19、其传递给生殖细胞系的小鼠。n标记基因已被运用到寻靶过程和其后的筛选标记基因已被运用到寻靶过程和其后的筛选 寻靶载体寻靶载体n特化的质粒载体，导入到特化的质粒载体，导入到EsEs细胞后可以促进同源重组细胞后可以促进同源重组n促进同源重组的原因主要是促进同源重组的原因主要是含有一段同源区含有一段同源区n转染前载体的线性化，有助转染前载体的线性化，有助于重组效率的提高于重组效率的提高n多数基因寻靶是为了打断内多数基因寻靶是为了打断内源基因位点，使之无效，称源基因位点，使之无效，称为基因敲除为基因敲除两种类型的寻靶载体：替代与两种类型的寻靶载体：替代与插入插入 n插入载体是打插入载体是打断了原基因，断了原基因，也会出现选择也会出现选择标记附近的序标记附近的序列重复，可能列重复，可能会导致再次的会导致再次的同源重组而回同源重组而回复野生型复野生型n替换载体更普替换载体更普及及筛选策略筛选策略n标记基因筛选：对于插入载体，标记基因标记基因筛选：对于插入载体，标记基因可位于载体骨架内任何地方；对于替换载可位于载体骨架内任何地方；对于替换载体，标记基因必须在同源区内。目前最常体，标记基因必须在同源区内。目前最常用的标记基因是用的标记基因是neoneo标记。标记。nSouthern blotSouthern blotnPCRPCRnWestern blotWestern blot
