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1、第一章第一章 细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术在病毒学研究中的发展细胞培养技术在病毒学研究中的发展细胞培养概述细胞培养概述细胞培养技术细胞培养技术细胞培养细胞培养污染污染与监测与监测细胞培养技术在病毒学检验中的细胞培养技术在病毒学检验中的应用应用p由组织分散成的单个细胞或某一型细由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的胞群进行的体外体外培养方法。培养方法。 即模拟体内的生理环境条件，提供细胞即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术。行传代的技术。细
2、胞培养技术的定义细胞培养技术的定义 第一节第一节 细胞培养技术在病毒学研究中的发展细胞培养技术在病毒学研究中的发展n细胞培养技术前，依赖动物、鸡胚分离培养病毒。细胞培养技术前，依赖动物、鸡胚分离培养病毒。n19281928年创立了组织细胞培养病毒方法，但鉴定仍要年创立了组织细胞培养病毒方法，但鉴定仍要依靠动物实验。依靠动物实验。n19491949年判断病毒增殖的方法，如年判断病毒增殖的方法，如pHpH的改变，的改变，CPECPE作作为第一个判定病毒增殖的指标，以后细胞表面出现为第一个判定病毒增殖的指标，以后细胞表面出现血凝素或其他病毒抗原。血凝素或其他病毒抗原。n19521952年创立病毒空斑
3、试验技术进行病毒定量分析年创立病毒空斑试验技术进行病毒定量分析n近年来，分子生物学和免疫学手段与细胞培养技术近年来，分子生物学和免疫学手段与细胞培养技术结合建立病毒快速检测技术。结合建立病毒快速检测技术。组织细胞培养技术在病毒学研究中的用途组织细胞培养技术在病毒学研究中的用途分离、鉴定病毒分离、鉴定病毒制备病毒抗原、疫苗制备病毒抗原、疫苗测定病毒感染力和滴度测定病毒感染力和滴度在增殖病毒基础上可提高分子生物学方法在增殖病毒基础上可提高分子生物学方法鉴别、分析病毒的敏感度鉴别、分析病毒的敏感度组织细胞培养技术在病毒学研究中的优缺点组织细胞培养技术在病毒学研究中的优缺点优点：优点：对病毒的敏感性较
4、高；对病毒的敏感性较高；无特异性抗体影响；无特异性抗体影响；某些病毒在敏感细胞上可引起细胞病变或血球吸某些病毒在敏感细胞上可引起细胞病变或血球吸附附较为准确的定量和定位研究病毒。较为准确的定量和定位研究病毒。缺点缺点: :某些病毒没有敏感细胞；某些病毒没有敏感细胞；不能看到细胞变化不能看到细胞变化第二节第二节 细胞培养概述细胞培养概述n体外培养细胞的体外培养细胞的生物学特性生物学特性n组织细胞培养的组织细胞培养的种类种类n细胞系细胞系的建立、保存和鉴定的建立、保存和鉴定n用于病毒培养的用于病毒培养的细胞选择细胞选择体外体外培养细胞的生物学特性培养细胞的生物学特性p组织来源：组织来源：胚胎或成体
5、组织、正常或肿瘤胚胎或成体组织、正常或肿瘤组织组织p生物学特性：生物学特性：细胞异质性、增殖和分化、细胞异质性、增殖和分化、细胞生长特征与形态细胞生长特征与形态p生长繁殖过程：生长繁殖过程：细胞周期、细胞生命周期细胞周期、细胞生命周期p 生长基本条件生长基本条件体外培养细胞体外培养细胞p生长类型生长类型贴壁型：贴壁型：成纤维细胞、上皮样细成纤维细胞、上皮样细胞、游走型细胞、多型性细胞胞、游走型细胞、多型性细胞接触性抑制接触性抑制和和密度抑制密度抑制悬浮型：悬浮型：部分部分癌细胞、白细胞癌细胞、白细胞多形细胞型有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定他们规律和稳定的形态，可通归入多形细胞型
6、。多形细胞型成纤维细胞成纤维细胞上皮样细胞上皮样细胞游走型细胞游走型细胞多型性细胞多型性细胞n进行病毒培养需要获取大量可进行病毒培养需要获取大量可供长期而稳定的细胞材料，选供长期而稳定的细胞材料，选择适合细胞增殖的条件。择适合细胞增殖的条件。细胞培养的基本条件细胞培养的基本条件接种量接种量：细胞单层速度：细胞单层速度营养物质营养物质：无机离子、氨基酸、碳水化合：无机离子、氨基酸、碳水化合物、维生素、蛋白质（血清）物、维生素、蛋白质（血清）酸碱度酸碱度：6.66.67.87.8气体气体：O O2 2、COCO2 2温度温度：33333737水：水：纯度高、无离子，现制纯度高、无离子，现制无菌条件
7、无菌条件：抗生素：抗生素血清在培养血清在培养细胞方面有细胞方面有何作用？何作用？组织细胞培养种类组织细胞培养种类器官培养器官培养组织培养组织培养细胞培养细胞培养 原代原代细胞培养、细胞培养、传代传代细胞培养（二细胞培养（二倍体细胞、连续传代细胞）倍体细胞、连续传代细胞）各类细胞的优缺点各类细胞的优缺点原代细胞：原代细胞：对病毒培养最敏感，但制备对病毒培养最敏感，但制备和应用不方便。和应用不方便。二倍体细胞株：二倍体细胞株：广泛应用于病毒的分离广泛应用于病毒的分离和疫苗生产，但只能传和疫苗生产，但只能传5050代左右。代左右。传代细胞：传代细胞：仅能应用于病毒的分离和鉴仅能应用于病毒的分离和鉴定
8、而不能用于疫苗生产。定而不能用于疫苗生产。细胞系的建立、保存和鉴定细胞系的建立、保存和鉴定p细胞系细胞系和和细胞株细胞株的概念的概念p细胞系或株的相关信息记录细胞系或株的相关信息记录p细胞系或细胞株的鉴定内容细胞系或细胞株的鉴定内容用于病毒培养的细胞选择用于病毒培养的细胞选择p细胞对病毒的敏感性细胞对病毒的敏感性p研究目的研究目的p研究病毒在不同组织细胞培养中特性研究病毒在不同组织细胞培养中特性p病毒培养方法：病毒培养方法：静止培养、旋转培养、悬浮培养静止培养、旋转培养、悬浮培养第三节第三节 细胞培养技术细胞培养技术n细胞培养的基本设施与条件细胞培养的基本设施与条件n无菌操作技术无菌操作技术和
9、细胞检查技术和细胞检查技术n原代细胞制备原代细胞制备过程过程n传代细胞制备及培养技术传代细胞制备及培养技术n细胞的冻存、复苏及运输细胞的冻存、复苏及运输细胞培养常用设备细胞培养常用设备 超净工作台超净工作台（生物安全柜）（生物安全柜）、倒置显、倒置显微镜、水浴箱微镜、水浴箱、离心机（高速冷冻）离心机（高速冷冻） 、COCO2 2培养箱、冰箱、低温冰柜、液培养箱、冰箱、低温冰柜、液氮罐、高压灭菌器、干烤箱氮罐、高压灭菌器、干烤箱器材的选择和处理器材的选择和处理n实验器材实验器材培养瓶、培养板、离心管、吸管等培养瓶、培养板、离心管、吸管等n处理处理清洗（去污、去有机物、去离子）和无清洗（去污、去有
10、机物、去离子）和无菌处理菌处理培养用液和试剂培养用液和试剂水：水：超纯水（电阻率超纯水（电阻率18.2M18.2M）平衡盐缓冲液平衡盐缓冲液：（：（D-D-）HanksHanks液、液、PBSPBS培养液培养液：生长液、维持液：生长液、维持液细胞分散剂细胞分散剂：胰蛋白酶胰蛋白酶、EDTAEDTApHpH调整液：调整液：NaHCONaHCO3 3溶液溶液(7(7.0-7.2.0-7.2) )指示剂：指示剂：0.4%0.4%酚红溶液酚红溶液(6.8(6.8黄色黄色) )抗生素抗生素：100U100U或微克的青链霉素或微克的青链霉素常用培养液常用培养液天然培养液：天然培养液：体液和组织提取液，包含
11、体液和组织提取液，包含血清血清、血浆、胶原血浆、胶原牛血清：牛血清：小牛、犊牛、胎牛，要求灭活小牛、犊牛、胎牛，要求灭活5630min5630min血清作用？存在的问题？血清作用？存在的问题？合成培养基：合成培养基：按要求添加水、过滤除菌、以碳按要求添加水、过滤除菌、以碳酸氢钠调节酸氢钠调节pHpH、加抗生素以及血清、加抗生素以及血清（促进生长）（促进生长）无血清培养基无血清培养基（serumfreemedium,SFM）无菌操作和细胞检查技术无菌操作和细胞检查技术n无菌操作技术无菌操作技术实验前、操作区、无菌器材使用、火焰灭实验前、操作区、无菌器材使用、火焰灭菌方法等菌方法等n细胞检查技术细
12、胞检查技术细胞形态、活力、细胞技术方法等细胞形态、活力、细胞技术方法等原代细胞制备过程原代细胞制备过程l组织材料的选择和处理组织材料的选择和处理l单细胞悬液制备单细胞悬液制备l细胞计数及分装细胞计数及分装l细胞培养及观察细胞培养及观察以鸡胚成纤维细胞制备过程为例：以鸡胚成纤维细胞制备过程为例：取胚取胚组织块制备组织块制备胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化分散细胞分散细胞计数细胞计数细胞分瓶培养分瓶培养取孵化取孵化10d 10d 的鸡胚的鸡胚消毒消毒破壳破壳揭壳膜和绒毛尿囊膜揭壳膜和绒毛尿囊膜无菌取出鸡胚无菌取出鸡胚去除去除头部和内脏头部和内脏取胚取胚组织块制备组织块制备胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化分散细胞分
13、散细胞计数细胞计数细胞分瓶培养分瓶培养胚胎用胚胎用HankHanks s液洗液洗2 2次次剪碎剪碎用含抗生素用含抗生素HankHanks s液洗液洗2 2次次静止待组织沉积去除液体静止待组织沉积去除液体取胚取胚组织块制备组织块制备胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化分散细胞分散细胞计数细胞计数细胞分瓶培养分瓶培养加入加入5 5倍量胰酶消化液倍量胰酶消化液3737水浴消化（约水浴消化（约20min20min）组织块聚合成团组织块聚合成团弃除胰蛋白酶液弃除胰蛋白酶液用冷用冷HankHanks s液洗液洗2 2次次取胚取胚组织块制备组织块制备胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化分散细胞分散细胞计数细胞计数细胞分瓶培养分瓶培
14、养加加9ml9ml不含血清的营养液（不含血清的营养液（DMEMDMEM）用吸管吹打用吸管吹打150150次左右次左右用不锈钢网（用不锈钢网（100100目）过滤目）过滤取胚取胚组织块制备组织块制备胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化分散细胞分散细胞计数细胞计数细胞分瓶培养分瓶培养将细胞悬液作适当稀释将细胞悬液作适当稀释加入台盼兰混匀加入台盼兰混匀取上述细胞悬液滴入计数池取上述细胞悬液滴入计数池镜下观察并计数镜下观察并计数取胚取胚组织块制备组织块制备胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化分散细胞分散细胞计数细胞计数细胞分瓶培养分瓶培养将细胞悬液用培养液稀释将细胞悬液用培养液稀释1 110106 6分装细胞培养瓶分装细胞培
15、养瓶3737、5%CO25%CO2培养培养1 12d2d形成细胞单层形成细胞单层可传代也可接种病毒可传代也可接种病毒p单层细胞培养过程单层细胞培养过程游离期游离期贴壁期贴壁期繁殖期繁殖期维持期维持期衰退期衰退期p培养细胞观察培养细胞观察内容：内容：生长液的颜色；是否有污染；细胞生生长液的颜色；是否有污染；细胞生长状况；长状况；注意事项注意事项：24h24h内不应镜检或摇动；内不应镜检或摇动；镜检和换液不宜在外放置过久，随用随放；镜检和换液不宜在外放置过久，随用随放；注意放置培养瓶时的方向。注意放置培养瓶时的方向。细胞的保存、复苏及运输细胞的保存、复苏及运输p保存液保存液：培养液、小牛血清、双抗
16、、培养液、小牛血清、双抗、DMSODMSOp慢冻：慢冻： -4-4、 -20-20（-40-40）、）、-80-80、液氮（液氮（-196 -196 ）p复苏：复苏：3737水浴水浴1min1min，速溶速溶p运输：运输：满瓶、冰盒满瓶、冰盒第四节第四节 细胞培养污染与监测细胞培养污染与监测n污染来源污染来源n微生物污染与监测微生物污染与监测n细胞间交叉污染细胞间交叉污染n细胞污染防治措施细胞污染防治措施污染来源污染来源 l组织：组织：人和动物组织携带病毒人和动物组织携带病毒l血清和消化液：血清和消化液：支原体支原体l操作：操作：不同细胞株共用培养液不同细胞株共用培养液l空气：空气：真菌真菌l
17、器材：器材：处理不当处理不当 细胞培养污染问题细胞培养污染问题p微生物污染微生物污染p细胞间交叉污染细胞间交叉污染猴类病毒猴类病毒禽类病毒禽类病毒人组织内在病毒人组织内在病毒支原体支原体真菌真菌细菌细菌微生物污染与监测微生物污染与监测n细菌和真菌细菌和真菌n支原体支原体n病毒病毒 细胞污染防治措施细胞污染防治措施细胞组织来源细胞组织来源血清来源血清来源无菌操作及规范操作无菌操作及规范操作加抗生素加抗生素冷冻保存未污染细胞株冷冻保存未污染细胞株一但污染如何消除？一但污染如何消除？第五节第五节 细胞培养在病毒学检验中的应用细胞培养在病毒学检验中的应用n分离培养病毒分离培养病毒n病毒性疾病的血清学诊
18、断病毒性疾病的血清学诊断n肿瘤病毒致癌机制研究肿瘤病毒致癌机制研究n药物体外抗病毒试验药物体外抗病毒试验分离培养病毒分离培养病毒n常用敏感细胞常用敏感细胞n标本前处理标本前处理n标本接种与培养方法标本接种与培养方法n病毒鉴定方法：病毒鉴定方法：细胞病变检查法、红细胞吸附试验、空细胞病变检查法、红细胞吸附试验、空斑试验、中和试验、电镜观察、免疫荧光技斑试验、中和试验、电镜观察、免疫荧光技术、分子生物学技术术、分子生物学技术病毒的分离鉴定病毒的分离鉴定u直接观察直接观察细胞病变（细胞病变（CPE）细胞代谢细胞代谢u间接观察间接观察红细胞吸附红细胞吸附干扰现象（干扰现象（Nt）u病毒滴度测定病毒滴度
19、测定细胞病变细胞病变l细胞病变效应细胞病变效应全变型全变型包涵体型包涵体型融合型融合型CPE: CPE: CytopathologicalCytopathological effect effect 多数病多数病毒在细胞内增殖，可引起细胞形态学异常毒在细胞内增殖，可引起细胞形态学异常改变如细胞变圆、肿胀、坏死、脱落改变如细胞变圆、肿胀、坏死、脱落等NDVNDV感染感染BHK21BHK21细胞所引起的细胞融合（箭头所示）细胞所引起的细胞融合（箭头所示） -包涵体：感染的细胞胞浆或胞核内出现嗜酸性或嗜碱性的圆形、椭圆形包涵体包涵体：感染的细胞胞浆或胞核内出现嗜酸性或：感染的细胞胞浆或胞核内出现嗜酸
20、性或嗜碱性的圆形、椭圆形或不规则形状的团块结构嗜碱性的圆形、椭圆形或不规则形状的团块结构 InclusionbodyofCMV:l观察细胞病变注意区别观察细胞病变注意区别与老化细胞与老化细胞操作导致操作导致病变程度病变程度Immunofluorescence-病毒核酸杂交技术病毒核酸杂交技术- PCR - PCR MechanismsofPolymerasechainreaction(PCR):小小 结结n重点重点：组织细胞培养技术：组织细胞培养技术n难点难点：组织细胞培养病毒检查方法：组织细胞培养病毒检查方法 思考题思考题n组织细胞用于病毒分离培养有何优缺点？组织细胞用于病毒分离培养有何优缺点？n可通过哪些方法判断病毒在细胞中增殖？可通过哪些方法判断病毒在细胞中增殖？n病毒引起的细胞病变有哪些种类？判定细病毒引起的细胞病变有哪些种类？判定细胞病变有哪些注意事项？胞病变有哪些注意事项？
