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1、细菌内毒素检查法王思理2000版较95版药典修改要点新增加三个定义1.细菌内毒素检查用水2.鲎试剂灵敏度3.反应终点浓度其他增加内容前前言言：细菌内毒素国家标准品的用途增加了复核鲎试剂灵敏度。试验准备试验准备：增加了试验所和器皿应确证无干扰细菌内毒素的检查。鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核:增加了2管阴性对照。供试品干扰试验供试品干扰试验:增加了标准对照检查法检查法:鲎试剂的支数由原来4支增加为5支结果判断结果判断:细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则1.细菌内毒素限值的确定：L=K/M2.干扰实验3.标准物质4.鲎试剂5.细菌内毒素检查用水细菌内毒素定量测定法（比浊法和显
2、色基质法）1.标准物质2.细菌内毒素检查用水3.鲎试剂：应符合定量测定要求。4.实验准备：同细菌内毒素检查法。细菌内毒素定量实验方法1.标准曲线的可靠性实验:r-0.982.供试品的干扰实验:MVD=L.C/13.测定及判断:回收率50%-200%4.供试品的定量测定：测定结果与L比较细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则的指导意义的指导意义1.明确指明了制订指导原则的目的是“为了将细菌内毒素检查法广泛应用于药品、生物制品的质量控制”讲的非常明确。2.首次从官方文件中肯定了细菌内毒素定量测定法，这对促进“定量法”在我国应用将起重大的促进作用。细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内
3、毒素检查法应用指导原则的指导意义的指导意义3.指导原则对细菌内素限值作出了非常明确的规定：1、细菌内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定：L=K/M4.在这次指导原则中只字未提热源与细菌内毒素两法改变中的对比试验，即今后在两法改换中不必再做对比试验。这样必将大大加速我国两法的改换进程。细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则的指导意义的指导意义5.指导原则中明确规定：“标准物质试验中所用细菌内毒素标准物质应使用由中国药品生物制品检定所研制、标定和分发的细菌内毒素国家标准品和工作标准品。”6.随着定量法在我国得到肯定、应用和推广，它还将有力地推动促
4、进细菌内毒素检查法在我国的新进展。细菌内毒素国家标准品细菌内毒素国家标准品981的研制的研制概况1.我国细菌内毒素国家标准品从1979年研制成功并正式建立至今共研制分发了六批。2.现行细菌内毒素国家标准品981的研制与考核时间3.研制分四个阶段细菌内毒素国家标准品981的特点1.细菌内毒素精品的提取2.细菌内毒素国家标准品的赋形剂3.候选品的生产4.候选品的考核5.协作标定-新的国际标准品IS2为基准细菌内毒素国家标准品981的特点6.标定方法-凝胶法和定量法7.协作标定后结果经数据处理和专家讨论8.报中检所学术委员会审定9.长期稳定性考核与分装后的稳定性考核10.标准品的有效期细菌内毒素检查
5、法考察报告细菌内毒素检查法考察报告1.王思理等一行4人于1998年1月16日-27日首次赴美国进行细菌内毒素检查法的专题考察。2.我们这次考察作了充分准备,是带着问题而去的,在出访前又集中讨论了要了解的重点问题.3.这次考察将对我国细菌内毒素检查法的发展起到良好的作用.考察主要收获一.鲎试剂的生产与管理1.鲎试剂生产企业生产的试剂均须按照美国联邦法律的有关规定进行质量控制并送FDA检验通过后方可销售。2.生产企业在批批送检时须呈交所有质量控制和原始记录。3.在对鲎试剂的灵敏度进行标定时需同进使用美国内毒素国家标准品和鲎试剂参考标准品。考察主要收获二.内毒素标准品的管理1.美国FDA负责管理内毒
6、素国家标准品(EC系列)和鲎试剂参考品,政府免费提供内毒素国家标准品和鲎试剂参考品给鲎试剂生产厂家用于灵敏度标定。2.工作标准品(CSE)由厂家自行生产和发放,政府不核发有关执照。考察主要收获三.细菌内毒素检查法用于药品生产过程及最终产品的质量控制考察主要收获四.由热原检查法改为细菌内毒素检查法1.细菌内毒素限值的计算2.由热原检查法转换为细菌内毒素检查法的条件是供试品在一定条件下不干扰鲎试验，每个厂家每个品种做3批供试品的干扰试验即可，不必进行对比试验。考察主要收获五.细菌内毒素检查法1.鲎试剂灵敏度复核的目的不是考察灵敏度是否准确，而且考察操作是否准确，以及工作标准品是否准确。2.0.1m
7、l规格的鲎试剂的生产与使用应与国际接轨。3.对供试品进行常规检查时，阳性对照对4个浓度，至少有两个浓度，即2和0.25。同时供试品阳性对照不可缺少。每个浓度平等做两管。4.用于配制调节供试品酸碱度的氢氧化钠溶液、盐酸溶液、缓冲溶液等均严格要求细菌内毒素检查用水。考察主要收获六.其他1在计算大输液的内毒素限值时，M一般定为10ml/kg/hr。2.FDA的关于细菌内毒素检查法的Guldeline(指南)不具有法律效应，它不是Regulation。3.美国药典收裁的细菌内毒素检查法的法定方法为凝胶法，其它两种方法可以采用，但需做比较试验。4.新药在生产过程中和最终产品的质量控制均须要求采用细菌内毒
8、素检查法。几点建议1.抓紧修订和完善中国药典2000年版附录细菌内毒素检查法。2.制订细菌内毒素检查法应用指导原则，统一规范检查中的有关问题。3.对鲎试剂实行批批检定或统一发放细菌内毒素工作标准品，建议中检所研究解决。4.扩大品种的应用，建议药典会制定原则，宜先将中国药典95年版中要求进行热原检查法的品种改为细菌内毒素检查法，新药应积极推广使用细菌内毒素检查法。关于如何在我国将热原检查法改为细菌内毒素检查法的记得建议建议一.首先应该明确将热原检查法改为细内菌毒素检查法不要做“兔法”与“鲎试验法”的对比试验。对比实验严重地影响了我国在药品热原检查中改为细菌内毒素检查的进度，大大的落后了美国，这个
9、历史才识必须吸取。建议二.要在我国大量品种实施细菌内毒素检查法的一个重要任务是必须要作好细菌内毒素检查法系统工程的标准化工作。细菌内毒素检查法系统工程标准化的内容1.细菌内毒素检查法的修订2.细菌内毒素检查法扩大应用指导原则的制定3.细菌内毒素检查法标准化操作规范(SOP)的制订4.细菌内毒素国家标准品的研制5.鲎试剂内在质量的研究细菌内毒素检查法系统工程标准化的内容6.鲎试剂部颁标准的修订7.鲎试剂国家对照品的研制8.细菌内毒素工作标准品的研制9.细菌内毒素检查用水的研制10.细菌内毒素定量法的研究等十项内容建议三.明确了上述两个问题，其首要的具体问题就是要科学地合理地确定细菌内毒素的限值。
10、四.将热原检查法改为细菌内毒素检查法，并且确定了内毒素限值后，关键总是就是作好干扰试验。五.做好品种的选择工作建议六.要在我国实施热原检查法改为细菌内毒素检查法的规范化。 1.规定内毒素限值(L)2.由药厂和鲎试剂厂相结合，共同做好供试品的干扰试验，实现两个方法的转换。3.要求各级药检所，做好配合和复核工作。建议七、由药典会制定两法转换申报程序总之为使2000年版药典能有较多的品种采用细菌内毒素检查法，必须抓紧时间，充分利用这个良好机遇，做好品种汇总申报和审批工作。论药品生物制品细菌内毒素论药品生物制品细菌内毒素检查限值的确定检查限值的确定我国细菌内毒素检查法建立现状可以概括的说：慢！主要原因
11、：1.如何将热原检查法改为细菌内毒素检查法或者说如何以细菌内毒素检查法代替热原检查法？至今还没有一个明确的规定。2.如果科学地合理地确定细菌内毒素检查限值？尚未得到应有的重视。一、如何科学地合理地确定细菌内毒素检查的限值L=K/MK值的确定M值的确定二、目前国内在细菌内毒素限值确定中存在的问题 1.采用热原检查剂量就会造成细菌内毒素检查的内毒素限值规定过严。2.细菌内毒素限值L确定后，就根据L值进行稀释和做干扰试验。这样它们的结果也需重新考虑了。3.目前大量的细菌内毒素限值的实际确定、鲎试验、发表文章、上报成果等多用“热原检查剂量”或“L=K/（fM），f为安全系数，一般为310”来确定L值。
12、再论细菌内毒素限值的确定再论细菌内毒素限值的确定目前细菌内毒素限值确定存在的问题主要问题是对“M为人用每公斤体重每小时最大剂量”作了如下的解释：1.把最大剂量解释成“热原检查法剂量”。2.把最大剂量解释成“每小时的人用量的f倍”。3.把最大剂量解释成“热原剂量或人用最大剂量”。笔者认为科学地合理地确定细菌内毒素限值不仅对我国建立细菌内毒素检查法至关重要，对保证被检药品的安全使用也十分重要。而且它还直接关系到判断药品合格与否，影响药品能否出厂，同时与国际贸易和对外技术交流等都有十分密切的关系。笔者认为虽然同一品种，由于中国和美国的人用最大剂量有所不同以及人体重60Kg与70Kg的差异，因此限值的差异是必然的。但是，同品种限值相差f倍是不合理的，值得引起重视的。中国药典2000年版细菌内毒素检查法应用指导原则对细菌内毒素限值的确定已经很明确，对自己负责管制的品种进行细菌内毒素限值的重新审核是非常必要的。
