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1、荧光显示细胞器和细胞凋亡荧光显示细胞器和细胞凋亡FluorescentDyeExcitation（激发频谱，（激发频谱，nm）Emission（发射频谱，（发射频谱，nm）BODIPY530/550530550Dil549565BODIPYTMR542568BODIPY558/568558568BODIPY564/570564570Cy3TM550570TRITC547572MagnesiumOrangeTM550575Phycoerythrin,R&B565575RhodaminePhalloidin550575CalciumOrangeTM549576PyroninY555580Rhoda
2、mineB555580RhodamineRedTM570590Cy3.5TM581596ABI,ROX588608CalciumCrimsonTM590615FluorescentDyeExcitation（激发频谱，（激发频谱，nm）Emission（发射频谱，（发射频谱，nm） TexasRed595615NileRed549628YO-PROTM-3612631YOYOTM-3612631R-Phycocyanin618642C-Phycocyanin620648TO-PROTM-3642660TOTO-3642660DiDDilC(5)644665Cy5TM649670Thiadica
3、rbocyanine651671Cy5.56756941. 细胞核的荧光显示 P60-62吖啶橙吖啶橙（AcridineOrange) 吖啶衍生物之一，它既可嵌入吖啶衍生物之一，它既可嵌入DNA双链间与双链双链间与双链DNA结合，结合，经经蓝光蓝光激发后发出激发后发出亮绿色亮绿色荧光，荧光，又可以静电堆积的方式与单链又可以静电堆积的方式与单链DNA或或RNA 的磷酸根结合，蓝光的磷酸根结合，蓝光激发下发出橘红色荧光，从而清晰的显示激发下发出橘红色荧光，从而清晰的显示DNA,RNA。异染色质（核内深染）和常染色质（核内浅染）异染色质（核内深染）和常染色质（核内浅染）异染色质（核内深染）和常染色质
4、（核内浅染）异染色质（核内深染）和常染色质（核内浅染）实验方法实验方法: P621.将生长有培养细胞的盖玻片（注意细胞面向上）置于将生长有培养细胞的盖玻片（注意细胞面向上）置于一次性小培养皿内，加入一次性小培养皿内，加入9595乙醇固定乙醇固定15153030分钟，取分钟，取出自然干燥；出自然干燥；2.2.加入加入1 1醋酸酸化醋酸酸化3030秒；秒；3.3.在盖玻片标本上滴加在盖玻片标本上滴加0.01吖啶橙染液吖啶橙染液，染色，染色510分钟；分钟；4.去染液，用磷酸缓冲液冲洗去染液，用磷酸缓冲液冲洗1分钟；分钟；5.用用1/10氯化钙分化氯化钙分化30秒秒3分钟；分钟；6.用用PBS漂洗玻
5、片漂洗玻片3次，每次数秒；次，每次数秒；7.临时封片：滴临时封片：滴临时封片：滴临时封片：滴1 12 2滴滴滴滴PBS于载玻片上，将含细胞的盖于载玻片上，将含细胞的盖于载玻片上，将含细胞的盖于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用玻片反扣其上，置荧光显微镜下用玻片反扣其上，置荧光显微镜下用玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X100X物镜观察。物镜观察。物镜观察。物镜观察。细胞核呈绿色（细胞核呈绿色（DNA),细胞质呈橙红色。细胞质呈橙红色。2.线粒体的荧光标记线粒体的荧光标记P70P70罗丹明罗丹明罗丹明罗丹明123123特异性的线粒体荧光染料特异性的线粒体荧光染料特异性的线粒
6、体荧光染料特异性的线粒体荧光染料, , 是膜电位敏感的阳离子荧光素，活细胞线粒体具是膜电位敏感的阳离子荧光素，活细胞线粒体具是膜电位敏感的阳离子荧光素，活细胞线粒体具是膜电位敏感的阳离子荧光素，活细胞线粒体具有大量质子积累造成的外正内负跨膜电位，吸有大量质子积累造成的外正内负跨膜电位，吸有大量质子积累造成的外正内负跨膜电位，吸有大量质子积累造成的外正内负跨膜电位，吸引染料并将它保持在线粒体中引染料并将它保持在线粒体中引染料并将它保持在线粒体中引染料并将它保持在线粒体中, ,经经经经蓝光激发蓝光激发蓝光激发蓝光激发, ,呈现呈现呈现呈现黄绿色荧光黄绿色荧光黄绿色荧光黄绿色荧光. .可作为线粒体膜
7、电位的灵敏指示可作为线粒体膜电位的灵敏指示可作为线粒体膜电位的灵敏指示可作为线粒体膜电位的灵敏指示. .罗丹明罗丹明罗丹明罗丹明123123123123结构式结构式结构式结构式电子传递和氧化磷酸化的偶联电子传递和氧化磷酸化的偶联实验方法实验方法: P711.取出已培养好细胞的盖玻片，用取出已培养好细胞的盖玻片，用PBS(+)冲洗冲洗3次，每次，每次漂洗浸泡次漂洗浸泡2-3分钟，分钟，2.加入加入罗丹明罗丹明罗丹明罗丹明123123标记液，标记液，标记液，标记液， 3737培养箱孵育培养箱孵育培养箱孵育培养箱孵育1515分钟，分钟，分钟，分钟，3.3.吸去标记液，吸去标记液，吸去标记液，吸去标记
8、液，PBSPBS液洗液洗液洗液洗3 3次，每次次，每次次，每次次，每次3-53-5分钟，分钟，分钟，分钟，4.4.临时封片：滴临时封片：滴临时封片：滴临时封片：滴1 12 2滴缓冲液于载玻片上，将含细胞滴缓冲液于载玻片上，将含细胞滴缓冲液于载玻片上，将含细胞滴缓冲液于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X100X物镜观物镜观物镜观物镜观察。察。察。察。细胞核附近发绿细胞核附近发绿色荧光的圆形或色荧光的圆形或短杆状颗粒即为短杆状颗粒即为线粒体线粒体3.内质网的荧光标记内质网
9、的荧光标记P64-67P64-671.材料材料培养细胞爬片培养细胞爬片2.试剂试剂储存液：储存液：0.5mg/mLDIO-C6(3)存储液，存储液，4避光，避光，标记液：标记液：2.5ug/mLDIO-C6(3)，4避光。避光。0.5%戊二醛戊二醛实验方法实验方法: P671.取出已培养好细胞的盖玻片，用取出已培养好细胞的盖玻片，用0.5%戊二醛戊二醛PBS溶液溶液固定细胞固定细胞10分钟，分钟，2.2.吸去固定液，用吸去固定液，用PBS液洗液洗3次，每次漂洗时浸泡次，每次漂洗时浸泡3.3-5分钟分钟4.2.滴加滴加DIO-C6(3)荧光染液荧光染液，室温染色，室温染色1分钟，分钟，分钟，分钟
10、，5.3.3.吸去标记液，吸去标记液，吸去标记液，吸去标记液，PBSPBS液洗液洗液洗液洗3 3次，每次次，每次次，每次次，每次5 5分钟，分钟，分钟，分钟，6.4.4.临时封片：滴临时封片：滴临时封片：滴临时封片：滴1 12 2滴缓冲液于载玻片上，将含细胞滴缓冲液于载玻片上，将含细胞滴缓冲液于载玻片上，将含细胞滴缓冲液于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X100X物镜观察。物镜观察。物镜观察。物镜观察。4.4.细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡（细胞凋亡（ApoptosisAp
11、optosis）又称程序性细胞死亡）又称程序性细胞死亡（Programmed cell deathProgrammed cell death简称简称PCDPCD），是由基因编），是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调程控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调节机制，与细胞坏死的死亡机制是完全不同。节机制，与细胞坏死的死亡机制是完全不同。细胞凋亡是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机细胞凋亡是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面，数量的稳定
12、、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面，而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物的治疗等方面均而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物的治疗等方面均具有十分重要的作用。具有十分重要的作用。凋凋 亡亡 (Apoptosis) (Apoptosis)坏坏 死死(Necrosis)(Necrosis)（1）定义：一种与遗传机制一种与遗传机制有关的有关的( (即由基因调控的即由基因调控的) )主主动的、自发死亡的方式，无动的、自发死亡的方式，无炎症反应。炎症反应。外在的致损伤因素作用达到一外在的致损伤因素作用达到一定强度，持续一定时间后所导定强度，持续一定时间后所导致的细胞死亡（被动），有炎致的细胞死亡（被动），有炎症反
13、应。症反应。（2）形态学观察 细胞核：核浓缩、碎裂细胞核：核浓缩、碎裂( (染色质染色质浓缩浓缩 有规律性、断裂成核碎片有规律性、断裂成核碎片) )，有，有新月形凋亡小体。新月形凋亡小体。 细胞器：完整细胞器：完整 细胞膜：完好细胞膜：完好 细胞体积：细胞浓缩细胞体积：细胞浓缩 在组织中：常呈单个细胞发生在组织中：常呈单个细胞发生核溶解核溶解( (无规律的染色质团块无规律的染色质团块溶解溶解) )无规律性。无规律性。 崩解崩解 尚失去完整性尚失去完整性 细胞肿胀细胞肿胀 常成群细胞发生常成群细胞发生细胞凋亡与坏死的区别（3）、生物化学检测生物化学检测 核核DNADNA有规律断裂有规律断裂505
14、0300kb /300kb /或或180bp180bp左右的片断左右的片断 凝胶电泳：呈梯形条带凝胶电泳：呈梯形条带(ladder) (ladder) DAPI DAPI萤光染色，片状、颗粒状核荧萤光染色，片状、颗粒状核荧光。光。 流式细胞仪检测：可见亚流式细胞仪检测：可见亚G G1 1峰峰(AP(AP峰峰) ) 核基因表达：必须核基因表达：必须 DNA DNA酶活性：必须酶活性：必须 蛋白激酶活性：必须蛋白激酶活性：必须 细胞器环境：细胞器环境：NaNa+ +/K/K+ +泵功能完好泵功能完好 DNADNA无规律地断裂无规律地断裂 条带不清（条带不清（smearssmears） 无颗粒或片状
15、核荧光出现无颗粒或片状核荧光出现 无此峰无此峰 功能丧失功能丧失 细胞凋亡形态学观察细胞凋亡形态学观察荧光显微镜观察法荧光显微镜观察法Hoechst33258染色法染色法1.材料：材料：CHO细胞细胞2.器材：细胞培养所需设备，荧光显微镜。器材：细胞培养所需设备，荧光显微镜。试剂试剂(1)细细胞胞凋凋亡亡诱诱导导剂剂：放放线线菌菌素素D5mg粉粉剂剂用用1mLDMSO（二二甲甲亚风）浓度亚风）浓度(5mg/mL)充分溶解，分装充分溶解，分装-20避光保存，避光保存，(2)Hoechst33258染染液液：称称取取Hoechst332581mg,用用20mL蒸蒸馏馏水水溶溶解解，过过滤滤，4避避
16、光光保保存存。用用时时用用蒸蒸馏馏水水10倍倍稀稀释释成成染染色色液液，pH7.0(3)固定液：固定液：4%多聚甲醛多聚甲醛(4)PBS液液放放线线菌菌素素D是是一一种种抗抗肿肿瘤瘤的的抗抗生生素素类类药药物物。通通过过脱脱氧氧鸟鸟苷苷残残基基与与DNA形形成成复复合合物物，从从而而抑抑制制DNA依依赖赖的的RNA聚聚合合酶酶的的活活性性，阻阻断断转转录录过过程程。是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂.分分子子式式: C62H86N12O16 分分子子量量: M.W. 1255.5溶解度溶解度: 溶于溶于DMSO,MeOH或或CHCl3.，红色晶体。红色晶体
17、。操作方法操作方法 1.贴壁细胞培养：贴壁细胞培养：将盖玻片置于小培养皿内，接种细胞培养过夜，将盖玻片置于小培养皿内，接种细胞培养过夜，2.细细胞胞换换液液并并加加入入细细胞胞凋凋亡亡诱诱导导剂剂：放放线线菌菌素素D 2uL浓浓度度(10ug/mL)继续培养继续培养24h，3.取取出出小小培培养养皿皿，吸吸尽尽培培养养液液，加加入入固固定定液液(4%多多聚聚甲甲醛醛)0.5mL固定固定10分钟分钟，4.去固定液，用去固定液，用PBS液洗液洗2 2次，每次次，每次3分钟，洗涤时摇动，分钟，洗涤时摇动，5.吸吸尽尽液液体体，将将盖盖玻玻片片正正面面向向上上放放在在载载玻玻片片中中央央，加加入入20
18、uLHoechst33258染色液染色液，染色，染色5分钟，分钟，6.去去染染色色液液，盖盖玻玻片片置置于于小小培培养养皿皿内内，用用PBS液液洗洗2 2次次，每每次次3分分钟，洗涤时摇动，钟，洗涤时摇动，7.在在载载玻玻片片中中央央加加入入1-2滴滴PBS液液,将将盖盖玻玻片片反反扣扣放放在在载载玻玻片片中中央央（长有细胞的面向下），尽量避免气泡产生，（长有细胞的面向下），尽量避免气泡产生，8.荧光显微镜观察：荧光显微镜观察：350nm激发光观察，发射波长约激发光观察，发射波长约460nm活细胞呈均匀荧光，活细胞呈均匀荧光，早早期期凋凋亡亡细细胞胞：呈呈现现细细胞胞皱皱缩缩，胞胞膜膜完完整整
19、，染染质质加加深深，或或核核染色质不均匀分布，呈聚集于核膜一边；染色质不均匀分布，呈聚集于核膜一边；晚晚期期凋凋亡亡细细胞胞：表表现现为为核核碎碎裂裂成成大大小小不不等等的的圆圆形形小小体体，并并被被细细胞胞核核膜膜所所包包裹裹，即即凋凋亡亡小小体体(Apoptotic (Apoptotic bodies)bodies)，显显示示核核或细胞质内浓染致密的颗粒块状荧光。或细胞质内浓染致密的颗粒块状荧光。 31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。黑格尔32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。普列姆昌德33、希望是人生的乳母。科策布34、形成天才的决定因素应该是勤奋。郭沫若35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。洛克
