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1、课程成绩评定课程成绩评定n平时出勤平时出勤20%20%n平时作业平时作业20%20%：翻译一篇：翻译一篇1500-20001500-2000字较新的字较新的有关神经生有关神经生物学领域的英文小专论文或段落，自己查找觉得物学领域的英文小专论文或段落，自己查找觉得有意思有意思的素材，的素材，1010月月2828日日交交电子版电子版（发至（发至 liuyanq2 liuyanq2 ))和和纸质版纸质版，附上，附上英文原文英文原文。n期末考试期末考试( (笔试笔试) 60%) 60%第二章第二章 神经生物学研究的方法和手段神经生物学研究的方法和手段一、形态学方法一、形态学方法二、生理学方法二、生理学方
2、法三、电生理学方法三、电生理学方法 四、生物化学方法四、生物化学方法 五、五、 分子生物学方法分子生物学方法 六、脑成像（六、脑成像（Brain imagingBrain imaging）技术）技术 一、形态学方法一、形态学方法束（通）路追踪法束（通）路追踪法荧光组织化学法荧光组织化学法原位杂交法原位杂交法受体定位法受体定位法神经系功能活动形态定位法神经系功能活动形态定位法1、束（通）路追踪法：研究神经元、束（通）路追踪法：研究神经元之间的联系之间的联系 n轴浆运输法轴浆运输法利用神经元轴浆运输现象的追踪法。利用神经元轴浆运输现象的追踪法。追踪剂：追踪剂：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(hors
3、eradishperoxoidase,HRP)荧光染料：荧光染料：核黄核黄(nuclearyellow)固蓝固蓝(fastblue)荧光金荧光金(fluorogold)植物凝集素植物凝集素如麦芽凝集素如麦芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)细菌毒素细菌毒素如霍乱毒素如霍乱毒素病毒病毒如活的神经病毒如活的神经病毒(胞疹病毒和弹状病毒）胞疹病毒和弹状病毒）n变变性性法法：利利用用神神经经元元包包体体受受损损或或神神经经轴轴突突离离断断后后远远侧侧轴轴突突的变性的变性，或，或轴突切断后细胞的反应轴
4、突切断后细胞的反应，来研究纤维的联系。，来研究纤维的联系。*物理性方法：刀的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等。物理性方法：刀的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等。*化学性破坏：化学性破坏：兴奋性氨基酸兴奋性氨基酸（海人酸和鹅高蕈氨酸）（海人酸和鹅高蕈氨酸）单胺类神经毒单胺类神经毒（羟多巴胺、羟多巴、双羟色胺）（羟多巴胺、羟多巴、双羟色胺）n神经元质膜荧光染料法：神经元质膜荧光染料法：用羰花青（用羰花青（carbocynine）荧光）荧光染料，可以染出神经细胞的质膜，并可以在活体或固定的标染料，可以染出神经细胞的质膜，并可以在活体或固定的标本上追踪纤维联系。本上追踪纤维联系。、免疫组织化学法 用特
5、异性抗体显示神经组织化学成分的方法。用特异性抗体显示神经组织化学成分的方法。基本过程有：固定、制片、反应等三步。基本过程有：固定、制片、反应等三步。l免疫组织化学反应：有免疫组织化学反应：有直接法和间接法直接法和间接法l 双重免疫组织化学染色：主要是为了研究双重免疫组织化学染色：主要是为了研究两种物质在同一细胞或突起内的共存现象两种物质在同一细胞或突起内的共存现象，或两种或两种不同化学物质的相互关系不同化学物质的相互关系。免疫组化的类型:直接法和间接法、原位杂交法、原位杂交法 在形态学研究中，主要用于显示细胞在形态学研究中，主要用于显示细胞内功能内功能蛋白或多肽的蛋白或多肽的mRNA。、受体定
6、位法：研究受体在神经受体定位法：研究受体在神经系统内的定位系统内的定位 n配配体体法法：主主要要在在组组织织切切片片上上进进行行，利利用用标标记记的的配配体和受体结合以示踪其部位体和受体结合以示踪其部位n免疫组织化学法免疫组织化学法：用针对受体的抗体：用针对受体的抗体n原位杂交法原位杂交法:受体的受体的mRNA、神经系功能活动形态定位法、神经系功能活动形态定位法 n脱氧葡萄糖法：脱氧葡萄糖法：原理是：神经元活动时其能量主要原理是：神经元活动时其能量主要依赖葡萄糖依赖葡萄糖提供。在提供。在脑内存在脑内存在脱氧葡萄糖脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2DG，用于抗，用于抗病毒的药物病
7、毒的药物)时，神经元可不加区别地将时，神经元可不加区别地将2DG与葡萄糖一起与葡萄糖一起摄入细胞内，两者都是摄入细胞内，两者都是己糖激酶的底物己糖激酶的底物。但。但2DG在其被磷酸在其被磷酸化成化成2DG-6-PO4后，不能被后，不能被磷酸己糖异构酶磷酸己糖异构酶进一步转化为进一步转化为果果糖糖-6-PO4，不能继续在糖酵解循环中代谢。，不能继续在糖酵解循环中代谢。如在如在2DG上标以同位素。神经元内同位素的堆积程度反上标以同位素。神经元内同位素的堆积程度反映了神经元的活动程度。映了神经元的活动程度。nc-fos(Fos)法：法：c-fos是一种原癌基因，属于即刻早期基因是一种原癌基因，属于即
8、刻早期基因(immediate-earlygene)。很多刺激条件可通过第二信使引起神经元很多刺激条件可通过第二信使引起神经元c-fos的表的表达增加，形成达增加，形成fosmRNA。由。由fosmRNA翻译成的翻译成的Fos蛋白蛋白，立即转位至细胞核内，与另一即刻早基因，立即转位至细胞核内，与另一即刻早基因c-jun所产生的所产生的蛋白蛋白Jun构成二聚体（第三信使），调节其靶构成二聚体（第三信使），调节其靶基因的表达，引起一系列的细胞反应。基因的表达，引起一系列的细胞反应。n细胞色素氧化酶法：细胞色素氧化酶法：神经元线粒体内的神经元线粒体内的细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶是提供神是提供神经元
9、能量的重要酶，经元能量的重要酶，细胞色素氧化酶的水平与细胞色素氧化酶的水平与神经元能量需求密切相关神经元能量需求密切相关，一般反映慢性刺激，一般反映慢性刺激的结果。的结果。二、生理学方法二、生理学方法 n损毁法损毁法n刺激法刺激法n周身给药法周身给药法n脑室注射法脑室注射法n脑组织培养脑组织培养n亚细胞分析亚细胞分析n神经递质释放量的测定神经递质释放量的测定n神经递质的功能测定神经递质的功能测定n行为学方法行为学方法1、神经递质释放量的测定（在体、神经递质释放量的测定（在体in vivo和离体和离体in vitro)n推挽灌流法：推挽灌流法：在体研究中枢核在体研究中枢核团递质释放的有用团递质释
10、放的有用方法。方法。通过推挽灌通过推挽灌流套管，使灌流液流套管，使灌流液直接灌流脑组织，直接灌流脑组织，从流出液中分析神从流出液中分析神经递质的变化。经递质的变化。n脑透析术脑透析术(braindialysis)：在特定的脑区内，植入透析探头，用生理溶液灌流在特定的脑区内，植入透析探头，用生理溶液灌流时，细胞外液中的神经递质可顺浓度递度从透析管扩散时，细胞外液中的神经递质可顺浓度递度从透析管扩散至灌流液中，收集和测定灌流液中神经递质的含量，就至灌流液中，收集和测定灌流液中神经递质的含量，就能监测该递质的变化过程。能监测该递质的变化过程。脑透析术的装置包括脑透析术的装置包括:探头探头导管导管微量
11、灌流泵微量灌流泵样品收集器样品收集器定量分析仪定量分析仪 抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经肽抗体神经肽抗体，用于，用于在中枢神经系统内在中枢神经系统内定位神经肽定位神经肽的释放。的释放。硼硅玻璃与硼硅玻璃与r氨丙基三乙氧硅烷（氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反应后在玻璃）反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基的硅氧烷表面形成一层带有游离氨基的硅氧烷(siloxane)多聚体微粒。多聚体微粒。该玻璃再用戊二醛该玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)处理，使戊二醛与蛋白质处理，使戊二醛与蛋白
12、质A以共价键方式偶联，蛋白质以共价键方式偶联，蛋白质A再与神经肽抗再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针体结合，制成抗体微探针脑片灌流法和突触体灌流法脑片灌流法和突触体灌流法2、神经递质的功能测定、神经递质的功能测定 n微微电电泳泳：能能将将微微量量的的神神经经递递质质导导入入神神经经元元附附近近，观观察其作用。察其作用。n抗抗体体微微量量注注射射：特特异异性性的的抗抗体体注注射射在在某某些些部部位位，可可中中和和神神经经末末梢梢释释放放出出而而进进入入突突触触间间隙隙的的神神经经肽肽，防防止止其其与与受受体体结结合合。因因此此，抗抗体体微微量量注注射射所所引引起起的的功功能变化可解释为消除该神经
13、肽的生理效应的结果能变化可解释为消除该神经肽的生理效应的结果。n生生物物检检测测（Bioassay）:经经典典的的方方法法.如如用用水水蛭蛭背背最最长肌长肌测定测定ACh的作用，灵敏度达的作用，灵敏度达10-10g.3、行为学方法、行为学方法 l经典条件反射：代表刺激与强化的关系。经典条件反射：代表刺激与强化的关系。l操操作作式式条条件件反反射射：是是通通过过动动物物自自身身的的某某个个特特定定操操作动作而获得食物或回避有害刺激的反应活动。作动作而获得食物或回避有害刺激的反应活动。三、电生理学方法三、电生理学方法 1、电生理常用仪器、电生理常用仪器n生物电放大器生物电放大器n电子刺激器电子刺激
14、器n显显示示、贮贮存存和和分分析析电电生生理理实实验验结结果果的的仪仪器器：如如示示波波器照相机和计算机。器照相机和计算机。2、电生理学的常用方法、电生理学的常用方法n细细胞胞外外记记录录(Extracellularrecording)：把把引引导导电电极极安安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动。放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动。n胞胞内内记记录录(Intracellularrecording)：研研究究神神经经元元基基本本生生物物理特性的有力手段。物物理特性的有力手段。EPSP，IPSP，AP(动作电位动作电位)n脑内电刺激脑内电刺激：是研究中枢功能定位的方法之一。：是
15、研究中枢功能定位的方法之一。n顺顺 行行 冲冲 动动 记记 录录 法法 (Orthodromicimpulserecording)：就就是是电电刺刺激激某某一一突突触触前前的的细细胞胞体体、树树突突或或轴轴突突，在在此此突突触触后后神神经经元元细细胞胞体体上上记记录录此此刺刺激引起的电活动变化。激引起的电活动变化。n逆逆行行冲冲动动记记录录法法(Antidromicimpulserecording)：逆逆行行冲冲动动记记录录法法即即电电刺刺激激神神经经元元的的轴轴突突主主干干或或末末梢梢，在在同同一一神神经经元元胞胞体体记记录录反反相相传传导导的的动动作作电电位。位。n电压钳技术电压钳技术(V
16、oltageClamp)：通过插入细胞内的一根微电极向细胞内补通过插入细胞内的一根微电极向细胞内补充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流，这样即使膜通透性发生改变时，也能控离子流，这样即使膜通透性发生改变时，也能控制膜电位数值的不变。制膜电位数值的不变。经过离子通道的离子流与经微电极施加的电经过离子通道的离子流与经微电极施加的电流方向相反，数量相等。流方向相反，数量相等。SG: 信号发生器，信号发生器，AFB: 反馈放大器，反馈放大器，V:监监测膜电位测膜电位n膜膜(斑斑)片钳技术片钳技术（PatchClamp）：）：可可以以从从分分子子水水
17、平平研研究究细细胞胞膜膜离离子子通通道道的的功功能能。用用玻玻璃璃微微电电极极与与只只含含个个离离子子通通道道，面面积积为为几几个个平平方方微微米米的的细细胞胞膜膜通通过过负负压压吸吸引引封封接接起起来来，由由于于电电极极尖尖端端与与细细胞胞膜膜的的高高阻阻封封接接，此此片片膜膜内内开开放放所所产产生生的的电电流流流流进进玻玻璃璃吸吸管管，用用一一极极敏敏感感的的电电流流监监视视器器（斑斑片片钳钳放放大大器器）测测量量此此电电流流强强度度，就就代代表表单单一一离离子子通道电流。通道电流。 n脑电波测定脑电波测定:用双极或单极引导法，将引导电极放用双极或单极引导法，将引导电极放在脑活动区颅骨表面
18、之上，可以记录出能在脑活动区颅骨表面之上，可以记录出能变换方向的微弱电流。通过强力放大记录变换方向的微弱电流。通过强力放大记录出来的电位称脑电图出来的电位称脑电图（）（）。n诱发电位诱发电位:中枢神经的任何部位对于故意刺激中枢神经的任何部位对于故意刺激感受器官、感受神经感受器官、感受神经、感觉通路上的感觉通路上的任何一点任何一点，或与，或与感觉器官有关的任何感觉器官有关的任何结构结构上的一点，所产生的电变化，叫上的一点，所产生的电变化，叫做诱发电位做诱发电位（evokedpotential)。四、生物化学方法四、生物化学方法 1、用离心法分离制备突触小体及突出小体膜、用离心法分离制备突触小体及
19、突出小体膜突触小体突触小体:是指脑组织在等渗溶液中匀浆时，神经末是指脑组织在等渗溶液中匀浆时，神经末梢的细胞膜从轴突上自发断裂、封闭而形成的神经末梢梢的细胞膜从轴突上自发断裂、封闭而形成的神经末梢单位。单位。它包括突触前膜、突触后膜及致密斑和包围在突它包括突触前膜、突触后膜及致密斑和包围在突触前膜的突触小泡触前膜的突触小泡(vesicle内含神经递质内含神经递质)，线粒体及胞，线粒体及胞浆蛋白质。浆蛋白质。由于突触小体是神经介质及受体的主要聚集部位，突由于突触小体是神经介质及受体的主要聚集部位，突触小体的制备便成了神经介质及受体的基本制备手段。触小体的制备便成了神经介质及受体的基本制备手段。2
20、、层析法、层析法:特点：分离生物活性物质时不使其失活，特点：分离生物活性物质时不使其失活，可大量制备。可大量制备。基本原理：被分离物质与支持物相互作用基本原理：被分离物质与支持物相互作用的紧密程度不同，流洗时被洗脱的难易程度的紧密程度不同，流洗时被洗脱的难易程度不同。不同。n离子交换层析离子交换层析n分子筛层析或凝胶过滤分子筛层析或凝胶过滤n疏水性层析法疏水性层析法n亲和层析法亲和层析法n羟磷灰石层析法羟磷灰石层析法n高效液相层析高效液相层析3、放射免疫、放射免疫(radioimmunoassay，RIA)测定神测定神经介质：经介质：利用抗体利用抗体(Ab)特异地识别其抗原（特异地识别其抗原（
21、Ag）的）的原理，将抗原标记放射性同位素（原理，将抗原标记放射性同位素（*Ag），用来），用来测定与测定与*Ag抗原性相同的物质抗原性相同的物质*Ag+Ab*Ag.Ab+AgAg.Ab?当当*Ag固固定定时时，Ag含含量量越越高高，所所得得到到的的*Ag.Ab就就越越少。少。所用仪器：所用仪器：r-计数器，液体闪烁计数仪计数器，液体闪烁计数仪4、放射受体测定受体法、放射受体测定受体法利利用用标标记记能能作作用用于于不不同同靶靶组组织织内内各各种种受受体体的的递递质质和和激激素素，从从而而达达到到直直接接测测定定配配体体与与其其受受体体形形成成络络合合物物的的过过程程和和理理化特性。化特性。5、
22、免免疫疫印印迹迹法法（immunoblotting或或westernblotting）鉴鉴定生物分子定生物分子将将电电泳泳凝凝胶胶分分离离出出来来的的电电泳泳带带移移到到特特殊殊的的滤滤膜膜上上，再再利利用用标标记记抗抗体体与与滤滤膜膜上上某某一一蛋蛋白白质质或或肽肽的的特特异异结结合合，使使其其显显色。色。优优点点：一一是是将将传传统统的的电电泳泳凝凝胶胶染染色色法法的的敏敏感感度度提提高高了了1001000倍倍，二二是是与与RIA相相似似，能能从从多多种种蛋蛋白白质质中中选选择择鉴鉴定定出出一一种种特特异异的的蛋蛋白白质质，其其敏敏感感性性可可达达1ng，同同时时能能知知道道这一蛋白质的分
23、子量，这一蛋白质的分子量，这又是这又是RIA无法达到的。无法达到的。五、五、 分子生物学方法分子生物学方法 、神经生物学研究中常用的分子生物学方法、神经生物学研究中常用的分子生物学方法n基因的分子基因的分子克隆克隆n克隆后的基因在人工体外表达系统或细胞中的克隆后的基因在人工体外表达系统或细胞中的表达表达n克克隆隆后后的的基基因因作作为为探探针针研研究究基基因因表表达达的的组组织织特特异异性性和发育阶段特异性和发育阶段特异性n研究研究基因转录调控区的结构特征基因转录调控区的结构特征有助于理解基因转有助于理解基因转录调控机制录调控机制2、聚合酶链反应（、聚合酶链反应（PCR）：）：在神经生物学研究
24、中有广泛的用途，如可在神经生物学研究中有广泛的用途，如可应用它应用它发现和分析新基因发现和分析新基因，测定，测定mRNA、反向遗传学、反向遗传学利用制造体内基因突变的方法利用制造体内基因突变的方法研究基因及其产物的功能研究基因及其产物的功能：通过制造定向突变改变生物表型的方法通过制造定向突变改变生物表型的方法与传统遗传学所采用的通过与传统遗传学所采用的通过生物表型确定其生物表型确定其基因型基因型的方法相反，故称反向遗传学。的方法相反，故称反向遗传学。、遗传连锁分析法分离、遗传连锁分析法分离遗传病基因遗传病基因：人类基因组由人类基因组由23条染色体组成，基因条染色体组成，基因组内大约包含组内大约
25、包含510万个基因，其中万个基因，其中40%在在脑内脑内表达。表达。约有约有1000多种遗传病多种遗传病具有明显的中枢神具有明显的中枢神经系统症状，经系统症状，占已知遗传病总数的三分之占已知遗传病总数的三分之一。一。六、脑成像（六、脑成像（Brain imaging）技术）技术 n利用各种方法和技术来摄取人及动物颅骨和颅利用各种方法和技术来摄取人及动物颅骨和颅内组织结构的影像，从而了解其是否异常的技内组织结构的影像，从而了解其是否异常的技术。术。n可以反映可以反映:颅骨的密质差异、颅腔以及其他邻近结构颅骨的密质差异、颅腔以及其他邻近结构在无损伤的情况下观察大脑的结构和功能；在无损伤的情况下观察
26、大脑的结构和功能；对大脑损伤或病变部位进行精确的定位。对大脑损伤或病变部位进行精确的定位。1、颅颅骨骨X射射线线照照相相术术：以以基基本本的的X射射线线设设备备和和X射射线照像技术即可获得颅骨的线照像技术即可获得颅骨的X射线照片。射线照片。、同同位位素素脑脑扫扫描描(Isotopebrainscanning)：检检查查脑脑损损伤伤，将将特特定定的的同同位位素素标标记记物物给给观观察察对对象象静静脉脉注注射射，待待标标记记物物进进入入脑脑部部后后，即即以以射射线线扫描仪或扫描仪或r摄像机获得系列扫描图。摄像机获得系列扫描图。、脑超声波脑超声波(Cerebralultrasound)、脑血管造影术
27、脑血管造影术(Cerebralangiography)5、计计算算机机断断层层扫扫描描术术（Computerized tomography, CT） 、 正正 离离 子子 发发 射射 断断 层层 扫扫 描描 术术 （ position emissiontomography,PET）：是是利利用用发发射射正正电电子子的的同同位位素素作作为为标标记记物物，将将其其引引入入脑脑内内某某一一局局部部地地区区参参与与已已知知的的生生化化代代谢谢过过程程，利利用用现现代代化化计计算算机机断断层层扫扫描描技技术术将将标标记记物物所所参参与与的的特特定定代代谢谢过过程程的的代代谢谢率率以以立立体体成成像像的的
28、形形式式表表达达出出来来。可可测测量量脑脑组组织织对对G的的利利用用和和脑脑的的局局部部血血流流量量（灵灵敏敏度度达达皮皮摩摩尔尔picomolar)7、核磁共振成像、核磁共振成像(Magneticresonanceimaging,MRI)BRAINSfromahealthyagedadult(left)andapatientwithAlzheimersBRAINSfromahealthyagedadult(left)andapatientwithAlzheimersdisease(right)differmarkedly.Theexecessofdarkshadinginthedisease(right)differmarkedly.Theexecessofdarkshadinginthesecondimageshowsthatbrainactivityisimpaired.secondimageshowsthatbrainactivityisimpaired.
