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1、常用分子生物学技术常用分子生物学技术原理及其应用原理及其应用The popular technology in molecular biology: principle and application第第 一一 节节分子印迹与杂交技术分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 指具有一定互补序列的不同来源的指具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单链在一定条件下按照碱基互补核苷酸单链在一定条件下按照碱基互补配对的原则形成双链的过程。配对的原则形成双链的过程。杂交双链杂交双链(hetero
2、duplex)利用各种物理方法使电泳胶中的生物利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到大分子转移到特定的支持物上特定的支持物上，使之成为，使之成为固相化分子，称之为印迹固相化分子，称之为印迹（blotting）。）。印迹（印迹（ blotting）（一）（一）Southern印迹杂交印迹杂交 Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern blotting） DNA与与DNA分子之间的杂交。分子之间的杂交。 基本过程基本过程: 将琼脂糖凝胶电泳分离的将琼脂糖凝胶电泳分离的待测待测DNA片段变性后，将凝胶中的片段变性后，将凝胶中的DNA分子转移到一定的固相支持物上，然后用分子转移到一定
3、的固相支持物上，然后用标记的标记的探针探针检测待测的检测待测的DNA。 探针（探针（probe） 是指经过特殊标记的是指经过特殊标记的已知序列核苷酸片段已知序列核苷酸片段，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基因，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的序列的DNA或或RNA片段。片段。 探针的种类探针的种类 寡核苷酸寡核苷酸 基因组基因组DNA cDNA片段片段 RNA片段片段标记物标记物 放射性同位素放射性同位素 生物素生物素 荧光染料荧光染料 Southern印迹杂交的基本步骤印迹杂交的基本步骤 u待测待测DNA样品的限制性内切酶消化样品的限制性内切酶消化 u酶切酶切DNA样品的电泳分离样
4、品的电泳分离 u凝胶中凝胶中DNA的变性和的变性和Southern转移转移 u探针的制备探针的制备 uSouthern杂交杂交 u杂交结果的检测杂交结果的检测 10SSC 转转移缓冲液移缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因DNA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜 基因组基因组DNA的定性与定量分析。的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检如对在基因组中特异基因的定位及检测等。测等。重组质粒和噬菌体的分析。
5、重组质粒和噬菌体的分析。Southert blotting用途用途（二）（二）Northern印迹杂交印迹杂交 利用类似于利用类似于Southern印迹杂交的技术来印迹杂交的技术来检测检测RNA称为称为Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blotting）。）。 Northern印迹杂交基本原理和过程与印迹杂交基本原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定进行定性或定量分析。性或定量分析。 Northern印迹杂交的基本过程印迹杂交的基本过程 相同点：相同点：No
6、rthern 与与Southern blotting的异同点的异同点转移的是转移的是RNA转移前无需酶切转移前无需酶切转移效率较高转移效率较高变性方法变性方法: DNA(碱变性）碱变性） RNA（甲醛、乙二醛等）（甲醛、乙二醛等） 不同点不同点原理均为毛细作用原理均为毛细作用 Northern blotting 用途用途 检测某一组织或细胞中已知的特异检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平。的表达水平。 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。（三）其他核酸杂交方法（三）其他核酸杂交方法1.斑点印迹杂交斑点印迹杂交 2.原位杂交（原位杂交（i
7、n situ hybridization） 二、蛋白质印迹技术二、蛋白质印迹技术(Western blotting) 根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（体支持物（NC膜或其它膜）上，再用相应的蛋膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子（最常用的是白质分子（最常用的是抗体）抗体）对其进行检测。对其进行检测。因此，被称为因此，被称为免疫印迹免疫印迹（immunoblotting）技技术术。 Western blotting应用应用 检测样品中的特异蛋白质的存在检测样品中的
8、特异蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的定量分析细胞中特异蛋白质的定量分析 蛋白质分子的相互作用研究蛋白质分子的相互作用研究Hypoxia - + + + + + + GTE - - - - - - - EGCG - - - - - - -CHX (10g/mL) - 0 15 30 60 90 180 (min) HIF-1-actinHIF-1-actinHypoxia - + + + + + + GTE (40g/mL) - + + + + + + CHX (10g/mL) - 0 15 30 60 90 180 (min) HIF-1-actinHypoxia - + + + + + +
9、EGCG (50mol/L) - + + + + + +CHX (10g/mL) - 0 15 30 60 90 180 (min) ABFig. 1-1 Effects of GTE and EGCG on the degradation of hypoxia-induced HIF-1 protein in HeLa cells. A)Result of Western blotting. B) Quantitative densitometric analysis of results from A. Western blotting的应用的应用Fig.1-1 Western blot
10、analysis of HIF-1 protein levels. Lane 1: mock transfection control; Lane 2: pSG5 empty vector control; Lane 3: 16E6; Lane 4: 16E7; Lane 5: 16E6 mutant; Lane 6: 16E7 mutant.HPV-16癌蛋白增强宫颈癌细胞癌蛋白增强宫颈癌细胞HIF-1的蛋白表达的蛋白表达 首先将混合蛋白质用首先将混合蛋白质用SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶（PAGE）电泳电泳按分子大小分开，按分子大小分开，再将再将蛋白质蛋白质转移转移到到NC膜上，蛋白
11、质的膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。位置可保持在胶中的原位上。蛋白质蛋白质印迹印迹与与DNA、RNA印迹相似之处印迹相似之处电泳电泳转移转移杂交杂交放射自显影放射自显影化学显色化学显色化学发光化学发光n蛋白质的转移只有靠电转移蛋白质的转移只有靠电转移n蛋白质的检测以蛋白质的检测以抗体抗体作探针作探针n用碱性磷酸酶（用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶）、辣根过氧化酶（HRP）标记）标记第二抗体第二抗体，底物显色底物显色来检测来检测蛋白区带的信号，底物亦可与蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂化学发光剂结合以提高敏感度。结合以提高敏感度。n或用同位素标记第二抗体，或用同位素标记第二抗体，
12、放射自显影法放射自显影法检测蛋白区带的信号。检测蛋白区带的信号。蛋白质印迹与蛋白质印迹与DNADNA、RNARNA印迹印迹不同之处不同之处三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较Western blotting垂直槽垂直槽Northern blotting水平槽水平槽Southern blotting水平槽水平槽 三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较 Southern blotting Northern blotting Western blotting样品样品限制性内限制性内切酶酶切切酶酶切电泳电泳变性变性转移膜转移膜紫外交联紫外交联仪等固定仪等固定杂交标记物杂交标记物DNARNA蛋白质蛋白质需
13、要需要 不需要不需要 不需要不需要 琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳胶电泳琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳胶电泳SDS-PAGE电泳电泳碱变性碱变性甲醛或乙甲醛或乙二醛变性二醛变性高温变性高温变性NC膜或膜或尼龙膜尼龙膜NC膜或膜或尼龙膜尼龙膜NC膜或膜或PVDF膜膜需要需要 需要需要 不需要不需要核酸探针核酸探针 核酸探针核酸探针 抗体抗体第二节第二节PCR 技术的原理与应用技术的原理与应用Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应聚合酶链反应The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of m
14、ethods within DNA-based chemistry Michael Smith1944 -1932 - 2000La Jolla, CA, USA Kary B. Mullis University of British Columbia Vancouver, Canada for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) methodfor his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-direc
15、ted mutagenesis and its development for protein studies5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、一、PCR技术的基本原理技术的基本原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 (Taq DNA聚合酶聚合酶)dNTPsMg2+n PCR体系
16、基本组成成分体系基本组成成分PCR反反应应循循环环变性变性95C左右左右延伸延伸适温适温退火退火Tm-5C 经过经过30个左右的循环后，个左右的循环后，PCR的扩增倍的扩增倍数为数为(1+x)n, x=75%, n为循环数为循环数.二、二、PCR技术的主要特点技术的主要特点1.特异性强特异性强 2.灵敏度高灵敏度高 3.简便快速简便快速 4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 2. 利用利用特异性引物特异性引物以以cDNA或基因组或基因组DNA为模为模板获得已知目的基因片段。板获得已知目的基因片段。3. 利用利用简并引物简并引物从从cDNA文库或基因组文库中文库或基因组文库中获得具有一定同源
17、性的基因片段。获得具有一定同源性的基因片段。4. 利用利用随机引物随机引物从从cDNA文库或基因组文库中文库或基因组文库中随机克隆基因。随机克隆基因。1. 与与反转录反应反转录反应相结合，直接从组织和细胞的相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。获得目的基因片段。三、三、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的扩增与克隆（一）目的基因的扩增与克隆（二）基因的体外定点突变（二）基因的体外定点突变（三）基因突变分析（三）基因突变分析 PCR与其他技术的结合可以大与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性大提高基因突变检测的敏感性 。（四）（四） DNA和和RNA的微量分
18、析的微量分析（五）（五） DNA序列测定序列测定三、三、PCR技术技术的主要用途的主要用途The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNAfor their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acidsPaul Berg1/2 of the prizeSta
19、nford University Stanford, CA, USA1926 - Walter Gilbert Frederick Sanger1/4 of the prize 1/4 of the prize Harvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom1932 - 1918 - GATC 测序反应测序反应 电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGT
20、GAACGTAACGAACAAA5 3 负极负极正极正极ddGddAddTddC链末端合成终止法测定链末端合成终止法测定DNA序列的原理序列的原理*2 ，3 双双脱氧核苷酸脱氧核苷酸*缺乏缺乏3 -OH引物引物DNA聚聚合酶合酶dNTPDNA自动测序结果自动测序结果反转录反转录PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR)RT-PCR是目前从组织或细胞中获得是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的目的基因以及对已知序列的RNA进进行行定性及半定量分析定性及半定量分析的最有效方法。的最有效方法。 （一）反转录（一）反转录PCR技术技术四、几种重要的四、几种重
21、要的PCR衍生技术衍生技术RT-PCR技术技术AAnATTnT 55mRNA反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶S1双链cDNA35 35 5加热变性加入特异性引物DNA聚合酶PCR扩增出大量的产物-actin 433bp HIF-1 359bp300 bp500 bp400 bp300bp500bp400bp200bp-actin 433bpVEGF 238bpRT-PCR的结果举例的结果举例 原原位位PCR方方法法弥弥补补了了PCR技技术术和和原原位位杂杂交交技技术术的的不不足足，是是将将目目的的基基因因的的扩扩增增与与定位定位
22、相结合的一种最佳方法。相结合的一种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术 (in situ PCR) （三）实时（三）实时PCR技术技术 实实时时PCR (real-time PCR)技技术术通通过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中的的产产物物量量，消消除除了了产产物物堆堆积积对定量分析的干扰，亦被称为对定量分析的干扰，亦被称为定量定量PCR。 实时实时PCR技术技术原理原理TaqMan 探针法探针法第三节第三节 基因文库基因文库Gene Library基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library) n基因文库基因文
23、库(gene library) 是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。序列的克隆群体。一、基因组一、基因组DNA文库文库 指包含某一生物体全部基因组指包含某一生物体全部基因组DNA序序列的克隆群体。列的克隆群体。 储存着一个细胞或生物体的全部基因储存着一个细胞或生物体的全部基因组组DNA的的编码区编码区和和非编码区非编码区的的DNA片段，片段，含有基因组的含有基因组的全部全部遗传信息。遗传信息。（Genomic DNA library)构建基因组构建基因组DNA文库的基本过程文库的基本过程 二、二、 cDNA文库文库 cDNA文库是指某一组织在一定条文库
24、是指某一组织在一定条件下所表达的全部件下所表达的全部mRNA经反转录而合经反转录而合成的全部成的全部cDNA的克隆群体，它将细胞的克隆群体，它将细胞的基因表达信息以的基因表达信息以cDNA的形式储存于的形式储存于的受体菌中。的受体菌中。 基因组文库和基因组文库和cDNA文库的比较文库的比较 第第 四四 节节基因修饰动物模型基因修饰动物模型的建立及应用的建立及应用 是指将外源基因整合到动物细胞或是指将外源基因整合到动物细胞或植物细胞的基因组中并使外源基因在动植物细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的技术。技术。 基因的导入方式主要：基因
25、的导入方式主要： 显微注射法显微注射法 胚胎干细胞法胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法 一、一、转基因技术转基因技术转基因技术转基因技术 基基本本原原理理是是采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵的的细细胞胞核核内内或或着着床床前前的的胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导导入入受受体体动物子宫，使之发育成个体。动物子宫，使之发育成个体。 转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物( (transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物 即即体细胞克隆技术体细胞克隆技术，是用显微操，是用显微操作
26、、电融合等方法将动物体细胞的细作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。核的卵细胞内，使之发育成为个体。二、二、核转移技术核转移技术 核转移技术可使一个核转移技术可使一个细胞细胞变成变成一个一个个体个体，这样产生的个体所携带的遗传，这样产生的个体所携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖的过程，即样，是一种无性繁殖的过程，即克隆克隆(clone)。 通过分子生物学的方法定向地敲除通过分子生物学的方法定向地敲除动物体细胞内的某个基因的技术称为动物体细胞内的某个
27、基因的技术称为基基因剔除因剔除 (gene knock-out)或或基因打靶基因打靶 (gene targeting)。三、三、基因剔除技术基因剔除技术 定义：定义： 原理：原理： 通过通过DNA定点定点同源重组同源重组，使小鼠，使小鼠胚胎干细胞胚胎干细胞 (ES细胞细胞)特定的内源基因特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失。被破坏而造成其功能丧失。四、基因转移和基因剔除在医学中的应用四、基因转移和基因剔除在医学中的应用（一）建立疾病动物模型（一）建立疾病动物模型（二）生物制药（二）生物制药（三）治疗性克隆和生产可用于人体（三）治疗性克隆和生产可用于人体器官移植的动物器官器官移植的动物器官第第
28、五五 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术DNA芯片芯片(DNA chip)、DNA阵列阵列(DNA array)cDNA芯片芯片(cDNA chip) 指将许多特定的指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片段片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。面积的支持物上。一、基因芯片一、基因芯片(gene chip) 将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶
29、靶蛋蛋白白进进行行定定性性和和定量定量分析的一种技术。分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片 (protein chip)又称又称蛋白质阵列蛋白质阵列 (protein array)基本原理基本原理： 蛋白质与蛋白质分子之间在空蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互间构象上能特异性的相互识别和相互结合。结合。 最常用的探针：最常用的探针：抗体抗体检测方法：检测方法：标记检测法、直接检测法标记检测法、直接检测法二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片 (protein chip)蛋白质芯片结果举例蛋白质芯片结果举例第六节第六节 蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术一、酵母双
30、杂交系统一、酵母双杂交系统二、噬菌体展示技术二、噬菌体展示技术三、蛋白质工程中的定点诱变技术三、蛋白质工程中的定点诱变技术 该系统的建立是基于对酵母转录因子该系统的建立是基于对酵母转录因子GAL4分子的研究。分子的研究。GAL4DNA结构域结构域(BD)(DNA binding domain) 转录激活域转录激活域(AD)(activation domain) 一、酵母双杂交系统一、酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）（一）酵母双杂交系统的基本原理（一）酵母双杂交系统的基本原理N端端C端端n两者各具功能，互不影响，两者各具功能，互不影响，单独存在时没单独存在时没有转
31、录激活的功能。有转录激活的功能。n只有两者连接建立起来的空间结构方可表只有两者连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活因子的功能。现出一个完整的激活因子的功能。nDNA-BD能识别位于能识别位于Gal4基因的上游激活基因的上游激活序列序列(upstream activation sequence，UAS)。nDNA-AD可与其他成分结合而启动可与其他成分结合而启动UAS下下游的基因转录。游的基因转录。DNA-BD和DNA-AD两个结构域两个结构域（二）酵母双杂交系统的应用（二）酵母双杂交系统的应用1. 分析已知蛋白质之间的相互作用及蛋白质分析已知蛋白质之间的相互作用及蛋白质 的功能结构域的功能结构域2. 筛选和发现新的蛋白质筛选和发现新的蛋白质 3. 筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之 间相互作用的影响间相互作用的影响 4. 绘制蛋白相互作用系统图谱绘制蛋白相互作用系统图谱
