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1、二轮专题突破二轮专题突破第一部分第一部分专题九现代生物科技专题专题九现代生物科技专题第第16讲基因工程与细胞工程讲基因工程与细胞工程1.基基因因工工程程的的诞诞生生() 2.基基因因工工程程的的原原理理及及技技术术(含含PCR技技术术)()3.基基因因工工程程的的应应用用()4.蛋蛋白白质质工工程程()5.植植物物的的组组织织培培养养()6.动动物物细细胞胞培养与体细胞克隆培养与体细胞克隆()7.细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体()0202真题研究探究规律0303考点突破练透题型栏目导航0101构建网络排查缺漏0404核心素养强化落实0101构建网络排查缺漏DNA连接酶连接酶基因表达载
2、体的构建基因表达载体的构建基因基因细胞的全能性、细胞膜的流动性细胞的全能性、细胞膜的流动性细胞增殖细胞增殖动物细胞核的全能性动物细胞核的全能性给小鼠注射抗原给小鼠注射抗原产生专一抗体的杂交瘤细胞产生专一抗体的杂交瘤细胞(1)限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶、DNA连接接酶酶和和质粒是基因工程中常用的三种工具粒是基因工程中常用的三种工具酶酶。()(2)Ecoli DNA连接接酶酶既可既可连接平末端，又可接平末端，又可连接黏性末端。接黏性末端。()(3)载体的作用是携体的作用是携带目的基因目的基因导入受体入受体细胞中，使之胞中，使之稳定存在并表达。定存在并表达。 ()(4)应用用DNA探探针技技术
3、，可可以以检测转基基因因抗抗冻番番茄茄植植株株中中目目的的基基因因的的存存在在及及其其完完全表达。全表达。()(5)蛋蛋白白质工工程程是是在在分分子子水水平平上上对蛋蛋白白质分分子子直直接接进行行操操作作，定定向向改改变分分子子的的结构。构。() (6)愈愈伤组织是外植体通是外植体通过脱分化和再分化后形成的。脱分化和再分化后形成的。()(7)利用物理法或化学法可以直接将两个植物利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞胞进行行诱导融合。融合。()(8)制制备肝肝细胞胞悬液液时先用剪刀剪碎肝先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白，再用胃蛋白酶酶处理。理。()(9)与与“多多利利”羊羊等等克克隆隆哺哺乳乳动
4、物物相相关关的的技技术有有胚胚胎胎移移植植、细胞胞培培养养和和核核移移植植技技术。()(10)体体细胞胞杂交技交技术可用于克隆可用于克隆动物和制物和制备单克隆抗体。克隆抗体。()1推推测限制限制酶酶存在于原核生物中的作用。存在于原核生物中的作用。提提示示：原原核核生生物物容容易易受受到到自自然然界界外外源源DNA的的入入侵侵，但但是是生生物物在在长长期期的的进进化化过过程程中中形形成成了了一一套套完完善善的的防防御御机机制制，以以防防止止病病原原物物的的侵侵害害。当当外外源源DNA侵侵入入时时，限限制制酶酶会将会将DNA切割掉，以保证自身的安全。切割掉，以保证自身的安全。 2作作为基因工程表达
5、基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？什么？提提示示：不不可可以以。因因为为目目的的基基因因在在表表达达载载体体中中得得到到表表达达并并发发挥挥作作用用，还还需需要要有有其其他控制元件，如启动子、终止子、标记基因等。他控制元件，如启动子、终止子、标记基因等。3利用大利用大肠杆菌可以生杆菌可以生产人的胰人的胰岛素，能生素，能生产人的糖蛋白人的糖蛋白吗？提提示示：在在蛋蛋白白质质的的肽肽链链上上加加上上糖糖链链，需需要要内内质质网网和和高高尔尔基基体体才才能能完完成成，大大肠肠杆杆菌不存在这两种细胞器，故大肠杆菌不能合成糖蛋白。菌不存在这两种细
6、胞器，故大肠杆菌不能合成糖蛋白。0202真题研究探究规律1(2018全国全国，T38)回答下列回答下列问题：(1)博博耶耶( H. Boyer)和和科科恩恩(S. Coben)将将非非洲洲爪爪蟾蟾核核糖糖体体蛋蛋白白基基因因与与质粒粒重重组后后导入入大大肠杆杆菌菌细胞胞中中进行行了了表表达达，该研研究究除除证明明了了质粒粒可可以以作作为载体体外外，还证明明了了_(答答出两点即可出两点即可)。体外重组的质粒可以进入体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达体外重组的质粒可以进入体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)体体外外重重组的的质粒粒可可通通过Ca2参参与与的的_方方法法导入入大大肠杆杆
7、细菌菌细胞胞：而而体体外外重重组的的噬噬菌菌体体DNA通通常常需需与与_组装装成成完完整整噬噬菌菌体体后后，才才能能通通过侵侵染染的的方方法法将将重重组的的噬噬菌菌体体DNA导入入宿宿主主细胞胞，在在细菌菌、心心肌肌细胞胞、叶叶肉肉细胞中，可作胞中，可作为重重组噬菌体宿主噬菌体宿主细胞的是胞的是_。(3)真真核核生生物物基基因因(目目的的基基因因)在在大大肠杆杆菌菌细胞胞内内表表达达时，表表达达出出的的蛋蛋白白质可可能能会会被被降降解解。为防防止止蛋蛋白白质被被降降解解，在在实验中中应选用用_的的大大肠杆杆菌菌作作为受体受体细胞，在蛋白胞，在蛋白质纯化的化的过程中程中应添加添加_的抑制的抑制剂
8、。转化转化外壳蛋白外壳蛋白(或噬菌体蛋白或噬菌体蛋白)细菌细菌蛋白酶缺陷型蛋白酶缺陷型蛋白酶蛋白酶解解析析：(1)将将非非洲洲爪爪蟾蟾核核糖糖体体蛋蛋白白基基因因与与质质粒粒重重组组后后导导入入大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞中中进进行行了了表表达达，该该过过程程证证明明了了体体外外重重组组的的质质粒粒可可以以进进入入体体细细胞胞，真真核核生生物物基基因因可可在在原原核核细细胞胞中表达等。中表达等。(2)体体外外重重组组的的质质粒粒可可通通过过Ca2处处理理，目目的的是是以以增增大大细细胞胞的的通通透透性性，使使重重组组的的质质粒粒能能够够导导入入到到受受体体细细胞胞内内，因因此此体体外外重重组组的的
9、质质粒粒可可通通过过Ca2参参与与的的转转化化方方法法导导入入大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞。体体外外重重组组的的噬噬菌菌体体DNA通通常常需需与与蛋蛋白白质质外外壳壳组组装装成成完完整整的的噬噬菌菌体体后后，才才能能通通过过侵侵染染的的方方法法将将重重组组噬噬菌菌体体DNA导导入入受受体体细细胞胞，噬噬菌菌体体侵侵染染的的是是细细菌菌，而而不不能寄生在其它细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。能寄生在其它细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真真核核生生物物基基因因(目目的的基基因因)在在大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞内内表表达达时时，表表达达出出的的蛋蛋白白质质可可能能会会被被降
10、降解解，为为防防止止蛋蛋白白质质被被降降解解，可可以以选选用用不不能能产产生生该该蛋蛋白白酶酶的的缺缺陷陷细细菌菌以以及及使使用用能能够够抑抑制制蛋蛋白白酶酶活活性性的的药药物物，因因此此为为防防止止蛋蛋白白质质被被降降解解，在在实实验验中中应应选选用用蛋蛋白白酶酶缺缺陷陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。2(2017全全国国，T38)真真核核生生物物基基因因中中通通常常有有内内含含子子，而而原原核核生生物物基基因因中中没没有有，原原核核生生物物没没有有真真核核生生物物所所具具有有的的切切除除
11、内内含含子子对应的的RNA序序列列的的机机制制。已已知知在在人人体体中中基因基因A(有内含子有内含子)可以表达出某种特定蛋白可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白称蛋白A)。回答下列。回答下列问题：(1)某某同同学学从从人人的的基基因因组文文库中中获得得了了基基因因A，以以大大肠杆杆菌菌作作为受受体体细胞胞却却未未得得到到蛋蛋白白A，其其原原因因是是_ _。(2)若若用用家家蚕蚕作作为表表达达基基因因A的的载体体，在在噬噬菌菌体体和和昆昆虫虫病病毒毒两两种种载体体中中，不不选用用_作作为载体，其原因是体，其原因是_。基基因因A有有内内含含子子，在在大大肠杆杆菌菌中中，其其初初始始转录产物物中中与与内
12、内含子含子对应的的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白序列不能被切除，无法表达出蛋白A 噬菌体噬菌体噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕(3)若若要要高高效效地地获得得蛋蛋白白A，可可选用用大大肠杆杆菌菌作作为受受体体，因因为与与家家蚕蚕相相比比，大大肠杆菌具有杆菌具有_(答出两点即可答出两点即可)等等优点。点。(4)若若要要检测基基因因A是是否否翻翻译出出蛋蛋白白A，可可用用的的检测物物质是是_ (填填“蛋白蛋白A的基因的基因”或或“蛋白蛋白A的抗体的抗体”)。(5)艾艾弗弗里里等等人人的的肺肺炎炎双双球球菌菌转化化实验为证明明DNA是是遗传物物质做做出出了了重重要要
13、贡献献，也也可可以以说是是基基因因工工程程的的先先导，如如果果说他他们的的工工作作为基基因因工工程程理理论的的建建立立提提供供了了启启示示，那么，那么，这一启示是一启示是_。繁殖快、容易培养繁殖快、容易培养蛋白蛋白A的抗体的抗体DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体可以从一种生物个体转移到另一种生物个体解解析析：(1)基基因因A的的编编码码区区中中有有内内含含子子和和外外显显子子，在在真真核核生生物物细细胞胞内内把把内内含含子子转转录录来来的的RNA切切除除，而而原原核核生生物物细细胞胞内内基基因因转转录录后后不不切切除除，转转录录后后直直接接表表达达，所所以以翻翻译形成的蛋白质不是译形
14、成的蛋白质不是A蛋白。蛋白。(2)由由于于噬噬菌菌体体是是专专性性寄寄生生在在细细菌菌体体内内的的病病毒毒，无无法法侵侵染染到到真真核核生生物物家家蚕蚕细细胞胞内内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。(3)大大肠肠杆杆菌菌作作为为受受体体菌菌具具有有繁繁殖殖周周期期短短、易易培培养养、遗遗传传物物质质含含量量少少、产产物物易易分分离、不会造成基因污染等。离、不会造成基因污染等。(4)检检测测目目的的基基因因是是否否表表达达通通常常用用抗抗原原抗抗体体杂杂交交技技术术，注注入入抗抗体体看看是
15、是否否出出现现杂杂交带，若出现则表达。交带，若出现则表达。(5)艾艾弗弗里里等等人人的的肺肺炎炎双双球球菌菌转转化化实实验验为为证证明明DNA是是遗遗传传物物质质做做出出了了重重要要贡贡献献，不不仅仅证证明明了了生生物物的的遗遗传传物物质质是是DNA，还还证证明明了了DNA可可以以从从一一种种生生物物转转移移到到另另一一种种生生物个体。物个体。3(2015全全国国，T40)已已知知生生物物体体内内有有一一种种蛋蛋白白质(P)，该蛋蛋白白质是是一一种种转运运蛋蛋白白，由由305个个氨氨基基酸酸组成成。如如果果将将P分分子子中中158位位的的丝氨氨酸酸变成成亮亮氨氨酸酸，240位位的的谷谷氨氨酰胺
16、胺变成成苯苯丙丙氨氨酸酸，改改变后后的的蛋蛋白白质(P1)不不但但保保留留P的的功功能能，而而且且具具有有了了酶酶的的催催化化活活性。回答下列性。回答下列问题：(1)从从上上述述资料料可可知知，若若要要改改变蛋蛋白白质的的功功能能，可可以以考考虑对蛋蛋白白质的的_进行改造。行改造。(2)以以P基基因因序序列列为基基础，获得得P1基基因因的的途途径径有有修修饰_基基因因或或合合成成_基基因因，所所获得得的的基基因因表表达达时是是遵遵循循中中心心法法则的的，中中心心法法则的的全全部部内内容容包包括括_的的复复制制；以以及及遗传信信息息在在不不同同分分子子之之间的的流流动，即即：_。氨基酸序列氨基酸
17、序列(或结构或结构)PP1DNA和和RNA(或遗传物质或遗传物质)DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质蛋白质(或转录、逆转录、翻译或转录、逆转录、翻译)(3)蛋蛋白白质工工程程也也被被称称为第第二二代代基基因因工工程程，其其基基本本途途径径是是从从预期期蛋蛋白白质功功能能出出发，通通过_和和_，进而而确确定定相相对应的的脱脱氧氧核核苷苷酸酸序序列列，据据此此获得得基基因因，再再经表表达达、纯化化获得得蛋蛋白白质，之之后后还需需要要对蛋蛋白白质的的生生物物_进行行鉴定。定。设计蛋白质结构设计蛋白质结构推测氨基酸序列推测氨基酸序列功能功能 解析：解析：(1)由题干信息可知改造蛋白质的功能，可通
18、过改变蛋白质的结构实现。由题干信息可知改造蛋白质的功能，可通过改变蛋白质的结构实现。(2)依依据据蛋蛋白白质质工工程程的的定定义义及及题题中中信信息息可可知知获获得得P1基基因因的的途途径径有有修修饰饰现现有有(P)基基因因或或合合成成新新(P1)基基因因。中中心心法法则则的的全全部部内内容容包包括括：DNA的的复复制制、RNA的的复复制制、转转录录、逆转录和翻译。逆转录和翻译。(3)蛋蛋白白质质工工程程的的基基本本途途径径：从从预预期期的的蛋蛋白白质质功功能能出出发发设设计计预预期期的的蛋蛋白白质质结结构构推推测测应应有有的的氨氨基基酸酸序序列列找找到到相相应应的的脱脱氧氧核核苷苷酸酸序序列
19、列。通通过过蛋蛋白白质质工工程程合合成成的的蛋蛋白质还需要进行生物活性的鉴定即功能鉴定，看是否达到人们的需求。白质还需要进行生物活性的鉴定即功能鉴定，看是否达到人们的需求。4(2018全全国国，T38)某某种种荧光光蛋蛋白白(GFP)在在紫紫外外光光或或蓝光光激激发下下会会发出出绿色色荧光光，这一一特特性性可可用用于于检测细胞胞中中目目的的基基因因的的表表达达。某某科科研研团队将将某某种种病病毒毒的的外外壳壳蛋蛋白白(L1)基基因因连接接在在GFP基基因因的的5末末端端，获得得了了L1GFP融融合合基基因因(简称称为甲甲)，并并将将其其插插入入质粒粒P0，构构建建了了真真核核表表达达载体体P1
20、，其其部部分分结构构和和酶酶切切位位点点的的示示意意图如如下下，图中中E1E4四种限制四种限制酶酶产生的黏性末端各不相同。生的黏性末端各不相同。启启动子子L1基因基因GFP基因基因终止子止子 E1 E2 E3 E4回答下列回答下列问题：(1)据据图推推断断，该团队在在将将甲甲插插入入质粒粒P0时，使使用用了了两两种种限限制制酶酶，这两两种种酶酶是是_。使使用用这两两种种酶酶进行行酶酶切切是是为了了保保证_，也也是是为了了保保证_。(2)将将P1转入入体体外外培培养养的的牛牛皮皮肤肤细胞胞后后，若若在在该细胞胞中中观察察到到了了绿色色荧光光，则说明明L1基因在牛的皮肤基因在牛的皮肤细胞中完成了胞
21、中完成了_和和_过程。程。(3)为了了获得得含含有有甲甲的的牛牛，该团队需需要要做做的的工工作作包包括括：将将能能够产生生绿色色荧光光细胞胞的的_移入牛的移入牛的_中、体外培养、胚胎移植等。中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了了检测甲甲是是否否存存在在于于克克隆隆牛牛的的不不同同组织细胞胞中中，某某同同学学用用PCR方方法法进行行鉴定定，在在鉴定定时应分分别以以该牛牛不不同同组织细胞胞中中的的_(填填“mRNA”“总RNA”或或“核核DNA”)作作为PCR模板。模板。E1和和E4甲的完整甲的完整甲与载体正确连接甲与载体正确连接转录转录翻译翻译细胞核细胞核去核卵母细胞去核卵母细胞核核DNA解解析
22、析：(1)要要保保证证目目的的基基因因在在受受体体细细胞胞中中能能够够正正确确表表达达，目目的的基基因因的的首首端端应应有有启启动动子子，尾尾端端应应有有终终止止子子。甲甲是是将将某某种种病病毒毒的的外外壳壳蛋蛋白白(L1)基基因因连连接接在在GFP基基因因的的5末末端端而而获获得得的的L1GFP融融合合基基因因，据据此此结结合合题题意意并并分分析析图图示示可可知知：该该团团队队在在将将甲甲插插入入质质粒粒P0时时，如如果果用用E2或或E3，则则目目的的基基因因不不完完整整，而而使使用用E1和和E4这这两两种种限限制制酶酶进进行行酶酶切切保保证证了了甲甲的的完完整整，而而且且也也保保证证了了甲
23、甲与与载载体体正正确确连连接接，因因此此，使使用用的的两两种种限限制制酶，是酶，是E1和和E4。(2)构构建建的的真真核核表表达达载载体体P1中中含含有有GFP基基因因，而而GFP基基因因的的表表达达产产物物“某某种种荧荧光光蛋蛋白白(GFP)”在在紫紫外外光光或或蓝蓝光光激激发发下下会会发发出出绿绿色色荧荧光光。若若在在导导入入P1的的牛牛皮皮肤肤细细胞胞中中观观察察到到了了绿绿色色荧荧光光，则则说说明明L1基基因因在在牛牛的的皮皮肤肤细细胞胞中中完完成成了了表表达达。基基因因的的表表达达过过程程包包括转录和翻译。括转录和翻译。(3)若若要要获获得得含含有有甲甲的的牛牛，可可采采用用核核移移
24、植植技技术术，即即将将能能够够产产生生绿绿色色荧荧光光细细胞胞的的细细胞胞核核移移入入牛牛的的去去核核卵卵母母细细胞胞中中获获得得重重组组细细胞胞，并并将将该该重重组组细细胞胞在在体体外外培培养养成成重重组组胚胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR是是多多聚聚酶酶链链式式反反应应的的缩缩写写，是是一一种种在在生生物物体体外外复复制制特特定定DNA片片断断的的核核酸酸合合成成技技术术。若若利利用用PCR方方法法检检测测甲甲是是否否存存在在于于克克隆隆牛牛的的不不同同组组织织细细胞胞中中，则则应应分分别别以该牛不同组织细胞中的核以该牛不同组织细胞中的
25、核DNA作为作为PCR模板。模板。5(2013全全国国，T40)甲甲、乙乙是是染染色色体体数数目目相相同同的的两两种种二二倍倍体体药用用植植物物，甲甲含含有有效效成成分分A，乙乙含含有有效效成成分分B。某某研研究究小小组拟培培育育同同时含含有有A和和B的的新新型型药用用植植物物。回答下列回答下列问题：(1)为了了培培育育该新新型型药用用植植物物，可可取取甲甲和和乙乙的的叶叶片片，先先用用_酶酶和和_酶酶去去除除细胞胞壁壁，获得得具具有有活活力力的的_，再再用用化化学学诱导剂诱导二二者者融融合合。形形成成的的融融合合细胞胞进一一步步培培养养形形成成_组织，然然后后经过_形形成成完完整整的的杂种植
26、株。种植株。这种培育技种培育技术称称为_。纤维素纤维素果胶果胶原生质体原生质体愈伤愈伤再分化再分化(分化分化)植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术(2)上上述述杂种种植植株株属属于于多多倍倍体体，多多倍倍体体是是指指_ _。假假设甲甲与与乙乙有有性性杂交交的的后后代代是是不不育育的的，而而上上述述杂种种植植株株是是可可育育的的，造造成成这种种差差异的原因是异的原因是_。(3)这种种杂交交植植株株可可通通过制制作作人人工工种种子子的的方方法法来来大大量量繁繁殖殖。经植植物物组织培培养养得得到到的的_等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。体体细胞胞中中含含有有
27、三三个个或或三三个个以以上上染染色体色体组的个体的个体在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常胚状体、不定芽、顶芽、腋芽胚状体、不定芽、顶芽、腋芽解解析析：(1)该该新新型型药药用用植植物物是是通通过过植植物物体体细细胞胞杂杂交交技技术术获获得得的的。要要获获得得有有活活力力的的原原生生质质体体才才能能进进行行体体细细胞胞杂杂交交，因因此此首首先先用用纤纤维维素素酶酶和和果果胶胶酶酶去去掉掉植植物物的的细细胞胞壁壁，然然后后用用PEG化化学学诱诱导导剂剂(物物理理方方法法：离离心心、振振动动等等)诱诱导导二二者者的的原
28、原生生质质体体整整合合。然然后后采采用用植植物物组组织织培培养养技技术术获获得得杂杂种种植植株株，植植物物组组织织培培养养的的主主要要过过程程是是：先先脱脱分分化化形形成成愈伤组织，然后再分化形成植物体，利用了植物细胞的全能性。愈伤组织，然后再分化形成植物体，利用了植物细胞的全能性。(2)如如果果植植物物甲甲、乙乙是是两两个个物物种种，二二者者不不能能通通过过有有性性杂杂交交产产生生可可育育后后代代，原原因因是是甲甲、乙乙有有性性杂杂交交所所产产生生的的后后代代在在减减数数分分裂裂过过程程中中同同源源染染色色体体联联会会异异常常，也也就就是是存存在在着着生生殖殖隔隔离离。但但植植物物甲甲、乙乙
29、通通过过植植物物体体细细胞胞杂杂交交技技术术产产生生的的后后代代却却是是可可育育的的，因因为为在在减减数数分分裂裂过过程程中中同同源源染染色色体体能能完完成成正正常常的的联联会会，产产生生正正常常的的配配子子。由由于于甲甲、乙乙都都是二倍体，因此，植物体细胞杂交得到的后代是异源多倍体是二倍体，因此，植物体细胞杂交得到的后代是异源多倍体(四倍体四倍体)。(3)人人工工种种子子生生产产不不受受气气候候、季季节节和和地地域域等等因因素素限限制制，而而且且可可以以避避免免后后代代不不发发生生性性状状分分离离等等优优点点，因因此此，植植物物细细胞胞工工程程重重要要的的应应用用之之一一是是制制备备人人工工
30、种种子子，用用到到的的核核心心技技术术是是植植物物组组织织培培养养技技术术。将将植植物物组组织织培培养养得得到到的的胚胚状状体体、不不定定芽芽、顶顶芽芽、腋腋芽芽等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。6(2017全全国国，T38)编码蛋蛋白白甲甲的的DNA序序列列(序序列列甲甲)由由A、B、C、D、E五五个片段个片段组成，成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如成，如图1所示。所示。 回答下列回答下列问题：(1)现要要通通过基基因因工工程程的的方方法法获得得蛋蛋白白乙乙，若若在在启启动子子的的下下游游直直接接接接
31、上上编码蛋蛋白白乙乙的的DNA序序列列(TTCGCTTCTCAGGAAGGA)，则所所构构建建的的表表达达载体体转入入宿宿主主细胞胞后后不不能能翻翻译出出蛋蛋白白乙乙，原原因因是是_ _。(2)某某同同学学在在用用PCR技技术获取取DNA片片段段B或或D的的过程程中中，在在PCR反反应体体系系中中加加入入了了DNA聚聚合合酶酶、引引物物等等，还加加入入了了序序列列甲甲作作为_，加加入入了了_作作为合成合成DNA的原料。的原料。编码乙乙的的DNA序序列列起起始始端端无无ATG，转录出出的的mRNA无起始密无起始密码子子 模板模板dNTP (3)现通通过基基因因工工程程方方法法获得得了了甲甲、乙乙
32、、丙丙三三种种蛋蛋白白，要要鉴定定这三三种种蛋蛋白白是是否否具具有有刺刺激激T淋淋巴巴细胞胞增增殖殖的的作作用用，某某同同学学做做了了如如下下实验：将将一一定定量量的的含含T淋淋巴巴细胞胞的的培培养养液液平平均均分分成成四四组，其其中中三三组分分别加加入入等等量量的的蛋蛋白白甲甲、乙乙、丙丙，另另一一组作作为对照照，培养并定期培养并定期检测T淋巴淋巴细胞胞浓度，度，结果如果如图2。由由图2 可可知知，当当细胞胞浓度度达达到到a时，添添加加蛋蛋白白乙乙的的培培养养液液中中T淋淋巴巴细胞胞浓度度不不再再增增加加，此此时若若要要使使T淋淋巴巴细胞胞继续增增殖殖，可可采采用用的的方方法法是是_。细 胞
33、胞 培培 养养 过 程程 中中 ， 培培 养养 箱箱 中中 通通 常常 要要 维 持持 一一 定定 的的 CO2浓 度度 ， CO2的的 作作 用用 是是_。仅根根据据图1、图2可可知知，上上述述甲甲、乙乙、丙丙三三种种蛋蛋白白中中，若若缺缺少少_(填填“A”“B” “C”“D”或或“E”)片段所片段所编码的的肽段，段，则会降低其刺激会降低其刺激T淋巴淋巴细胞增殖的效果。胞增殖的效果。进行细胞传代培养进行细胞传代培养维持培养液的维持培养液的pHC 解解析析：(1)题题干干信信息息基基因因序序列列(TTCG)，可可知知其其转转录录出出的的mRNA上上没没有有起起始始密码子密码子AUG。(2)根根
34、据据PCR的的条条件件需需要要，引引物物、耐耐高高温温DNA聚聚合合酶酶、模模板板、四四种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸作为原料。酸作为原料。(3)T细细胞胞浓浓度度之之所所以以不不增增加加是是因因为为营营养养物物质质耗耗尽尽，所所以以可可以以更更换换培培养养液液，补补充充营养物质；营养物质；CO2作用为课本基础知识。作用为课本基础知识。(4)据据图图分分析析，丙丙与与对对照照接接近近说说明明BD片片段段重重要要性性较较弱弱，甲甲和和乙乙都都有有较较大大影影响响，他们中共同的片段是他们中共同的片段是C，所以缺少，所以缺少C片段会降低效果。片段会降低效果。7(2014全全国国，T40)某某研研究究
35、者者用用抗抗原原(A)分分别免免疫疫3只只同同种种小小鼠鼠(X、Y和和Z)，每每只只小小鼠鼠免免疫疫5次次，每每次次免免疫疫一一周周后后测定定各各小小鼠鼠血血清清抗抗体体的的效效价价(能能检测出出抗抗原原抗抗体体反反应的血清最大稀的血清最大稀释倍数倍数)，结果如下果如下图所示。所示。 若若要要制制备杂交交瘤瘤细胞胞，需需取取免免疫疫后后小小鼠鼠的的B淋淋巴巴细胞胞(染染色色体体数数目目为40条条)，并并将将该细胞胞与与体体外外培培养养的的小小鼠鼠骨骨髓髓瘤瘤细胞胞(染染色色体体数数目目为60条条)按按一一定定比比例例加加入入试管管中中，再再加加入入聚聚乙乙二二醇醇诱导细胞胞融融合合，经筛选培培
36、养养及及抗抗体体检测，得得到到不不断断分分泌泌抗抗A抗抗体体的的杂交瘤交瘤细胞。胞。回答下列回答下列问题：(1)制制备融融合合所所需需的的B淋淋巴巴细胞胞时，所所用用免免疫疫小小鼠鼠的的血血清清抗抗体体效效价价需需达达到到16 000以以上上，则小小鼠鼠最最少少需需要要经过_次次免免疫疫后后才才能能有有符符合合要要求求的的。达达到到要要求求的的X、Y、Z这3只只免免疫疫小小鼠鼠中中，最最适适合合用用于于制制备B淋淋巴巴细胞胞的的是是_小小鼠鼠，理理由由是是_。4YY小鼠的血清抗体效价最高小鼠的血清抗体效价最高(2)细胞胞融融合合实验完完成成后后，融融合合体体系系中中除除含含有有未未融融合合的的
37、细胞胞和和杂交交瘤瘤细胞胞外外，可可能能还有有_，体体系系中出中出现多种多种类型型细胞的原因是胞的原因是_。(3)杂交瘤交瘤细胞中有胞中有_个个细胞核，染色体数目最多是胞核，染色体数目最多是_条。条。(4)未未 融融 合合 的的 B淋淋 巴巴 细 胞胞 经 过 多多 次次 传 代代 培培 养养 后后 都都 不不 能能 存存 活活 ， 原原 因因 是是_。B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞 细胞融合是随机的，且融合率达不到细胞融合是随机的，且融合率达不到100% 1100不能无限增殖不能无限增殖解解析析：(1) 在在
38、第第四四次次免免疫疫后后，Y的的血血清清抗抗体体效效价价大大于于16 000，所所以以最最少少需需要要经经过过四四次次免免疫疫。由由图图可可知知，血血清清抗抗体体效效价价均均达达到到 16 000 以以上上时时，Y的的效效价价最最大大，最最适适合合用用于于制制备备B淋淋巴巴细细胞胞。(2)B细细胞胞与与骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞在在一一起起融融合合时时，可可能能发发生生B细细胞胞与与骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞融融合合，B细细胞胞之之间间的的融融合合，骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞之之间间的的融融合合。由由于于细细胞胞融融合合是是随随机机的的，且且融融合合率率达达不不到到100%故故体体系系中中会会出出现现多多种种类
39、类型型的的细细胞胞。(3)由由于于核核膜膜也也具具有有流流动动性性，故故小小鼠鼠的的免免疫疫 B 淋淋巴巴细细胞胞核核与与其其骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞核核会会融融合合形形成成一一个个杂杂交交的的细细胞胞核核。B细细胞胞有有40条条染染色色体体，骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞有有60条条染染色色体体，融融合合后后的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞有有100条条染染色色体体。(4)未融合的未融合的B淋巴细胞是已分化的细胞，不能无限增殖，所以多次培养后不能存活。淋巴细胞是已分化的细胞，不能无限增殖，所以多次培养后不能存活。考点一基因工程考点一基因工程0303考点突破练透题型1基因工程的基本工具基因工程的基本工具(1)限制酶
40、限制酶DNA酶酶解旋酶解旋酶限限制制酶酶是是切切割割某某种种特特定定的的脱脱氧氧核核苷苷酸酸序序列列，并并使使两两条条链链在在特特定定的的位位置置断断开开；DNA酶酶是是将将DNA水水解解为为基基本本组组成成单单位位；解解旋旋酶酶是是将将DNA的的两两条条链链间间的的氢氢键键打打开开形形成两条单链。成两条单链。(2)使用限制酶的注意点使用限制酶的注意点一般用同种限制酶切割载体和目的基因。一般用同种限制酶切割载体和目的基因。不同的限制酶也能切割出相同的黏性末端。不同的限制酶也能切割出相同的黏性末端。(3)DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶DNA连连接接酶酶连连接接两两个个DNA片片段段，而而D
41、NA聚聚合合酶酶只只能能将将单单个个脱脱氧氧核核苷苷酸酸添添加加到到脱氧核苷酸链上。脱氧核苷酸链上。2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序(1)目的基因的目的基因的获取途径取途径方法方法具体操作具体操作直接分离直接分离从自然界已有的物种中分离，如从基因文从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中中获取取人人工工合合成成化学合成化学合成已知核苷酸序列的已知核苷酸序列的较小基因，直接利用小基因，直接利用DNA合成合成仪用化用化学方法合成，不需要模板学方法合成，不需要模板逆逆转录法法以以mRNA为模板，在逆模板，在逆转录酶酶作用下人工合成作用下人工合成(2)基因表达基因表达载体的构建体的构建重
42、重组质粒的构建粒的构建表达表达载体的体的组成：目的基因启成：目的基因启动子子终止子止子标记基因复制原点。基因复制原点。启启动子子和和终止止子子：启启动子子是是RNA聚聚合合酶酶结合合位位点点，启启动转录；终止止子子是是终止止转录的位点。的位点。(3)将目的基因将目的基因导入受体入受体细胞胞植物植物细胞胞动物物细胞胞微生物微生物细胞胞常用常用方法方法农杆菌杆菌转化法、基因化法、基因枪法、花粉管通道法法、花粉管通道法显微注射技微注射技术感受感受态细胞法胞法(用用Ca2处理理)受体受体细胞胞受精卵、体受精卵、体细胞胞受精卵受精卵原核原核细胞胞(1)基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。基因工程中的载
43、体与细胞膜上的载体不同。(2)启动子、终止子启动子、终止子启动子启动子(DNA片段片段)起始密码子起始密码子(位于位于mRNA上上)。终止子终止子(DNA片段片段)终止密码子终止密码子(位于位于mRNA上上)。3蛋白质工程蛋白质工程1(2017全全国国，T38)几几丁丁质是是许多多真真菌菌细胞胞壁壁的的重重要要成成分分，几几丁丁质酶酶可可催催化化几几丁丁质水水解解。通通过基基因因工工程程将将几几丁丁质酶酶基基因因转入入植植物物体体内内，可可增增强强其其抗抗真真菌菌病病的的能能力。回答下列力。回答下列问题：(1)在在进行行基基因因工工程程操操作作时，若若要要从从植植物物体体中中提提取取几几丁丁质
44、酶酶的的mRNA，常常选用用嫩嫩叶而不叶而不选用老叶作用老叶作为实验材料，原因是材料，原因是_。提取提取RNA时，提取液中需添加，提取液中需添加RNA酶酶抑制抑制剂，其目的是，其目的是_。(2)以以mRNA为材材料料可可以以获得得cDNA，其其原原理理是是_ _。嫩叶组织细胞易破碎嫩叶组织细胞易破碎防止防止RNA降解降解在在逆逆转录酶酶的的作作用用下下，以以mRNA为模板按照碱基互模板按照碱基互补配配对的原的原则可以合成可以合成cDNA(3)若若要要使使目目的的基基因因在在受受体体细胞胞中中表表达达，需需要要通通过质粒粒载体体而而不不能能直直接接将将目目的的基基因因导入入受受体体细胞胞，原原因
45、因是是_ (答出两点即可答出两点即可)。(4)当当几几丁丁质酶酶基基因因和和质粒粒载体体连接接时，DNA连接接酶酶催催化化形形成成的的化化学学键是是_。(5)若若获得得的的转基基因因植植株株(几几丁丁质酶酶基基因因已已经整整合合到到植植物物的的基基因因组中中)抗抗真真菌菌病病的的能力没有提高，根据中心法能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是分析，其可能的原因是_。目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子磷酸二酯键磷酸二酯键目的基因的转录或翻译异常目的基因的转录或翻译异常解解析析：(1)在在进进行行基基因因工工程程操操作作时时，若若要要从从
46、植植物物体体中中提提取取几几丁丁质质酶酶的的mRNA，常常选选用用嫩嫩叶叶而而不不选选用用老老叶叶作作为为实实验验材材料料，原原因因是是嫩嫩叶叶组组织织细细胞胞易易破破碎碎。提提取取RNA时时，提取液中需添加提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。降解。(2)以以mRNA为为材材料料可可以以获获得得cDNA，其其原原理理是是在在逆逆转转录录酶酶的的作作用用下下，以以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若若要要使使目目的的基基因因在在受受体体细细胞胞中中表表达达，需需要要通通过过质质粒粒载载体体而而不
47、不能能直直接接将将目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞，原原因因是是目目的的基基因因无无复复制制原原点点、目目的的基基因因无无表表达达所所需需启启动动子子和和终终止止子。子。(4)当当几几丁丁质质酶酶基基因因和和质质粒粒载载体体连连接接时时，DNA连连接接酶酶催催化化形形成成的的化化学学键键是是磷磷酸酸二二酯键。酯键。(5)若若获获得得的的转转基基因因植植株株(几几丁丁质质酶酶基基因因已已经经整整合合到到植植物物的的基基因因组组中中)抗抗真真菌菌病病的的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译
48、异常。2(2016全全国国，T40)某某一一质粒粒载体体如如图所所示示，外外源源DNA插插入入到到Ampr或或Tetr中中会会导致致相相应的的基基因因失失活活(Ampr表表示示氨氨苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因，Tetr表表示示四四环素素抗抗性性基基因因)。有有人人将将此此质粒粒载体体用用BamH I酶酶切切后后，与与用用BamH I酶酶切切获得得的的目目的的基基因因混混合合，加加入入DNA连接接酶酶进行行连接接反反应，用用得得到到的的混混合合物物直直接接转化化大大肠杆杆菌菌，结果果大大肠杆杆菌菌有有的的未未被被转化化，有有的的被被转化化。被被转化化的的大大肠杆杆菌菌有有三三种种，分分别是是含
49、含有有环状状目目的的基基因因、含有含有质粒粒载体、含有插入了目的基因的重体、含有插入了目的基因的重组质粒的大粒的大肠杆菌。回答下列杆菌。回答下列问题：(1)质粒粒载体体作作为基基因因工工程程的的工工具具，应具具备的的基基本本条条件件有有_ _(答出两点即可答出两点即可)。而作而作为基因表达基因表达载体，除体，除满足上述基本条件外，足上述基本条件外，还需具有启需具有启动子和子和终止子。止子。(2)如如果果用用含含有有氨氨苄青青霉霉素素的的培培养养基基进行行筛选，在在上上述述四四种种大大肠杆杆菌菌细胞胞中中，未未被被转化化的的和和仅含含有有环状状目目的的基基因因的的细胞胞是是不不能能区区分分的的，
50、其其原原因因是是_ _；并并且且_和和_ _的的细胞胞也也是是不不能能区区分分的的，其其原原因因是是_。在在上上述述筛选的的基基础上上，若若要要筛选含含有有插插入入了了目目的的基基因因的的重重组质粒粒的的大大肠杆杆菌菌的的单菌菌落落，还需需使使用用含含有有_的固体培养基。的固体培养基。(3)基基因因工工程程中中，某某些些噬噬菌菌体体经改改造造后后可可以以作作为载体体，其其DNA复复制制所所需需的的原原料料来来自于自于_。能自我复制、具有能自我复制、具有 标记基因标记基因氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 二者均不含有二者均不含有含有质粒载体含有质粒
51、载体 含有插入含有插入了目的基因的重组质粒了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素四环素受体细胞受体细胞 解解析析：(1)质质粒粒载载体体作作为为基基因因工工程程的的工工具具，应应具具备备的的基基本本条条件件有有：能能够够自自我我复复制制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。(2)在在上上述述四四种种大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞中中，未未被被转转化化的的和和仅仅含含有有环环状状目目的的基基因因的的细细胞胞，因因二二者者
52、均均不不含含氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因，在在该该培培养养基基上上都都不不能能生生长长，所所以以是是不不能能区区分分的的；含含有有质质粒粒载载体体和和含含有有插插入入了了目目的的基基因因的的重重组组质质粒粒的的细细胞胞，因因二二者者都都含含氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因，在在该该培培养养基基上上都都能能生生长长，因因此此也也是是不不能能区区分分的的。在在上上述述筛筛选选的的基基础础上上，若若要要筛筛选选含含有有插插入入了了目目的的基基因因的的重重组组质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌的的单单菌菌落落，还还需需使使用用含含有有四四环环素素的的固固体体培培养养基基；因因目目的的基基因因插插
53、入入后后，导导致致四四环环素素抗抗性性基基因因(Tetr )失失活活，含含有有插插入入了了目目的的基基因因的的重重组组质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌在在该该培培养养基基中中不不能能生生长长，而而含含有有质质粒粒载载体体的的则则能能正正常生长。常生长。(3)噬噬菌菌体体是是专专门门寄寄生生在在细细菌菌细细胞胞中中的的病病毒毒，在在侵侵染染细细菌菌时时，噬噬菌菌体体的的DNA进进入入到到细细菌菌细细胞胞中中，而而蛋蛋白白质质外外壳壳仍仍留留在在细细胞胞外外；在在噬噬菌菌体体的的DNA的的指指导导下下，利利用用细细菌菌细细胞胞中中的的物物质质来来合合成成噬噬菌菌体体的的组组成成成成分分，据据此此可可推
54、推知知：基基因因工工程程中中，某某些些噬噬菌菌体体经经改造后可以作为载体，其改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。复制所需的原料来自于受体细胞。3(2018陕西第二次联考陕西第二次联考)根据基因工程的有关知根据基因工程的有关知识，回答下列，回答下列问题：(1)大大肠杆杆菌菌质粒粒常常作作为基基因因工工程程目目的的基基因因的的载体体，另另外外，_和和_也也可可作作为载体体。若若用用重重组质粒粒转化化大大肠杆杆菌菌，一一般般情情况况下下，不不能能直直接接用用未未处理理的的大大肠杆杆菌菌作作为受受体体细胞胞，原原因因是是_ _。(2)利利用用转基基因因技技术实现胰胰岛素素的的批批
55、量量生生产是是目目前前糖糖尿尿病病治治疗的的新新思思路路，该过程程中的关中的关键操作操作环节是是_。(3)对于于胰胰岛素素基基因因的的获取取，途途径径之之一一是是通通过提提取取_细胞胞中中的的胰胰岛素素mRNA，经过_过程合成，之后通程合成，之后通过_技技术大量大量扩增。增。噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物动植物病毒动植物病毒 未未处理理的的大大肠杆杆菌菌吸吸收收质粒粒(外外源源DNA)的能力极弱的能力极弱基因表达载体的构建基因表达载体的构建胰岛胰岛B逆转录逆转录PCR 解解析析：(1)基基因因工工程程常常用用的的运运载载体体有有大大肠肠杆杆菌菌质质粒粒、噬噬菌菌体体的的衍衍生生物物、动动植植物物
56、病病毒毒；未未处处理理的的大大肠肠杆杆菌菌吸吸收收质质粒粒(外外源源DNA)的的能能力力极极弱弱，因因此此不不能能直直接接用用未未处处理理的大肠杆菌作为受体细胞。的大肠杆菌作为受体细胞。(2)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。(3)胰胰岛岛素素基基因因只只能能在在胰胰岛岛B细细胞胞选选择择性性表表达达，因因此此应应该该从从胰胰岛岛B细细胞胞提提取取胰胰岛岛素素mRNA，经过逆转录形成胰岛素基因，再通过，经过逆转录形成胰岛素基因，再通过PCR技术大量扩增目的基因。技术大量扩增目的基因。4(2018安安徽徽滁滁州州期期末末)苹苹果果等等果果实的的果果肉肉细
57、胞胞液液泡泡中中有有丰丰富富的的无无色色的的多多酚酚类营养养物物质，其其他他一一些些囊囊泡泡结构构中中含含有有多多酚酚氧氧化化酶酶(PPO)，催催化化多多酚酚氧氧化化成成褐褐色色物物质，此此过程程称称为果果实褐褐变。科科学学家家利利用用基基因因沉沉默默技技术培培育育了了一一种种不不褐褐变的的转基基因因苹苹果果。回答下列回答下列问题：(1)将将目目的的基基因因导入入植植物物细胞胞采采用用最最多多的的方方法法是是_，该方方法法中中需需将将目的基因插入到目的基因插入到农杆菌的杆菌的_上。上。农杆菌转化法农杆菌转化法Ti质粒的质粒的TDNA(2)培培育育不不褐褐变的的苹苹果果采采用用的的是是第第二二代
58、代基基因因工工程程技技术，导入入的的是是苹苹果果细胞胞原原本本就就有有的的多多酚酚氧氧化化酶酶基基因因(PPO基基因因)，当当细胞胞内内有有许多多份份PPO基基因因时，PPO基基因因_形形成成的的mRNA之之间容容易易形形成成双双链区区而而失失去去_机机会会，从从而而导致致多多酚酚氧氧化化酶酶含含量量大大大大减减少少。基基因因沉沉默默分分为转录水水平平的的沉沉默默(TGS)和和转录后后水水平平的的沉沉默默(PTGS)，则培育不褐培育不褐变苹果的苹果的转基因沉默属于基因沉默属于_(填填“TGS”或或“PTGS”)。(3)可可用用_酶酶从从苹苹果果基基因因组中中切切取取PPO基基因因，也也可可用用
59、PCR技技术从从苹苹果果基基因因组中中克克隆隆出出PPO基基因因，则要要实现PCR定定点点克克隆隆DNA片片段段，最最关关键的的是是设计_。转录转录翻译翻译PTGS限制限制引物序列引物序列解解析析：(1)将将目目的的基基因因导导入入植植物物细细胞胞采采用用最最多多的的方方法法是是农农杆杆菌菌转转化化法法，此此外外还还有有基基因因枪枪法法、花花粉粉管管通通道道法法等等；该该方方法法中中，应应该该将将目目的的基基因因插插入入农农杆杆菌菌Ti质质粒粒的的TDNA(可转移可转移DNA)上。上。(2)PPO基基因因通通过过转转录录形形成成mRNA，若若形形成成的的mRNA过过多多，容容易易形形成成双双链
60、链区区，导导致致不不能能正正常常翻翻译译形形成成蛋蛋白白质质(多多酚酚氧氧化化酶酶)，导导致致多多酚酚氧氧化化酶酶含含量量大大大大降降低低；由由于于以以上过程导致翻译不能正常进行，因此属于转录后水平的沉默上过程导致翻译不能正常进行，因此属于转录后水平的沉默(PTGS)。(3)PPO基基因因为为目目的的基基因因，可可以以利利用用限限制制酶酶进进行行切切割割；实实现现PCR定定点点克克隆隆DNA片片段的技术是段的技术是PCR，该技术最关键是设计引物序列。，该技术最关键是设计引物序列。5(2018安安徽徽皖皖北北协协作作区区联联考考)某某些些微微生生物物能能表表达达黄黄曲曲霉霉毒毒素素B1(AFB1
61、)解解毒毒酶酶。将将该酶酶添添加加在在饲料料中中可可以以降降解解AFB1，清清除除其其毒毒性性。下下图为采采用用基基因因工工程程技技术生生产AFB1解毒解毒酶酶的流程的流程图。据据图回答回答问题：(1)过 程程 需需 要要 选 择 含含 解解 毒毒 酶酶 的的 菌菌 液液 中中 的的 细 胞胞 提提 取取 总 RNA， 理理 由由 是是_。(2)过程程中中，需需要要用用引引物物的的原原因因是是_ _。菌液中含解毒酶，意味着细胞中解毒酶基因的正常菌液中含解毒酶，意味着细胞中解毒酶基因的正常(完成了完成了)表达表达 DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA， 而只能从而只能从3端延
62、伸端延伸DNA链链 (3)构构建建酵酵母母工工程程菌菌最最常常用用的的运运载工工具具是是_，操操作作程程序序中中关关键环节是是_，检测酵酵母母工工程程菌菌中中AFB1解解毒毒酶酶基基因因是是否否转录，应采采用用_方法。方法。(4)采采用用蛋蛋白白质工工程程进一一步步改改造造该酶酶的的基基本本途途径径是是：从从提提高高酶酶的的活活性性出出发，设计预 期期 的的 _， 推推 测 应 有有 的的 氨氨 基基 酸酸 序序 列列 ， 找找 到到 相相 对 应 的的_。质粒质粒构建基因表达载体构建基因表达载体分子杂交分子杂交蛋白质结构蛋白质结构脱氧核苷酸序列脱氧核苷酸序列解解析析：(1)由由于于菌菌液液中
63、中含含解解毒毒酶酶，意意味味着着细细胞胞中中解解毒毒酶酶基基因因的的正正常常(完完成成了了)表表达达，所以过程所以过程应选择甲菌液的细胞提取总应选择甲菌液的细胞提取总RNA。(2)由由于于DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头头开开始始合合成成DNA，而而只只能能从从3端端延延伸伸DNA链链，因因此此过程过程中，需要用引物。中，需要用引物。(3)构构建建酵酵母母工工程程菌菌时时，常常用用的的运运载载体体是是质质粒粒，关关键键步步骤骤是是构构建建基基因因表表达达载载体体；转录的产物是转录的产物是mRNA，可以利用分子杂交法进行检测。，可以利用分子杂交法进行检测。(4)蛋蛋白白质质工工程程的的本本质质是
64、是通通过过基基因因改改造造或或基基因因合合成成，对对现现有有蛋蛋白白质质进进行行改改造造或或制制造造一一种种新新的的蛋蛋白白质质，所所以以设设计计预预期期的的蛋蛋白白质质结结构构，推推测测应应有有的的氨氨基基酸酸序序列列，找找到到相相对应的脱氧核苷酸序列，从而提高酶的活性。对应的脱氧核苷酸序列，从而提高酶的活性。考点二克隆技术考点二克隆技术1理清植物组织培养的流程理清植物组织培养的流程(1)条件：无菌、离体。条件：无菌、离体。(2)培养基组成：无机营养、有机营养、激素、琼脂。培养基组成：无机营养、有机营养、激素、琼脂。(3)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。植物组织培养中添加
65、蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。(4)植物组织培养的目的不同，培养阶段也就不同：植物组织培养的目的不同，培养阶段也就不同：若生产人工种子，则培养到胚状体阶段。若生产人工种子，则培养到胚状体阶段。若提取细胞产品，则一般培养到愈伤组织阶段。若提取细胞产品，则一般培养到愈伤组织阶段。若培育新个体，则应培养到试管苗阶段。若培育新个体，则应培养到试管苗阶段。2理清植物体细胞杂交技术理清植物体细胞杂交技术(1)酶酶解方法：用解方法：用纤维素素酶酶和果胶和果胶酶酶处理。理。(2)促融方法：促融方法：物理法：离心、振物理法：离心、振动、电激等；激等；化学法：聚乙二醇化学法：聚乙二醇(PEG)。(3)植植物物
66、体体细胞胞杂交交即即将将不不同同种种的的植植物物体体细胞胞，在在一一定定条条件件下下融融合合成成杂种种细胞胞，并并把把杂种种细胞胞培培育育成成新新的的植植物物体体的的过程程，不不管管是是染染色色体体数数、基基因因型型还是是染染色色体体组数数都采用直接相加的方法。都采用直接相加的方法。3动物细胞培养动物细胞培养(1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞。第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞。第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。(2)传代细胞的特点传代细胞的特
67、点传传代代培培养养到到10代代以以内内的的细细胞胞核核型型稳稳定定，1050代代时时部部分分细细胞胞核核型型发发生生变变化化，50代以后遗传物质可能发生变化。代以后遗传物质可能发生变化。(3)原代培养与传代培养的区别原代培养与传代培养的区别区区分分原原代代培培养养和和传传代代培培养养的的关关键键是是是是否否分分瓶瓶培培养养。贴贴壁壁生生长长到到一一定定程程度度需需要要用用胰蛋白酶处理，然后再分瓶培养，原代培养结束，开始传代培养。胰蛋白酶处理，然后再分瓶培养，原代培养结束，开始传代培养。(4)动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件无无菌菌、无无毒毒的的环环境境；特特殊殊营营养养：血血清清、血血浆浆
68、；适适宜宜的的温温度度和和pH；气气体体环境：含环境：含95%空气加空气加5%CO2的混合气体。的混合气体。4动物细胞核移植技术动物细胞核移植技术(1)选择受体细胞为去核卵母细胞的原因选择受体细胞为去核卵母细胞的原因营养丰富；营养丰富；体积大，易操作；体积大，易操作；含有激发细胞核全能性表达的物质。含有激发细胞核全能性表达的物质。(2)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：克隆动物遗传物质来自两个亲本。克隆动物遗传物质来自两个亲本。发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。发育过程中可能发生基因突变或染色体变异
69、。外界环境可能引起不遗传的变异。外界环境可能引起不遗传的变异。5动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体 (1)3种细胞特点不同种细胞特点不同免疫后的免疫后的B淋巴细胞：能分泌抗体，不能大量增殖。淋巴细胞：能分泌抗体，不能大量增殖。骨髓瘤细胞：能大量增殖，不能分泌抗体。骨髓瘤细胞：能大量增殖，不能分泌抗体。杂交瘤细胞：既能分泌抗体，又能大量增殖。杂交瘤细胞：既能分泌抗体，又能大量增殖。(2)2次筛选目的不同次筛选目的不同第第一一次次筛筛选选：利利用用特特定定选选择择培培养养基基筛筛选选，获获得得杂杂交交瘤瘤细细胞胞，即即AB型型细细胞胞(A为为B淋淋巴巴细细胞胞，B为为骨骨髓髓瘤瘤细细
70、胞胞)，该该细细胞胞既既能能分分泌泌抗抗体体又又能能大大量量增增殖殖，筛筛选选掉掉A、B、AA、BB型细胞。型细胞。第第二二次次筛筛选选：利利用用多多孔孔板板法法和和抗抗原原抗抗体体杂杂交交法法筛筛选选，获获得得产产生生特特异异性性抗抗体体的的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞。1(2017海海南南，T31)甲甲、乙乙两两名名同同学学分分别以以某某种种植植物物的的绿色色叶叶片片和和白白色色花花瓣瓣为材料，利用植物材料，利用植物组织培养技培养技术繁殖繁殖该植物。回答下列植物。回答下列问题：(1)以以该植植物物的的绿色色叶叶片片和和白白色色花花瓣瓣作作为外外植植体体，在在一一定定条条件件下下进行行组织培培养养
71、，均均能能获得得试管管苗苗，其其原原理理是是_ _。(2)甲甲、乙乙同同学学在在诱导愈愈伤组织所所用用的的培培养养基基中中，均均加加入入一一定定量量的的蔗蔗糖糖，蔗蔗糖糖水水解解后后可可得得到到_。若若要要用用细胞胞作作为材材料料进行行培培养养获得得幼幼苗苗，该细胞胞应具具备的的条条件件是是_(填填“具具有有完完整整的的细胞胞核核”“”“具具有有叶叶绿体体”或或“已已转入抗性基因入抗性基因”)。绿色叶片和白色花瓣的细胞具有全能性，在一定条件绿色叶片和白色花瓣的细胞具有全能性，在一定条件 下能发育成完整的植株下能发育成完整的植株葡萄糖、果糖葡萄糖、果糖具有完整的细胞核具有完整的细胞核(3)图中中
72、A、B、C所所示示的的是是不不同同的的培培养养结果果，该不不同同结果果的的出出现主主要要是是由由于于培培养养基基中中两两种种激激素素用用量量的的不不同同造造成成的的，这两两种种激激素素是是_。A中中的的愈愈伤组织是叶肉是叶肉细胞胞经_形成的。形成的。细胞分裂素、生长素细胞分裂素、生长素脱分化脱分化(4)若若该种种植植物物是是一一种种杂合合体体的的名名贵花花卉卉，要要快快速速获得得与与原原植植株株基基因因型型和和表表现型型都都相相同同的的该种种花花卉卉，可可用用组织培培养养方方法法繁繁殖殖，在在培培养养时，_(填填“能能”或或“不不能能”)采采 用用 经 减减 数数 分分 裂裂 得得 到到 的的
73、 花花 粉粉 粒粒 作作 为 外外 植植 体体 ， 原原 因因 是是 _ _。不能不能 对杂合合体体的的植植株株来来说，其其体体细胞胞的的基基因因型型相相同同，而而花花粉粉粒粒的的基基因因型型与与体体细胞胞的的基基因因型型不不同同。用用花花粉粒粉粒进行行组织培养得到花卉基因型不同于原植株培养得到花卉基因型不同于原植株解析：解析：(1)植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性。植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性。(2)蔗蔗糖糖水水解解后后可可得得到到葡葡萄萄糖糖、果果糖糖。用用细细胞胞作作为为材材料料进进行行培培养养获获得得幼幼苗苗，细细胞胞必须具有完整细胞核，才具有发育为个体的一整套完整遗传
74、信息。必须具有完整细胞核，才具有发育为个体的一整套完整遗传信息。(3)影影响响植植物物组组织织培培养养的的两两种种主主要要激激素素是是细细胞胞分分裂裂素素和和生生长长素素。愈愈伤伤组组织织是是叶叶肉肉细胞经脱分化形成的。细胞经脱分化形成的。(4)由由于于花花粉粉粒粒的的基基因因型型与与体体细细胞胞的的基基因因型型不不同同，组组织织培培养养得得到到花花卉卉基基因因型型不不同同于原植株，导致不能保留亲本性状。于原植株，导致不能保留亲本性状。2(2018广广东东茂茂名名大大联联考考)利利用用现代代生生物物技技术，科科研研人人员对马铃薯薯的的培培育育进行行了研究，了研究，请回答相关回答相关问题：(1)
75、培培育育马铃薯薯脱脱毒毒苗苗所所依依据据的的原原理理是是_，该培培育育过程程涉涉及及_和和_两个两个阶段。段。(2)研研究究马铃薯薯茎茎尖尖外外植植体体大大小小对幼幼苗苗的的成成苗苗率率和和脱脱毒毒率率的的影影响响，结果果如如图。据据图可可知知：茎茎尖尖越越小小，脱脱毒毒率率_，成成苗苗率率_，培培养养脱脱毒毒苗苗茎茎尖尖的的适适宜宜大大小小为_。(3)若若想想培培育育出出“番番茄茄马铃薯薯”植植株株，运运用用传统有有性性杂交交能能否否得得到到可可育育的的杂种种植植株？株？为什么？什么？_。(4)若若马铃薯薯细胞胞中中含含m条条染染色色体体，番番茄茄细胞胞内内有有n条条染染色色体体，则“番番茄
76、茄马铃薯薯”细胞在有胞在有丝分裂后期含分裂后期含_条染色体。条染色体。植物细胞全能性植物细胞全能性脱分化脱分化再分化再分化越高越高越低越低0.27mm否否(或不能或不能)，不同种的植物存在生殖隔离，不同种的植物存在生殖隔离 2(mn) 解解析析：(1)培培育育马马铃铃薯薯脱脱毒毒苗苗是是对对植植物物组组织织培培养养技技术术的的应应用用，所所依依据据的的原原理理是是植植物细胞全能性；该培育过程涉及脱分化和再分化两个阶段。物细胞全能性；该培育过程涉及脱分化和再分化两个阶段。(2)据据图图可可知知：茎茎尖尖越越小小，脱脱毒毒率率越越高高，成成苗苗率率越越低低；培培养养脱脱毒毒苗苗茎茎尖尖的的适适宜宜
77、大大小为小为0.27mm。(3)由由于于番番茄茄和和马马铃铃薯薯属属于于两两个个不不同同物物种种，而而不不同同种种的的植植物物存存在在生生殖殖隔隔离离，所所以以若想培育出若想培育出“番茄马铃薯番茄马铃薯”植株，运用传统有性杂交不能得到可育的杂种植株。植株，运用传统有性杂交不能得到可育的杂种植株。(4)若若马马铃铃薯薯细细胞胞中中含含m条条染染色色体体，番番茄茄细细胞胞内内有有n条条染染色色体体，则则“番番茄茄马马铃铃薯薯”细胞中含有细胞中含有(mn)条染色体，在有丝分裂后期含条染色体，在有丝分裂后期含2(mn)条染色体。条染色体。3科学家利用科学家利用细胞融合技胞融合技术研究研究细胞膜的胞膜的
78、结构特性，构特性，进行了下列行了下列实验。(1)将将鼠鼠细胞胞和和人人细胞胞在在_培培养养箱箱中中培培养养一一段段时间，用用_处理理，获取取实验用的用的单细胞胞悬液。液。(2)将将两两种种细胞胞在在37下下混混合合培培养养，在在培培养养液液中中加加入入_诱导融合，形成融合融合，形成融合细胞，一般两两融合的胞，一般两两融合的细胞有胞有_种。种。CO2胰蛋白酶胰蛋白酶(灭活的灭活的)病毒病毒(或或PEG) 3(3)细胞胞膜膜的的主主要要成成分分是是磷磷脂脂和和蛋蛋白白质。将将连接接了了荧光光染染料料的的抗抗体体与与融融合合细胞胞在在一一定定条条件件下下培培养养，抗抗体体与与融融合合细胞胞的的膜膜蛋
79、蛋白白(抗抗原原)特特异异性性结合合，其其目目的的是是标记膜膜蛋蛋白白，以以便便于于显微微镜观察察。用用荧光光显微微镜观察察融融合合细胞胞表表面面荧光光的的颜色色和和_，开开始始时，鼠鼠的的细胞胞为绿色色，人人的的细胞胞为红色色，两两种种颜色色不不混混合合；一一段段时间后后，可可观察到察到红绿荧光交替分布的光交替分布的“嵌合体嵌合体”。统计_，结果如下果如下图所示。所示。分布分布 嵌合体比例嵌合体比例(4)科学家据此提出两种假科学家据此提出两种假说解解释嵌合体的形成。嵌合体的形成。假假说一：融合一：融合细胞合成了新的膜蛋白；胞合成了新的膜蛋白；假假说二：原有膜蛋白在二：原有膜蛋白在细胞膜平面上
80、运胞膜平面上运动。使使用用_抑抑制制剂和和ATP合合成成抑抑制制剂分分别处理理融融合合细胞胞，均均对嵌嵌合体形成没有合体形成没有显著影响，著影响，这个个结果否定了假果否定了假说一。一。在在15、20和和26的的培培养养温温度度下下重重复复上上述述实验，这些些实验的的结果果为_， 为 假假说二提供了二提供了证据支持。据支持。蛋白质合成蛋白质合成随着温度增加，嵌合体比例增加随着温度增加，嵌合体比例增加(或随着温度降低，嵌合体比例降低或随着温度降低，嵌合体比例降低)解解析析：(1)动动物物细细胞胞培培养养需需要要一一定定的的气气体体环环境境，因因此此需需要要放放到到二二氧氧化化碳碳培培养养箱箱中中培
81、培养养；由由于于胰胰蛋蛋白白酶酶能能水水解解细细胞胞膜膜表表面面的的蛋蛋白白质质，因因此此常常用用胰胰蛋蛋白白酶酶处处理理动动物物组组织织，使组织细胞分散开，进而制成细胞悬液。使组织细胞分散开，进而制成细胞悬液。(2)诱导动物细胞融合常用诱导动物细胞融合常用(灭活的灭活的)病毒病毒(或或PEG)；合成后的融合细胞一般有；合成后的融合细胞一般有3种。种。(3)细细胞胞膜膜主主要要由由磷磷脂脂和和蛋蛋白白质质组组成成；抗抗体体与与荧荧光光染染料料结结合合后后抗抗体体被被标标记记，当当抗抗体体与与融融合合细细胞胞的的膜膜蛋蛋白白(抗抗原原)特特异异性性结结合合时时，膜膜蛋蛋白白就就被被标标记记；用用
82、荧荧光光显显微微镜镜观观察察融合细胞表面荧光的颜色和分布，并观察和统计嵌合体比例。融合细胞表面荧光的颜色和分布，并观察和统计嵌合体比例。(4)假假如如嵌嵌合合体体形形成成是是融融合合细细胞胞合合成成了了新新的的膜膜蛋蛋白白，用用蛋蛋白白质质合合成成抑抑制制剂剂和和ATP合成抑制剂分别处理融合细胞，嵌合体形成会受影响。合成抑制剂分别处理融合细胞，嵌合体形成会受影响。分分析析柱柱形形图图可可知知，随随着着温温度度增增加加，嵌嵌合合体体比比例例增增加加(或或“随随着着温温度度降降低低，嵌嵌合合体比例降低体比例降低”)。4(2018河河南南濮濮阳阳二二模模)如如图是是制制备乙乙肝肝病病毒毒表表面面抗抗
83、体体的的流流程程图。请回回答答下下列列问题： (1)图中中细胞胞的的名名称称为_，其其与与骨骨髓髓瘤瘤细胞胞融融合合所所依据的基本原理是依据的基本原理是_。(2)在在图示示流流程程中中至至少少需需要要进行行两两次次筛选，其其中中第第一一次次筛选的的目目的的是是_；第二次；第二次筛选的目的是的目的是_。(3)制制备得得到到的的单克克隆隆抗抗体体可可用用于于乙乙肝肝的的免免疫疫治治疗，其其所所利利用用的的免免疫疫学学原原理理是是_。(4)干干扰素素属属于于淋淋巴巴因因子子，由由效效应T细胞胞产生生，并并以以_的的方方式式释放放到到细胞胞外外。某某同同学学联想想到到单克克隆隆抗抗体体的的制制备过程程
84、，提提出出用用效效应T细胞胞代代替替细胞胞，从从而而获得得单克克隆隆干干扰素素的的设想想，你你认为该方方法法是是否否可可行行？并并说明明理理由由_ _。已免疫已免疫B淋巴细胞淋巴细胞(或浆细胞或浆细胞)细胞膜细胞膜(具有一定具有一定)的流动性的流动性获得杂交瘤细胞获得杂交瘤细胞 获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞抗原和抗体的特异性结合抗原和抗体的特异性结合(或单克隆抗体与抗原结合的特异性强或单克隆抗体与抗原结合的特异性强)胞吐胞吐 可行，效应可行，效应T细胞是细胞是T细胞细胞接受抗原刺激后，经过增殖，分化形成的细胞，具有释放淋巴因子的功能接受抗原刺激后，经过增殖，分化
85、形成的细胞，具有释放淋巴因子的功能解解析析：(1)用用抗抗原原刺刺激激小小鼠鼠使使之之产产生生特特异异性性免免疫疫反反应应，从从小小鼠鼠体体内内提提取取B淋淋巴巴细细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞。细胞融合的原理是细胞膜具有一定的流动性。胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞。细胞融合的原理是细胞膜具有一定的流动性。(2)两两次次筛筛选选中中第第一一次次筛筛选选是是获获得得杂杂交交瘤瘤细细胞胞，第第二二次次筛筛选选是是从从杂杂交交瘤瘤细细胞胞中中获获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞。得能产生所需抗体的杂交瘤细胞。(3)单单克克隆隆抗抗体体具具有有与与抗抗原原结结合合特特异异性性强强、灵灵敏敏度度高高的的特特点点，可可用用于于乙乙肝肝的的免免疫疫治疗。治疗。(4)干干扰扰素素的的化化学学本本质质是是蛋蛋白白质质，效效应应T细细胞胞以以胞胞吐吐的的形形式式将将之之分分泌泌到到细细胞胞外外；效效应应T细细胞胞是是T细细胞胞接接受受抗抗原原刺刺激激后后，经经过过增增殖殖，分分化化形形成成的的细细胞胞，具具有有释释放放淋淋巴巴因因子子的的功功能能，因因此此可可依依据据单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备过过程程，用用效效应应T细细胞胞代代替替细细胞胞，从从而而获获得得单克隆干扰素。单克隆干扰素。谢谢观看
