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1、RNA干扰技术及应用目录RNA干扰的发现RNA干扰的作用机制RNAi研究的一般技术路线RNA干扰技术的应用展望及问题TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006安德鲁安德鲁法法尔尔AndrewZ.Fire美国美国麻省理工学院1959n雷格雷格梅梅洛洛Craig C.Mello美国哈佛大学1960For there discovery of RNA interference-gene silencing by double-stranded RNA一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出
2、特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNAi)。 RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。 RNA 干扰(干扰(RNA interference, RNAi)RNAi- RNA interferencesiRNAs-Small interfering RNAs (小干扰性小干扰性RNA)dsRNA-double strand RNA(双链双链RNA)RISC-RNA-induced silencing complex (RNA诱导沉默复合物诱导沉默复合物) Dicer- RNAase
3、IIIrelated enzymes (RNAaseIII家族成员家族成员)PTGS-Post-transcriptional gene silencing 转录后基因沉默转录后基因沉默Glossary (术语术语)(RNA干扰干扰)RdRP- RNA-directed RNA polymerase (RNA指导指导RNA聚合酶聚合酶) 一、RNA干扰的发现历史1990 年 ,为加深矮牵牛花(petunias)的紫色,Jorgensen 等导入了一个强启动子控制的色素基。 可是结果与预期相反,许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色。 这是由于转基因和内源基因的表达都被抑制了 Jorgense
4、n 把这个现象命名为共抑制(cosuppression)1994年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象,此称为基因压制(quelling)。1995年,靡奈尔大学的SuGuo在用反义RNA(antisenseRNA)阻断线虫基因表达的试验中发现反义RNA(antisenseRNA)和正义RNA(senseRNA)都阻断了基因的表达,当时他们对这个结果感到十分困惑。1998年,华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现SuGuo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象,以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断,都是由
5、于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现,基因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链RNA却正好相反,能够高效特异性阻断相应基因的表达,其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级(如图1)他们首次提出了RNAinterference的概念靡奈尔大学的SuGuo阻断线虫基因表达的试验1999年短短的一年间,发现RNA干涉现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。2000年,又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在R干涉现象。2001年Elbashir等Nat
6、ure上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后,在小鼠等多种细胞中也取得了成功。鉴于siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景,2002年美国科学杂志将其评为全球年度十大科学进展之首。二、RNAi作用机制起始起始阶段段效效应阶段段扩增增扩散散阶段段起始阶段病毒基因、人工转入基因等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,并利用宿主细胞进行转录时,常产生一些dsRNA这些dsRNA被胞质中的Dicer酶切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约2123 bp),即siRNA 。(dicer是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种
7、ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因病毒感染等各种方式引入的双链RNA)siRNA的特点:3端均有23个突出的核苷酸siRNA的结构siRNA通常是一段长21个核苷酸的双股RNA(dsRNA),其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸,图示如下:每一股各有一个5磷酸基末端与一个3羟基末端。此结构经dicer作用而得。此外,siRNA也可经由多种不同转染(transfection)技术导入细胞内,并对特定基因产生具专一性的基因敲除(knockdown)效果。本质上,任何已知序列的基因都可以、也因此是经过适当剪裁而具有序列互补性的siRNA的作用对象。这使siRNA成为研究基因功能与
8、药物目标的一项重要工具。效应阶段siRNA双链结合核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,orRISC)在ATP存在情况下,siRNA双链展开激活RISC,激活的RISC即可通过碱基互补与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解,使与此mRNA相应的特定基因(targetgene)表现为转录默状态。RISC(RNA-induced silencing complex )RNAi机制机制模式图模式图在起始步骤
9、,加入的dsRNA被Dicer酶切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段 在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, or RISC) 激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA。依次
10、循环:新合成的长链dsRNA同样可被Dicer切割、降解生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成一切割的循环过程,进一步放大RNAi作用。扩增扩散阶段扩增扩散阶段RNAi现象的特征RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征:RNAi是转录后水平的基因沉默机制;靶基因内源性序列不发生改变,即RNAi不引起稳定的遗传改变。RNAi具有很高的特异性;siRNA的序列专一性要求非常严谨,与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。RNAi抑制基因表达具有很高的效率,最有效的siRNAs能使靶RNA和蛋白水平降低90%以上,表型可以达到缺失突变体表型的程度,而且相对很少量的dsRNA
11、分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达,是以催化放大的方式进行的;RNAi现象的特征RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体dsRNA不得短于21个碱基,并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA,并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰,而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。三、RNAi研究的一般技术路线确定目的基因设计si
12、RNA的序列获得siRNA产物siRNA转染RNAi效果检测化学合成体外转录长片段RNA消化siRNA表达载体siRNA表达框架四、RNA干扰的应用RNA干扰的最大潜能在于它可以选择性的关闭几乎每一个基因,并且只是关闭特定的基因,因此它比以往任何一项技术都更适合用于:基因功能研究药物靶基因筛选药物靶点验证(1)在功能基因组中的应用在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或降低突变,以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具,用于功能基因组的研究。将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区,以
13、反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA,产生RNA干涉,使目的基因沉默,从而进一步研究目的基因的功能。治疗肝炎病毒感染JudeLieberman等已经成功地利用RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎。他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质(FAs)基因”。FAs存在于细胞表面,它能够启动细胞的自杀程序。据认为,许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了FAs基因所导致的。JudeLieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默”FAs基因的siRNA,发现有90的肝细胞接收到了这种RNA分子,FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果,未接受RNAi
14、治疗的实验鼠有40在天内死亡。而40只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来,10天后研究人员检查这些实验鼠的肝部,发现完全正常(2)肿瘤病的治疗肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一区段序列的dsRNA分子,只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。
15、Brummelkamp等用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因kras(v12)的表达。Williams等对结肠癌过表达的基因应用RNAi技术予以干预,经实时PCR定量分析证实过表达基因表达的水平急剧下降,且体内、外实验均证明癌细胞生长受到抑制。Scher等以引起慢性髓性白血病和bcr/ab1阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr/ab1癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87%的有效抑制率。RNA沉默是存在于生物中的一种古老现象,是生物抵抗异常DNA(病毒、转座因子和某些高重复的基因组序列)的保护机制,同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色,它可以通过降解
16、RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用,因此在治疗癌症肿瘤中有很大的应用前景。(3)药物筛选线虫(Caenorhabditiselegans)是第一个测出基因组全序列的多细胞有机体,是功能基因组分析中一种重要的模式生物。RNAi是一个高效高通量的破坏基因功能的方法,结合线虫的表型筛选即可作为研究药物筛选中基因靶位点分析,杀虫剂机制等的有效工具。五、展望作为实验工具使生物学研究发生革命性变化siRNA 文库的建立,将能快速高效地研究几乎每一个决定特异生物学表型的基因的功能.作为传统遗传学工具的补充,提供更快速高效的方法以减少成活动物的亚效等位基因突变效应 实现RNA干扰作为分析和构建疾病模型的工具向疾病治疗工具的转变等.RNA干扰仍存在的问题目前siRNA导入胞内的效率低下,如何有效将siRNA转移入体内成为RNAi应用的最大障碍; 如何在目的基因序列上选择21-23bp左右的序列作为siRNA 的模板,从目前的研究来看,序列的选择原则尚不清楚; 目前RNAi 机制尚未完全阐明。谢谢