《单核苷酸多态性SNP检测技术.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《单核苷酸多态性SNP检测技术.ppt(32页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、单核苷酸多态性检测单核苷酸多态性检测技术技术内容简介内容简介1 SNP 概概 念念2 SNP 特特 点点3 SNP 检 测 技技 术4 实 验SNP 的概念的概念 n n单核苷酸多态性单核苷酸多态性单核苷酸多态性单核苷酸多态性(SingleNucleotide(SingleNucleotidePolymorphismPolymorphism,SNP)SNP),指由于单个核苷酸碱,指由于单个核苷酸碱基的基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中,绝大条染色体或同一位点的核苷酸序列中,绝大多数核苷多数核苷酸序列一
2、致而只有一个碱基不同的现象,即酸序列一致而只有一个碱基不同的现象,即SNPSNP。n n它包括单碱基的转换它包括单碱基的转换, ,颠换、颠换、 插入及缺失插入及缺失等形式等形式SNP在基因组内的形式在基因组内的形式:n n一是遍布于基因组的大量单碱基变异;n n二是分布在基因编码区(codingregion),称其为cSNP,属功能性突变。SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的:(1)非转录序列要多于转录序列(2)在转录区非同义突变的频率,比其他方式突变的频率低得多。SNP 的特点的特点 n n在遗传学分析中,SNP作为一类遗传标记得以广泛应用,主要源于这几个特点:(1)密度高SNP在人
3、类基因组的平均密度估计为11000bp,在整个基因组的分布达3106个,遗传距离为23cM,密度比微卫星标记更高,可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。(2)富有代表性某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此,它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。SNP 的特点的特点(3)遗传稳定性与微卫星等重复序列多态性标记相比,SNP具有更高的遗传稳定性。(4)易实现分析的自动化SNP标记在人群中只有两种等位型(allele)。这样在检测时只需一个“+-”或“全无”的方式,而无须象检测限制性片段长度多态性,微卫星那样对片段的长度作出测量,这使得基于SNP的检测分析
4、方法易实现自动化。一、一、 SNPs经典检测方法经典检测方法n n一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如:1.限制性片段长度多态性法PCR-RFLP;2.单链构象多态性法PCR-SSCP;3.变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE);4.等位基因特异性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等PCR-RFLP方法方法 原理:原理:利用限制性内切酶的酶切位点的特异性,用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断,如果存在SNP位点,酶切片断的长度和数量则会出现差异,根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。
5、 特点:特点:该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点,它是SNP筛查中最经典的方法之一.PCR-RFLP原理图原理图单链构象多态性单链构象多态性(SSCP) 原理:原理:原理:原理:单链单链DNADNA在中性条件下会形成二级结构,在中性条件下会形成二级结构,不同的不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖结构依赖于碱基的组成,单个碱基的改变也会影响其构象,于碱基的组成,单个碱基的改变也会影响其构象,最终会导最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。致在凝胶上迁移速度的改变。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链在非变性聚丙烯
6、酰胺凝胶上,短的单链 DNADNA和和RNARNA分分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象,这样子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象,这样在凝胶上在凝胶上的迁移速率不同,出现不同的条带,检测的迁移速率不同,出现不同的条带,检测SNPSNP。特点:特点:特点:特点:由于该方法简单快速,因而被广泛运用于未由于该方法简单快速,因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。定突变类型和具体位置。变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳(DGGE)n n原理:原理:原理:原理:是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理,通
7、过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。电泳开始时,DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小有关,而一旦DNA泳动到某一点时,即到达该DNA变性浓度位置时,使得DNA双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时,DNA片段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异,使得其变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条带。等位基因特异等位基因特异 PCR ( AS-PCR)原理:原理:根据SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3末端与SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引
8、物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的SNP。SNPs高通量的检测方法高通量的检测方法另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通量、自动化程度较高的检测SNPs的方法,较为常用的有:1.DNA测序法;2.DNA芯片检测;3.飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测;4.变性高效液相色谱(DHPLC)法等等DNA测序法测序法n n直接测序是最容易实施的SNP检测方法。原理原理:通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率可达100%。特点:特点:可以得到SNP的类型及其准
9、确位置等SNP分型所需要的重要参数。基因芯片技术基因芯片技术( Genechips) 原理原理: :是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上,待测基因经提取、荧光标记后,与固定好的探针进行杂交,最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。 特点:特点:基因芯片具有信息量大和自动化程度高的突出优点。但它也存在若干问题:芯片造价高昂,所需设备贵重,不利于普及应用。MALDI-TOF 原理:原理:是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不
10、同峰而检测SNP。变性高效液相色谱变性高效液相色谱( DHPLC)原原原原理理理理:目目标标核核酸酸片片段段PCRPCR扩扩增增,部部分分加加热热变变性性后后,含含有突变有突变碱碱基基的的DNADNA序序列列由由于于错错配配碱碱基基与与正正常常碱碱基基不不能能配配对对而而形成异形成异源源双双链链。因因包包含含错错配配碱碱基基的的杂杂合合异异源源双双链链区区比比完完全全配配对的同对的同源源配配对对区区和和固固定定相相的的亲亲和和力力弱弱,更更易易被被从从分分离离柱柱上上洗洗脱下来脱下来, ,从从而而达达到到分分离离的的目目的的。SNPsSNPs的的有有无无最最终终表表现现为为色色谱谱峰峰的峰的峰
11、形形或或数数目目差差异异, ,依依据据此此现现象象可可很很容容易易从从色色谱谱图图中中判判断断出出突变的突变的碱基。碱基。特特特特点点点点:使使用用高高效效液液相相色色谱谱检检测测SNPsSNPs具具有有检检测测效效率率高高,便便于于自自动动化化的的优优点点,对对未未知知SNPsSNPs的的准准确确率率可可达达95%95%以以上上。但但DHPLCDHPLC检检测测对对所所用用试试剂剂和和环环境境要要求求较较高高, ,容易产生误差容易产生误差, ,不能检测出纯合突变。不能检测出纯合突变。MassARRAYn nSNPSNP分型的方法多种多样,分型的方法多种多样,MassARRAYMassARRA
12、Y分子量阵分子量阵列技术列技术是是SequenomSequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具,公司推出的世界上领先的基因分析工具,通过通过引物延伸或切割反应引物延伸或切割反应引物延伸或切割反应引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的与灵敏、可靠的MALDITOFMALDITOF质质质质谱谱谱谱技术相技术相结合,实现基因分型检测。结合,实现基因分型检测。n n基于基于MassARRAYMassARRAY分子量阵列平台的分子量阵列平台的iPLEXiPLEXGOLDGOLD技术技术可以设计最高多达可以设计最高多达4040重重PCRPCR反应和基因型检测反应和基因型检测,实,实验设计非验设计非常灵活,
13、分型结果准确性高。特别适合于对常灵活,分型结果准确性高。特别适合于对全基因全基因组研究组研究发发现的结果进行验证,或者是有限数量的研究位点已现的结果进行验证,或者是有限数量的研究位点已经确定的经确定的情况。情况。MassARRAY技术原理:n n先通过PCR扩增目标序列,然后加入SNP序列特异延伸引物,在SNP位点上,延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发,核酸分子解吸附为单电荷离子,电场中离子飞行时间与离子质量成反比,通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量,从而检测出SNP位点信息。MassARRAY技术原理:n nMassE
14、XTEND单碱基延伸反应,紧挨SNP位点设计一段探针,在反应体系中以ddNTP替代dNTP,使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同,探针将结合不同的ddNTP,从而具有不同的分子量,质谱仪即可检测出这种分子量差异,从而实现SNP分型的目的。MassARRAY技术流程: 应用:1.确定基因多态性和疾病的关系2.解释个体间的表型差异对疾病的易感程度3.对未来疾病做出诊断4.研究不同基因型个体对药物反应的差异,指导药物开发及临床合理用药5.个体间SNP千差万别,通过SNP检测等技术进行法医鉴定及个体识别优势优势n n(1 1)质谱仪检测的是分子最本质的特征之一)质谱仪检测的是
15、分子最本质的特征之一分子量,分子量,不涉及荧光标记、凝胶电泳等,就能检测一个碱基的差异,不涉及荧光标记、凝胶电泳等,就能检测一个碱基的差异,准确性高,机器本身出错的概率非常低;准确性高,机器本身出错的概率非常低;n n(2 2)质谱仪的灵敏度非常高,检测窗口内,任何)质谱仪的灵敏度非常高,检测窗口内,任何pmolpmol级级别的物质都能被检测出来;别的物质都能被检测出来;n n(3 3)通量高:几秒就能检测完一个反应孔;)通量高:几秒就能检测完一个反应孔;n n(4 4)操作简单,仪器要求简单,除质谱仪外,都是常规)操作简单,仪器要求简单,除质谱仪外,都是常规PCRPCR仪器;仪器;n n(5
16、 5)灵活:每天可以完成几个反应至上万个反应;)灵活:每天可以完成几个反应至上万个反应;n n(6 6)便宜:引物不带荧光标记,普通长度()便宜:引物不带荧光标记,普通长度(3 3条引物总长条引物总长80bp80bp左右),此外在一个反应孔内能完成左右),此外在一个反应孔内能完成4 4个或更多的反个或更多的反应,即通常所说的应,即通常所说的4 4重反应;重反应;n n(7 7)兼容性强:质谱仪还能在核酸的其它方向,以及蛋)兼容性强:质谱仪还能在核酸的其它方向,以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。n n(8 8)质谱技术是)质谱技术是“ “一管式操作一管式操作” ”,即反应体系在生化学,即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应,没有多次转移,这样实验过程中始终在一个试管内反应,没有多次转移,这样就减少被污染的概率。就减少被污染的概率。