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1、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE一、什么是一、什么是SDS？十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠sodium dodecyl sulfate,SDS)是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体monomer和分子团和分子团micellae的混合形的混合形式存在。式存在。SDS的作用的作用 破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白量变性而改动原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而构成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。二、二、SDS-PAG
2、E的根本原理的根本原理一蛋白质分子的解聚一蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中参与离样品介质和聚丙烯酰胺中参与离子去污剂和强复原剂后，蛋白质亚基子去污剂和强复原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷要素可以被忽略。的大小，而电荷要素可以被忽略。1 1、SDSSDS 阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂 助溶性试剂助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级构造破坏蛋白质分子的二级和三级构造2 2、强复原复原剂 巯基乙醇基乙醇-mercaptoethanal-merca
3、ptoethanal 二硫二硫苏糖醇糖醇dithiothreitoldithiothreitol，DTTDTT 使半胱氨酸残基之使半胱氨酸残基之间的二硫的二硫键断裂。断裂。SDSSDS和复原剂的作用：和复原剂的作用：1 1分子被解聚或组成它们的多肽键分子被解聚或组成它们的多肽键2 2氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDSSDS充分结合构成带负充分结合构成带负 电荷的蛋白质电荷的蛋白质-SDS-SDS胶束。胶束。3 3蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束所带的负电荷大大超胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不同分子之间原有的电荷差别。了不同分子之间原有
4、的电荷差别。蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束的特点胶束的特点1 1外形像一个长椭圆棒外形像一个长椭圆棒2 2短轴对不同的蛋白质亚基短轴对不同的蛋白质亚基-SDS-SDS胶胶束根本上是一样的。束根本上是一样的。3 3长轴的长度那么与亚基分子量的长轴的长度那么与亚基分子量的大小成正比。大小成正比。 胶束在胶束在SDS-PAGESDS-PAGE系系统中的中的电泳迁泳迁移率不再受蛋白移率不再受蛋白质原有原有电荷的影响，荷的影响，而主要取决于而主要取决于椭圆棒的棒的长轴长度，即度，即蛋白蛋白质或或亚基分子量的大小。基分子量的大小。 当蛋白当蛋白质的分子量在的分子量在15KD200KD15KD200KD之
5、之间时，电泳迁移率与分子量的泳迁移率与分子量的对数数呈呈线性关系性关系3 3、影响、影响SDSSDS电泳的关键要素电泳的关键要素1 1 溶液中溶液中SDSSDS单体浓度单体浓度1mmol/L)1mmol/L) 大多数蛋白质与大多数蛋白质与SDSSDS结合的分量比为结合的分量比为1 1：1.41.42 2 样品缓冲液的离子强度不样品缓冲液的离子强度不0.26)0.26) 低离子强度的溶液中，低离子强度的溶液中，SDSSDS单体才具有单体才具有较高的平衡浓度。较高的平衡浓度。3 3 二硫键能否完全被复原二硫键能否完全被复原 当二硫键被彻底复原后，蛋白质分当二硫键被彻底复原后，蛋白质分子才干被解聚，
6、子才干被解聚，SDSSDS才干定量地结合到才干定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。数的线性关系。二缓冲系统的选择二缓冲系统的选择 普通情况下，在被分析的蛋白质普通情况下，在被分析的蛋白质稳定的稳定的pHpH范围，凡不与范围，凡不与SDSSDS发生相互作发生相互作用的缓冲液都可以运用，但缓冲液的用的缓冲液都可以运用，但缓冲液的选择对蛋白质的分别和电泳的速度是选择对蛋白质的分别和电泳的速度是非常关键的。非常关键的。电泳缓冲液的种类：电泳缓冲液的种类：1 1、磷酸缓冲液、磷酸缓冲液2 2、Tris-Tris-醋酸钠缓冲系统醋酸钠缓冲系统3 3、咪
7、唑缓冲液系统：、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍。度要比后者快一倍。4 4、尿素系统：、尿素系统： 适用分子量低于适用分子量低于15KD15KD的蛋白样品。的蛋白样品。5 5、Tris-Tris-甘氨酸系统：甘氨酸系统： 运用最多的缓冲液运用最多的缓冲液6 6、Tris-Tris-硼酸盐缓冲液：硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量测定糖蛋白的分子量三凝胶浓度的选择三凝胶浓度的选择 由于由于SDSSDS电泳分别并不取决于蛋白电泳分别并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-SDS-蛋白质
8、胶束的大小，因此凝胶浓蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。度的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度不同的凝胶浓度. .四分子量四分子量测定定1 1、相、相对迁移率迁移率RfRf Rf Rf即用每个即用每个带的迁移的迁移间隔除以溴酚隔除以溴酚蓝前沿的迁移前沿的迁移间隔得到的。隔得到的。 丈量位置丈量位置应在蛋白在蛋白带的中央。的中央。 蛋白蛋白带迁移迁移间隔隔Rf= Rf= 溴酚溴酚蓝迁移迁移间隔隔 蛋白带迁移间隔 固定前的凝胶长度 Rf= X 枯燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移间隔2 2、作图、作图 以知蛋白质分子量的常用对
9、数值为纵坐标，以知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，RfRf为横坐标绘图为横坐标绘图3 3、经过测定未知蛋白质的、经过测定未知蛋白质的RfRf值，便可在标值，便可在标 准曲线上读出他的分子量准曲线上读出他的分子量三、去污剂的选择三、去污剂的选择无离子去污剂：无离子去污剂：Lubro WLubro W；Brij35Brij35， Tween Tween Triton Triton阳离子去污剂：阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium cetyltrimethyl ammonium bromide bromide CTABCTAB cetylpyyridinium cetylp
10、yyridinium CPCCPC阴离子去污剂：阴离子去污剂：SDS deoxycholateSDS deoxycholate四、方法四、方法1 1、分类、分类1 1根据对样品的处置方式的不同根据对样品的处置方式的不同 复原复原SDSSDS电泳电泳 非复原非复原SDSSDS电泳电泳 带有烷基化作用的复原带有烷基化作用的复原SDSSDS电泳电泳2 2根据缓冲系统和凝胶孔径的不同根据缓冲系统和凝胶孔径的不同 延续电泳延续电泳 不延续电泳不延续电泳3 3根据电泳的方式根据电泳的方式 圆盘电泳圆盘电泳 垂直电泳垂直电泳 平板电泳平板电泳 程度电泳程度电泳2 2、操作、操作1 1 制备分别胶制备分别胶2
11、 2 制备积层胶制备积层胶( (堆积胶堆积胶分别胶聚合之后分别胶聚合之后3 3 加样品加样品样品的处置样品的处置 在蛋白溶液中参与过量的在蛋白溶液中参与过量的SDSSDS后，可后，可引起以下的反响：引起以下的反响： 蛋白质本身的电荷被屏蔽蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂氢键断裂 疏水相互作用被取消疏水相互作用被取消 多肽被去折叠多肽被去折叠( (二级构造破坏二级构造破坏),),并构成并构成椭球形椭球形复原复原SDSSDS处置置 当参与复原当参与复原试剂DTTDTT或或-二二巯基乙醇后，基乙醇后，蛋白蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分被完全去折叠，只根据分子量分别。带有有烷基化作用的复原基化作用
12、的复原SDSSDS处置置 烷基化作用可以很好地并基化作用可以很好地并经久久结实地地维护SHSH基基团，而得到窄的，而得到窄的电泳泳带。非复原的非复原的SDSSDS处置置 许多多样品，如生理体液、血清或尿素，品，如生理体液、血清或尿素，普通只需用普通只需用1%SDS1%SDS在在100100煮沸煮沸3 3分分钟，并不需，并不需求加复原求加复原剂，此，此时二硫二硫键不能被断裂，蛋白不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠。并没有完全被去折叠。4 4 电泳电泳5 5 固定固定6 6 染色染色考考马斯亮斯亮蓝coomassie brilliant coomassie brilliant blueblueR-
13、250 R-250 三苯基甲三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含色，每个分子含有两个有两个SO3HSO3H基基团，偏酸性，和氨基黑，偏酸性，和氨基黑一一样也是也是结合在蛋白合在蛋白质的碱性基的碱性基团上。上。G-250 G-250 二甲花青亮二甲花青亮蓝，蓝绿色。色。银染色银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银染的机制是将蛋白带上的硝酸银银离子复原成金属银，以使银银银离子复原成金属银，以使银颗粒堆积在蛋白带上。颗粒堆积在蛋白带上。7 7 照相，凝胶枯燥照相，凝胶枯燥8 8 定量测定定量测定3 3、电泳泳过程中的不正常景象程中的不正常景象1 1“浅笑景象浅笑景象 指示指示剂前沿呈前沿呈现两两边向上的曲
14、向上的曲线形，形，阐明凝胶的不均匀冷却，中明凝胶的不均匀冷却，中间部部分冷却不好。分冷却不好。2 2“皱眉景象眉景象 由于垂直由于垂直电泳槽的安装不适宜引泳槽的安装不适宜引起的，特起的，特别是当凝胶和玻璃板是当凝胶和玻璃板组成的成的“三明治底部有气泡或接近隔片的凝三明治底部有气泡或接近隔片的凝胶聚合不完全。胶聚合不完全。3 3“拖尾景象拖尾景象 样品溶解不佳引起。品溶解不佳引起。4 4“纹理景象理景象由于由于样品中的不溶品中的不溶颗粒引起的。粒引起的。5 5偏斜景象偏斜景象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起引起6 6带太宽带太宽 加样量太多或加样孔走漏引
15、起加样量太多或加样孔走漏引起Molecular mass versus molecular weightMolecular mass (symbol m) is expressed in Daltons (Da). One Dalton is defined as 1/12 the mass of carbon 12. Most macromolecules are large enough to use the kiloDalton (kDa) to describe molecular mass. Molecular weight is not the same as molecular
16、mass. It is also known as relative molecular mass (symbol Mr, where r is a subscript). Molecular weight is defined as the ratio of the mass of a macromolecule to 1/12 the mass of a carbon 12 atom. It is a dimensionless quantity.When the literature gives a mass in Da or kDa it refers to molecular mass. It is incorrect to express molecular weight (relative molecular mass) in Daltons. Nevertheless you will find the term molecular weight used with Daltons or kiloDaltons in some literature, often using the abbreviation MW for molecular weight.
