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1、真菌真菌真菌真菌基因工程基因工程三、三、酵母表达系统酵母表达系统二、二、酵母转化系统酵母转化系统一、真菌表达系统的优缺点一、真菌表达系统的优缺点四、丝状真菌表达系统四、丝状真菌表达系统三三三三 酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统其它酵母表达系统其它酵母表达系统（一）（一）（一）（一） 酿酒酿酒酿酒酿酒酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母系统启动子酿酒酵母系统启动子酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母糖基化系统酿酒酵母糖基化系统1 1、酿酒酵母
2、启动子、酿酒酵母启动子、酿酒酵母启动子、酿酒酵母启动子UASURSTATA起始起始位点位点编码序列编码序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、转录起始位点；、转录起始位点； 4、URS：上游阻遏序列上游阻遏序列2、TATA盒：盒：富含富含AT； 5、DAS：下游激活序列下游激活序列3、UAS：上游激活序列上游激活序列;DAS1 1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因GAP
3、DHGAPDH 磷酸甘油激酶基因磷酸甘油激酶基因PKGPKG 乙醇脱氢酶基因乙醇脱氢酶基因ADHADH酿酒酵母表达系统常用启动子酿酒酵母表达系统常用启动子酿酒酵母表达系统常用启动子酿酒酵母表达系统常用启动子2 2）半乳糖激酶启动子（）半乳糖激酶启动子（）半乳糖激酶启动子（）半乳糖激酶启动子（GAL1GAL1）GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80A A、 GAL1GAL1、GAL7GAL7和和 GAL10GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控基因连锁在一起，独立转录，共同调控BB、GAL4GAL4产物与产物与UASUAS结合，
4、促进转录；结合，促进转录；GAL80GAL80产物抑制产物抑制GAL4GAL4产物的活性，阻遏转录产物的活性，阻遏转录CC、野生型、野生型GAL4GAL4表达水平低，产物活性可被表达水平低，产物活性可被GLAL80GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差产物完全抑制，半乳糖诱导效果差半乳糖诱导、葡萄糖抑制半乳糖诱导、葡萄糖抑制2 2）半乳糖激酶启动子（）半乳糖激酶启动子（）半乳糖激酶启动子（）半乳糖激酶启动子（GAL1GAL1）GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80A A、 将将GAL4GAL4的启动子换成的启动子换成GAL10G
5、AL10的诱导型强启动子的诱导型强启动子BB、半乳糖诱导、半乳糖诱导GAL4GAL4高表达，不受高表达，不受GAL80GAL80产物抑制，激活产物抑制，激活GAL1GAL1等高效转录等高效转录半乳糖诱导、葡萄糖抑制半乳糖诱导、葡萄糖抑制PromoterPromoterGAL10GAL103 3 3 3）pho4pho4pho4pho4TSTSTSTS-PHO5-PHO5-PHO5-PHO5启动子启动子启动子启动子A A、PHO5PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录B B、PHO4PHO4基因编码产物是基因编码产物是PHO5PHO5启动子的正调控因子启动子的正
6、调控因子C C、pho4pho4TS TS 温度敏感，温度敏感，3535时失活，时失活，PHO5PHO5关闭关闭D D、pho4pho4TSTS-PHO5-PHO5启动子通过启动子通过降温（降温（2323）诱导表达诱导表达低温诱导、磷酸盐抑制低温诱导、磷酸盐抑制酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：性结合因子：MF-MF- 酸性磷酸酯酶：酸性磷酸酯酶：PHO5PHO5 蔗糖酶：蔗糖酶：SUC2SUC2 杀手毒素因子：杀手毒素因子：KILKIL2 2、酿酒酵母分泌系统、酿酒酵母分泌系统、酿酒酵母分泌系统、酿酒酵母分泌系统* *保守性低，大多异源宿主系统的信
7、号肽不能互用保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用* *信号肽结构：信号肽结构： 酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母信号肽特点信号肽特点信号肽特点信号肽特点正电荷区正电荷区疏水区疏水区极性区极性区Met目的蛋白目的蛋白信号肽剪切位点信号肽剪切位点* *分泌效率高分泌效率高* *在酵母系统具有通用性在酵母系统具有通用性*88*88个残基组成个残基组成 MF-MF- 信号肽信号肽信号肽信号肽Met目的蛋白目的蛋白-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：STE13编码的二肽酶编码的二肽酶糖基化位点：糖基化位点：糖基化位点：糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser
8、Asn-X-Thr/Ser（X X代表任何氨基酸）代表任何氨基酸）代表任何氨基酸）代表任何氨基酸） N- N-型糖基化：型糖基化：型糖基化：型糖基化：天门冬酰氨酸天门冬酰氨酸天门冬酰氨酸天门冬酰氨酸残基上的残基上的残基上的残基上的酰胺氮酰胺氮酰胺氮酰胺氮进行糖进行糖进行糖进行糖 基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。 O- O-型糖基化：型糖基化：型糖基化：型糖基化：苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸/ /丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸上的上的上的上的羟基氧羟基氧羟基氧羟基氧进行糖
9、基化进行糖基化进行糖基化进行糖基化 3 3、酿酒酵母糖基化系统、酿酒酵母糖基化系统、酿酒酵母糖基化系统、酿酒酵母糖基化系统* * 过糖基化（超糖基化修饰）：过糖基化（超糖基化修饰）：过糖基化（超糖基化修饰）：过糖基化（超糖基化修饰）： N N型或型或型或型或OO型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性
10、、对活性与药代稳定性均有影响。性与药代稳定性均有影响。性与药代稳定性均有影响。性与药代稳定性均有影响。* *糖链组成糖链组成糖链组成糖链组成 O O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团基团基团基团酿酒酵母糖基化特点酿酒酵母糖基化特点酿酒酵母糖基化特点酿酒酵母糖基化特点1 1）表达水平普遍不高）表达水平普遍不高）表达水平普遍不高）表达水平普遍不高 A A、表达载体传代不稳定（、表达载体传代不稳定（、表达载体传代不稳定（、表达载体传代不稳定（YEpYEp、
11、YRpYRp） B B、所采用的强启动子调控不严谨、所采用的强启动子调控不严谨、所采用的强启动子调控不严谨、所采用的强启动子调控不严谨 C C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵2 2）分泌表达产物过糖基化）分泌表达产物过糖基化）分泌表达产物过糖基化）分泌表达产物过糖基化4 4、酿酒酵母表达系统的缺陷、酿酒酵母表达系统的缺陷、酿酒酵母表达系统的缺陷、酿酒酵母表达系统的缺陷（二）（二）（二）（二） 甲醇甲醇甲醇甲醇酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统甲醇酵母与甲
12、醇氧化酶启动子甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母表达系统的应用甲醇酵母表达系统的应用甲醇酵母表达系统操作原理甲醇酵母表达系统操作原理甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策甲醇酵母表达系统的优缺点甲醇酵母表达系统的优缺点1 1、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母甲醇酵母（methylotrophicmethylotrophic yeast) yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母毕赤酵母（PichiaPichia pastoris
13、pastoris) ) 汉森酵母汉森酵母（HansenulaHansenula ploymorphaploymorpha) ) 假丝酵母假丝酵母（Candia Candia boidiniiboidinii) ) 1 1、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶甲醇氧化酶A A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%30%以上以上 B B、名称和拷贝数不同、名称和拷贝数不同毕赤酵母毕赤酵母/ /假丝酵母假丝酵母 汉森酵母汉森酵母 醇氧化酶醇氧化酶 甲醇氧化酶甲醇氧化酶甲醇氧化酶甲醇氧化酶a
14、lcohol alcohol oxidase,AOXoxidase,AOX methanol methanol oxidase,MOXoxidase,MOXAOX1AOX1、AOX2 MOX AOX2 MOX 1 1、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子AOX1AOX1与与与与AOX2AOX2* *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOXAOX基因基因 AOX1 AOX1、AOX2AOX2*AOX1*AOX1与与AOX2AOX2基因基因97%97%同源同源*AOX1 *AOX1 占主导地位，
15、负责占主导地位，负责AOX 99%AOX 99%以上活性以上活性1 1、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子甲醇氧化酶启动子A A、目前已发现的、最强的真核启动子、目前已发现的、最强的真核启动子B B、严谨调控型启动子、严谨调控型启动子 AOX1 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导 2 2、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇酵母表达系统的优缺点酵母表达系统的优缺点酵母表达系统的优缺点酵母表达系统的优缺
16、点A A、表达水平高（最高水平的系统）、表达水平高（最高水平的系统）B B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化C C、过糖基化程度比酿酒酵母少（、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-158-15个个vs100-150vs100-150 个甘露糖）个甘露糖）D D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统）、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统）E E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。F F、实验室和工业操作简单、实验室和工业操作简单GG、不能满足结构要求严格的糖基化、不能满足结构要求严格
17、的糖基化 3 3、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇酵母表达系统操作原理酵母表达系统操作原理酵母表达系统操作原理酵母表达系统操作原理宿主株与标记基因宿主株与标记基因甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件胞内表达与分泌表达胞内表达与分泌表达甲醇甲醇甲醇甲醇酵母系统宿主酵母系统宿主酵母系统宿主酵母系统宿主二大宿主系统主要特点二大宿主系统主要特点项目项目 毕赤酵母毕赤酵母 汉森酵母汉森酵母最适温度最适温度 30 37最适最适pH值值 4.5 4.5甘油阻遏甘油阻遏 是是 否否糖基化糖基化 部分过度部分过度 较正常较正常高密度发酵高密度发酵 100g/L 100g/L 甲醇甲醇甲醇甲醇酵母系统宿主酵母系统宿
18、主酵母系统宿主酵母系统宿主二大宿主系统主要选择标记二大宿主系统主要选择标记宿主 选择标记选择标记毕赤酵母毕赤酵母 his4、G418、 Zeocin、Cu+汉森酵母汉森酵母 leu2、 his3 、ura3、 G418甲醇甲醇甲醇甲醇酵母系统宿主酵母系统宿主酵母系统宿主酵母系统宿主毕赤酵母系统毕赤酵母系统毕赤酵母系统毕赤酵母系统主要宿主株主要宿主株宿主株 特点 Y11430 野生型、野生型、Mut+GS115 his4- 、Mut+KM71 his4-、 aox1:ARG4 (AOX1-)、Muts SMD1168 his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌、胞外蛋白酶缺陷，高分泌MC1003 hi
19、s4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生长，甲醇不生长甲醇甲醇甲醇甲醇酵母系统的整合事件酵母系统的整合事件酵母系统的整合事件酵母系统的整合事件YRpYRp型载体：型载体：汉森系统汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择压力迫使高拷贝数整合，可达压力迫使高拷贝数整合，可达100100拷贝。拷贝。YIpYIp型载体：型载体：A A、在靶序列处线性化载体、在靶序列处线性化载体DNADNA，诱导同源重组，诱导同源重组B B、有、有“ “插入插入” ”和和“ “取代取代” ”二类整合模式二类整合模式C C、主要为单拷贝整合，、主要为单拷贝整合，1
20、-10%1-10%为多拷贝整合为多拷贝整合 毕赤毕赤毕赤毕赤酵母系统模式表达载体酵母系统模式表达载体酵母系统模式表达载体酵母系统模式表达载体1 1）AOX1AOX1位点插入位点插入位点插入位点插入宿主株宿主株:GS115、KM71可插入位点：可插入位点： 5AOX1 3AOX1 TT转化子：转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts2 2）His4His4位点插入位点插入位点插入位点插入转化子：转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts宿主株宿主株:GS115、KM71可插入位点：可插入位点： 5His4 3His43 3） 多基因插入事件（串联整合）多
21、基因插入事件（串联整合）多基因插入事件（串联整合）多基因插入事件（串联整合）宿主株宿主株:GS115、KM71可插入位点：可插入位点： 5AOX1 3AOX1 TT转化子：转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts4 4） 基因取代（基因取代（基因取代（基因取代（GS115GS115，AOX1AOX1+ +）转化子：转化子：His4+Muts汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体高拷贝整合元件：高拷贝整合元件：A、高度重复序列：、高度重复序列：rDNA 提供多个整合位点提供多个
22、整合位点B、缺陷型标记基因：、缺陷型标记基因：Leu2d 提高选择压力提高选择压力C、抗性标记；、抗性标记；neo 提高选择压力提高选择压力 甲醇甲醇甲醇甲醇酵母系统胞内表达载体酵母系统胞内表达载体酵母系统胞内表达载体酵母系统胞内表达载体表达载体类型表达载体类型需要带入需要带入ATG单位点单位点甲醇甲醇甲醇甲醇酵母系统胞内表达载体酵母系统胞内表达载体酵母系统胞内表达载体酵母系统胞内表达载体表达载体类型表达载体类型需要带入需要带入ATG多位点多位点甲醇甲醇甲醇甲醇酵母系统分泌表达载体酵母系统分泌表达载体酵母系统分泌表达载体酵母系统分泌表达载体信号肽：信号肽：PHO1甲醇甲醇甲醇甲醇酵母系统分泌表
23、达载体酵母系统分泌表达载体酵母系统分泌表达载体酵母系统分泌表达载体信号肽：信号肽：MF甲醇甲醇甲醇甲醇酵母系统分泌表达载体酵母系统分泌表达载体酵母系统分泌表达载体酵母系统分泌表达载体信号肽：信号肽：MF标记：标记：Kan4 4、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策酵母系统高效表达影响因素与对策酵母系统高效表达影响因素与对策酵母系统高效表达影响因素与对策载体稳定性载体稳定性基因剂量基因剂量整合位点整合位点甲醇利用表型甲醇利用表型mRNA5mRNA5端端ATAT含量分泌信号含量分泌信号表达产物稳定性表达产物稳定性1 1）载体稳定性）载体稳定性）载体稳定性）载体稳定性同拷贝数时，整合
24、型的比自主复制型的表达水平高同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高YRpYRp型载体的稳定化：型载体的稳定化： 选择选择非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时，整合位点不确定。但费时，整合位点不确定。采用采用YIpYIp型载体型载体: : 更易实现整合、整合位点清楚更易实现整合、整合位点清楚2 2）基因剂量）基因剂量）基因剂量）基因剂量外源基因表达存在基因剂量效应外源基因表达存在基因剂量效应筛选多拷贝整合子筛选多拷贝整合子 载体引入载体引入G418/ZeocinG418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采
25、用高与抗性成正相关，采用高G418/ZeocinG418/Zeocin抗性转化子。抗性转化子。体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子采用采用YRpYRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子型载体稳定化技术获高拷贝整合子构建高拷贝整合型表达载体构建高拷贝整合型表达载体3 3）整合位点）整合位点）整合位点）整合位点外源基因表达盒整合于外源基因表达盒整合于AOX/MOXAOX/MOX或标记基因处，均或标记基因处，均可高效表达可高效表达毕赤酵母中个别情况整合于毕赤酵母中个别情况整合于His4His4位点的比位点的比AOX1AOX1位点位点的低的低4 4）甲醇利用表型）甲
26、醇利用表型）甲醇利用表型）甲醇利用表型 在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达5 5）mRNA5mRNA5端端端端mRNA5mRNA5端非翻译区（端非翻译区（UTRUTR）的组成与长度）的组成与长度应尽量与应尽量与AOX1/MOXAOX1/MOX的一致的一致应尽量避免在应尽量避免在UTRUTR区出现区出现AUGAUG和次级结构和次级结构6 6）基因序列的）基因序列的ATAT含量含量 AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构含量越高、越容易出现类似于终止子的结构7 7）分泌信号）分泌信号）分泌信号）分泌信号分泌表达效率与所用分泌信号高度相关分泌表达效率与所用分泌信号高度相关可采用酿酒酵母来源的可采用酿酒酵母来源的MFMF 、PHOPHO或或SUCSUC等的信号等的信号肽，或野生型信号肽，但适用性要比较分析。肽，或野生型信号肽，但适用性要比较分析。8 8）表达产物稳定性）表达产物稳定性 分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素降低培养基降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低值：蛋白酶在酸性条件下活性较低培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制采用蛋白酶缺陷宿主株：如采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168
