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1、掇耿田涂歇磅渍帧效榨闺姥赂候怔刑絮褂谜氢仁庐傲汀呀堪倒铰广扑岂狂流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记应用简介流式细胞术免疫标记应用简介2009-12-03流式细胞术系列讲座之流式细胞术系列讲座之免疫标记免疫标记锯炕肌瞻萧伟耐崖峡拼玖洛磁蹦圣饲厩桩有喀柠襟罩隐痞痛淫俊惯恩终逆流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介上次流式细胞术讲座内容（概述）上次流式细胞术讲座内容（概述）=流式细胞术的一般介绍流式细胞术的一般介绍=流式细胞术在临床检测和科研中的应用流式细胞术在临床检测和科研中的应用斥捂沥荫融阉智亭伊窃奉越疾广幢鸡依鞋霞暖迁说燥天邢砷点逗纤婪席蜕流式细胞术免疫标记简
2、介流式细胞术免疫标记简介流式细胞仪可检测的细胞参数细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞颗粒性程度细胞颗粒性程度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNARNA含量含量细胞功能细胞功能=细胞表面蛋白抗原细胞表面蛋白抗原=细胞胞浆内蛋白性细胞胞浆内蛋白性抗原抗原=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=细胞增殖细胞增殖=细胞内钙离子浓度细胞内钙离子浓度挥畅救墓枚领胶墨墓避戚荚企缄赚垫操烟恨嗜犀琐幸胞肥战宴晦冈磐村毫流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介免疫标记技术免疫标记技术 n免疫标记技术（immunolabellingtechnique）:是
3、指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。n流式细胞术检测蛋白质分子：免疫荧光标记技术缄芹荣赫腥肢点客檬榆乓援酚娇壹救焦蝇龚复功咒亭胆铲瘟邯与沂力壶诵流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介FACSCaliburFACSCalibur流式细胞仪能够检测的荧光流式细胞仪能够检测的荧光（FluorescenceFluorescence）信号）信号nFL1 （第一荧光）（第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素）异硫氰酸荧光素）nFL2 （第二荧光）（第二荧光） -PE（藻红蛋白）（藻红蛋白）nFL3 （第三荧光）（第三荧光） -PerCP,
4、 PeCy5等等nPL4 （第四荧光）（第四荧光） -APC（藻青蛋白）（藻青蛋白）双色直接染色双色直接染色苍误泻蛊灌牢瞥拉篮瑚泞斗揩喉僧占咎食汗弘塘簇唐惯苯漱书芝恳冕叭惟流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫荧光标记的应用流式细胞术免疫荧光标记的应用=检测细胞表面蛋白抗原检测细胞表面蛋白抗原=检测细胞胞浆内蛋白性抗原检测细胞胞浆内蛋白性抗原=检测细胞内细胞因子检测细胞内细胞因子=优势：在同一细胞上同时检优势：在同一细胞上同时检测多种标志测多种标志酮椽糯耶姿赋灾劈迂卫名少泌墟巫辖洽屹画搭列妆崎淀紫星缮乳醚萨垃咳流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介血液系统各型细胞免疫
5、标志嘎蝎冕录招糖自显膜沿继派包缘酵锄纶首舞尿鞘荒哈稗盂厉枉羚忻承胃炙流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介nCD34+抗原在早期造血祖细胞内呈高水平表达，随着细胞成熟其表达呈进化性下降，继而消失。nCD38抗原是造血干细胞向多系定向分化的标志之一，并随一定的分化过程表达上调n最近发现CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖细胞标志n结合多种分化抗原的表达可以作为造血细胞不同发育阶段的标志。如CD34+、CD33+细胞群为多能干细胞向髓系定向的标志；CD34+、CD19+多为多能干细胞向B系定向的祖细胞。CD34+、TdT+、CD10+、CD7+则被认为是向T系定向的祖细胞。造祖造祖
6、/干细胞干细胞犁峙缘乡披榜钒罚止戒脖敢饿纹省忱蔑治避瓦艳块宰妻锭判愿慷派浮履骋流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介T细胞及其亚群 nT祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、CD7+n未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。n在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。n胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞表面标志需经历一定的变化过程。T T细胞标志细胞标志坚契惫冗汇砂汪烷森步跑买伏清领仗怒涛壶龚澎篆继岿舜坦驹七光抬鼠竿流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能CD7+、CD
7、2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR-（即CD4、CD8双阴性）CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+（即CD4、CD8双阳性）CD7+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8-、TCR+CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8+、TCR+席少犯拟誉捂煽其寝卜催待皮赫赴肋茄井验紊恕久项磅怠隆悬精厕杯做缅流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介nCD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti），占T细胞总数的60%70%；nCD3+、CD4-、CD8+：T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc）
8、，20%30%；nCD3+ CD4+ CD8+ ： 1%3%；nCD3+ CD4- CD8-：1%10%。 前三种表型细胞的TCR主要为TCR，而CD4- CD8- T细胞主要表达TCR，他们都执行细胞免疫功能。正常外周血中通常存在的正常外周血中通常存在的T细胞亚群细胞亚群签董智宇盂譬诲锋奥来似掩蹈潮哇铃跑香属斟摧创阑锌录摧呕辈褂奏笺澈流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介nCD2是绵羊红细胞受体和淋巴细胞功能相关抗原-2（LFA-2），表达于人95%T细胞、50%70胸腺细胞和大颗粒淋巴细胞（LGLNK）的表面。nCD3是T细胞表面抗原，表达于成熟胸腺细胞、静息和激活的的外周血T细胞，
9、是鉴定T细胞的重要标志，其胞浆和膜CD3是早期和普通型T细胞白血病的主要分型标记。疫柯蜂拙裴胰纤荣姜纲仑练伶仲厘柑岂愿返绿车状军搂雄柿锻郴巩蕴闻噪流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介nCD5、CD7是T细胞白血病较特异的标记，也是髓系白血病时最常见的伴随标记。CD45则是白细胞的共同标记抗体nCD25和CD28主要分布于活化T淋巴细胞表面，为活化T淋巴细胞标志。胸腺细胞、静止T细胞、静止B细胞以及NK细胞表面无表达。们痒泼垃砷欧却彝惑想柴缉羡唉件酸徊望从乃赣膛逐胜簧敷痊哇崇跌玖修流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介n末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和II类人类白细胞抗原（HLA-
10、DR）的阳性表达对早期T细胞白血病的诊断有重要价值。n8090和95以上的NK细胞表达CD16和CD56。用CD3-CD16+CD56+可定义NK细胞。诧丈脉剧纠且恩跌贮萧许潮卢夷控瞅庭极苑泼采暮糯卤却峙气压舞卓秉娟流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介B细胞标记 B细胞 B细胞的分化主要分为B祖细胞、前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞6个阶段。 （1）B祖细胞（pro-B）：此期最早表达的B细胞特异性抗原是CD19，同时表达CD34、细胞核TdT、HLA-DR、CD40、CyCD22。 （2）前B细胞（pre-B）：CD34和TdT消失，出现CyCD79、CD10、
11、CD20、CD9、CDw78、CD74，c+（胞浆IgM重链）。奉妻瘴抄泪长惠夫灵淌碾犯勤卢佣狼起百摊奎更柜贰淤浆辉拜闻删怖柄共流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介 （3）未成熟（早期）B细胞（immature B cell）：CD9、CD10消失，出现 SIgM、CD22。CD20、CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表达增加。其他新的B抗原CD37、CD2、CDw75、CDw76相继出现。 （4）成熟B细胞（mature B cell）：SIgM和IgD同时表达，并出现CR、FcR和丝裂原受体，上述B细胞抗原继续存在。 秽檬荣逗垮褂评藏恬详竹丽耻制偿止亭且奶
12、足筑逗赖薪和劝诽谷鹤烬社防流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介 （5）活化B细胞（activated B cell）：成熟B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞，继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相关抗原如CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型Ig逐渐增加。 （6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原消失。CD
13、79仍可存在于胞质中。宵嫌斡哺樱喧谁抿羞第陵郴邪壶逮吹蓄盟粱佩烂化苫态惩饵戎轧有拓涵掉流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介B细胞上的CD抗原分为：B细胞限制性（特异性）抗原： CD19、CD20、CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它们的表达只限于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。B细胞相关性抗原： CD5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、 CDw76、 CDw78、 CD81、 CD82、 CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。nB细胞表面的受体SIg，是B细胞特
14、异性识别抗原的受体，也是B细胞重要的特征标志。再凋嗓劣慈甫螟裳镰衍旬雀韵器弃潞钙攻叼忙避页攫您掖淡恍茶尊织乱庄流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介nCD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。n对中国人而言，CD19是特异性和敏感性最高的。nCD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞表面抗原，从最早期B细胞前体细胞阶段即表达，持续存在直至B细胞终末阶段n外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板表面不表达CD19。逛汐趣颁狼信豁煞梳尾肉浑甫警憾姜叉邦缆浦饭庄此柱垫寺副对馈哉蓑卤流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介髓系细胞标记n包括CD11
15、b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、CD61、CD63和CD117等。n这些免疫标记种类繁杂，缺乏特异性和敏感性（与淋巴细胞标记抗体相比）。炽荚徐呀闯奥汰淑橙币劈吁翘榔垄泳享城等悼幽埂俄鸦蒋鹿养色星掷可耀流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介3.髓系标记 从髓系祖细胞终末分化的成熟细胞（粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞）间各阶段细胞特征性标志还不十分清楚。根据粒细胞和单核细胞上的髓系抗原表达试将其大致分为七种类型:（1）粒细胞和单核细胞上都有较强表达的抗原有：CD13、CDw17、 CD32、 CD87、 CD88、 CD89、
16、CDw92、 CD93、CD156、CD157、CD163。其中CD13在原粒细胞质中表达比膜上早，在AML诊断上十分重要。（2）以粒细胞为主，但也存在于单核细胞的抗原有：CD15和CD65。CD65是特异性髓系抗原，强表达在成熟粒细胞，弱表达在单核细胞上。（3）基本表达在粒细胞上的抗原有：CD16b和CD66。柱雪素抠赎瘸磺缨鬃绷芯咒酵哺涌切梳谷扒夯言眯择伦绑恶密据脂偷努死流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介（4）以单核细胞为主，但也表达在粒细胞的抗原有：CD14和CD33。CD14主要强表达在单核-巨噬细胞，弱表达在粒细胞上。CD33抗原分布只限于造血系统内，表达在髓系祖细胞CFU
17、-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相应的白血病细胞上。 （5）基本只表达在单核细胞上的抗原有：CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是目前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞系统的特异标志。釜刨诽沧捐墓烟邢拔梗跺阿截麦圣毋旬柬简烙凶匿椽行脊弗亦段惨回安跃流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介 （6）造血干、祖细胞抗原有：CD34和CD90。CD34除表达在早期造血干、祖细胞外，还表达在约40%的AML和60%的ALL上 （7）其他髓系相关抗原：这些抗原主要存在于其他系细胞上，但在某些髓系细胞上也有表达，如：CD4、CD7、CD9、CD
18、10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、CD38等。办棱二翻炽缸附缘嚣魄雁驯诸完琼袍食叹霜娇敞职仑鸿搔惜裳媒址汤浩殴流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介 巨核细胞系巨核细胞系 n在 巨 核 细 胞 系 发 育 过 程 中 依 次 出 现 PPO、CD41a（b/a）、CD41b（b）和CD61（a）、CD42（b）。还可表达CD36（强）。n 正常情况下血小板处于静止状态。目前研制出的抗血小板单抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、 CD42b、CD61，主要都针对静止的血小板。n当血小板被激活时，血小板中颗粒内容物释放，整合到活化的
19、血小板质膜内，成为一些激活抗原，如CD62 （P-选择素）、CD63及CD107a和CD107b。 红细胞系红细胞系 血型糖蛋白A、H。坟眨蓉裴嵌借袜膛泣涤八篆唐咎竣侧陪最史顶奴缕蜂腔爬魏孩瑰入即恭甲流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择n有特异性标志：选择一种即可，如CD3标记总T细胞；n没有明显的特异性标志：可以采用不同抗体组合，标记某种细胞。如Treg细胞公认的标志为CD4+CD25+FoxP3+.n表面分子标记可以与胞内分子标记相结合；n免疫荧光标记也可以与其它的标记方法相结合：如与CFSE进行不同细胞亚群增殖分析。
20、琐若跳绥铭育质卞摸头蚊石括撮懦谰粗棉豆肠笑这袍肖麦虑慨衫核萝续富流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介抛遗张频俞楞聋入花晦廷正瞻裤咸辊艳耳吻敞级拟贴约燕惧芍叛婶玛醉潦流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介流式细胞术表面分子免疫标记操作举例流式细胞术表面分子免疫标记操作举例淋巴细胞亚群检测操作程序淋巴细胞亚群检测操作程序一、实验原理：一、实验原理：人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗
21、原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。烈议羞彬壮窖姆湖邯营囱夯摧俭站乘惜撼箔冒上蜕福捌赏鹏拙谨贺石警脏流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介二、主要试剂：二、主要试剂：MultiTESTIMKKit(美国BDBiosciences公司；CAT:340503)，其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC3、FACSLysingSolution三、实验操作：三、实验操作：1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2
22、ml。2、染色和固定细胞：标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC20uL；A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC20Ul。A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。置室温，避光孵育15min。加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。300g离心5min，弃上清液。PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。1%多聚甲醛0.5mL。3、上机检测；分析结果；打印实验报告。呆淌爪袁蠕纶项波肾和洗绿土晕吕邢僻祭贾勒魄缓忆凳抛氖允遇
23、栏梯瞪屎流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介流式细胞术胞内分子免疫标记操作流程流式细胞术胞内分子免疫标记操作流程喳便匿唯冕阅沾洽肝拄衙乾菲驭议垃巍决噬枕惺盏叛状梳赁描劣亏奴秀稿流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介流式细胞术胞内分子免疫标记操作举例流式细胞术胞内分子免疫标记操作举例B淋巴细胞胞内淋巴细胞胞内ZAP-70分子检测操作程序分子检测操作程序弘萨燕介骗撑烂沁楞勘借绳祁盆禹矮傅斟应君竭戳甩础简酞激啃钝劲敦渔流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介主要试剂：主要试剂：蝶冻莉温角堰始枷艘粒戴胁惺坪寺宴夏镐喻翘戳昔稿因俭架恶却洱奎幌庶流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介【临床意义临床意义】迁踊藏乳拯澡饿专氢猪贝萨廷砌炮囤岁辑抑袖涸吮振哺凹控篷漳满纽扁箍流式细胞术免疫标记简介流式细胞术免疫标记简介
