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1、第三章第三章 动物细胞工程制药动物细胞工程制药第一节第一节 概述概述一、动物细胞工程的发展简史一、动物细胞工程的发展简史19071907年，年，HarrisonHarrison首先培养了神经管首先培养了神经管区细胞，并观察到从中长出的轴突细区细胞，并观察到从中长出的轴突细胞胞( (神经纤维神经纤维) )，他的工作被认为是，他的工作被认为是动动物细胞培养开始的标志物细胞培养开始的标志。19111911年，年，CarrelCarrel发现了鸡胚浸出液对发现了鸡胚浸出液对于细胞培养的生长促进作用，并于细胞培养的生长促进作用，并首次首次把无菌技术引入细胞培养技术中。把无菌技术引入细胞培养技术中。195
2、01950年后年后EarleEarle等分别等分别建立建立了了HelaHela等多等多种种细胞系细胞系(cell line)(cell line)动物细胞培养从动物细胞培养从5050年代起步，已成为普遍技术年代起步，已成为普遍技术新的核酸技术，免疫，电泳等技术使细胞培养技新的核酸技术，免疫，电泳等技术使细胞培养技术从细胞水平进入分子水平术从细胞水平进入分子水平19861986年，传代细胞年，传代细胞NamalwaNamalwa（Burkitts 淋巴瘤细胞淋巴瘤细胞）生产的干扰素批准临床生产的干扰素批准临床猴肾细胞猴肾细胞VeroVero生产疫苗生产疫苗19871987年，杂交瘤细胞生产抗体年
3、，杂交瘤细胞生产抗体19881988年后，传代细胞生产基因工程产品年后，传代细胞生产基因工程产品t-PAt-PA、EPOEPO、VIIIVIII二、动物细胞工程制药的基本概念二、动物细胞工程制药的基本概念（一）动物细胞工程制药（一）动物细胞工程制药目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过产的已超过80%80% ，例如蛋白质、单克隆抗体、疫，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等苗等动物细胞工程制药包括：动物细胞工程制药包括：培养细胞培养细胞获得多肽和蛋白药物获得多肽和蛋白药物转基因动物转基因动物生产疫苗，多肽和蛋白药物生产疫苗，多肽和蛋白药物动物细
4、胞培养的产物动物细胞培养的产物 疫苗疫苗人人小小儿儿麻麻痹痹症症疫疫苗苗、狂狂犬犬疫疫苗苗、风风疹疹疫疫苗苗、脑脑炎炎疫疫苗、疱疹疫苗等苗、疱疹疫苗等动物动物牛牛病病毒毒性性腹腹泻泻疫疫苗苗、牛牛痢痢疾疾疫疫苗苗、犬犬传传染染性性肝肝炎炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、单克隆抗体单克隆抗体IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA等等免疫调节剂免疫调节剂-细细胞胞生生长长因因子子、INTINT、白白细细胞胞活活化化因因子子、血血清清胸腺因子、胸腺因子、ILIL、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶酶uPAuPA、AsnA
5、sn酶酶、胶胶原原酶酶、P450P450、纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原激激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、TyrTyr脱羟酶等脱羟酶等激素激素HCGHCG、EPOEPO、促促滤滤泡泡激激素素、GHGH、促促间间质质细细胞胞激激素素、促黄体激素等促黄体激素等动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细细胞融合技术胞融合技术、细胞核移植技术、动物细胞反应器，、细胞核移植技术、动物细胞反应器，动物克隆，染色体改造，基因转移，动物克隆，染色体改造，基因转移，转基因动物转基因动物技术技术和和细胞大规模培养技术细胞大规模培养技术等方面等方面最基本的
6、有最基本的有细胞融合技术细胞融合技术、转基因动物技术转基因动物技术和和细细胞大规模培养技术胞大规模培养技术三项技术三项技术（二）动物细胞的分类（二）动物细胞的分类1. 贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞:包括成纤维细胞型，上皮细胞包括成纤维细胞型，上皮细胞型。生长于支持物表面。型。生长于支持物表面。上皮细胞型成纤维细胞型2. 非贴壁依赖性非贴壁依赖性也称也称悬浮细胞悬浮细胞这类细胞培养时不贴附于这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、悬浮生长。来源于血液、淋巴组织，许多肿瘤细胞淋巴组织，许多肿瘤细胞等均属于此类。细胞一般等均属于此类。细胞一般呈圆形呈圆
7、形。悬浮细胞悬浮细胞3.兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞有些细胞呈现双重性，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可既可以贴壁生长，也可以悬浮培养。如中国仓以悬浮培养。如中国仓鼠卵巢细胞，小鼠鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。细胞。兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞（二）动物细胞培养的环境条件（二）动物细胞培养的环境条件1.温度。温度。2.Ph。7.2-7.4 酚红酚红3. 通氧量，通氧量，需需CO24.防治污染。支原体、抗生素。防治污染。支原体、抗生素。5.基本营养物质基本营养物质6.渗透压渗透压（三）动物细胞的培养特征（三）动物细胞的培养特征1.比微生物细胞大，无细胞壁，比微生物细胞大，无细胞壁，抗机械强度低，
8、抗机械强度低，对剪切力敏感，对剪切力敏感，适应环境能力差适应环境能力差。2.倍增时间长，倍增时间长，生长缓慢，易污染生长缓慢，易污染，培养时添，培养时添加抗生素加抗生素3.培养基要求高，易污染。培养基要求高，易污染。4.培养过程中培养过程中细胞相互粘连以集群形式细胞相互粘连以集群形式存在。存在。5.产物分泌性产物分泌性6.蛋白后修饰蛋白后修饰动植物细胞培养与微生物培养性能的相比动植物细胞培养与微生物培养性能的相比项目目哺乳哺乳动物物细胞胞植物植物细胞胞微生物微生物细胞胞大小大小 mm悬浮生浮生长营养要求养要求倍增倍增时间h h 细胞分化胞分化环境的敏感性境的敏感性产物存在物存在产物物浓度（度（
9、% %）产物种物种类1010100100可以，多采用可以，多采用贴壁壁很复很复杂1515100100有有非常敏感非常敏感胞内或胞外胞内或胞外低低疫苗、激素、抗体、疫苗、激素、抗体、生生长因子、免疫因子、免疫调节剂等等1010100100可以，但可以，但细胞易聚集胞易聚集复复杂1515100100有限分化有限分化敏感敏感胞内胞内低低酶酶、生物碱、天然色、生物碱、天然色素、有机化合物等素、有机化合物等1 11010可以可以简单0.50.55 5无无一般一般胞内或胞外胞内或胞外高高发酵食品、抗生酵食品、抗生素、有机化合物、素、有机化合物、酶酶细胞培养基本技术细胞培养基本技术1.原代培养原代培养p（1
10、）组织块培养法）组织块培养法p（2）单层细胞培养法）单层细胞培养法动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物的组织、器官的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬浮悬浮液液10代代细胞细胞部分细胞部分细胞“癌变癌变”，无限传代，无限传代动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成动物体最终培养成动物体50代细胞代细胞原原代代培培养养传代培养传代培养细细胞胞贴贴壁壁剥离、分瓶剥离、分瓶细胞株细胞株细胞细胞细胞系细胞系2.传代培养传代培养3.克隆培养克隆培养 饲养细胞饲养细胞细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏l在在70以下时，细胞内的酶活性均己停止，以下时，细胞内
11、的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。l低温保存的低温保存的关键关键：在于通过在于通过0-20阶段的处阶段的处理过程。理过程。 在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤细胞的严重损伤。 冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融p当细胞冷到零度以下：形成冰晶。当细胞冷到零度以下：形成冰晶。p如果缓慢冷冻，逐步脱水，不致产生大的冰晶如果缓慢冷冻，逐步脱水，不致产生大的冰晶p复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。冰晶
12、的重结晶。p常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSO，提高胞膜对水的通透性，提高胞膜对水的通透性， 降低冰点，减少胞内冰晶，降低冰点，减少胞内冰晶，第二节第二节 生产用动物细胞生产用动物细胞一、生产用动物细胞的获得一、生产用动物细胞的获得（一）非基因工程细胞的获得（一）非基因工程细胞的获得1.原代细胞原代细胞(primary cell)直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液获得的细胞悬液1g组织约有组织约有109个细胞个细胞增殖能力有限，需要大量的动物才能增加产量，增殖能力有限，需要大量的动物才能增加产量，费钱费劳力费钱费劳力, 限制
13、了它的应用。限制了它的应用。动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞、的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞等鼠肾细胞、淋巴细胞等适合药物检测适合药物检测2.传代细胞系传代细胞系(passage cell)原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株胞株(continuous cell lines, CCL)。染色体组型是染色体组型是2n的核型的核型,二倍体细
14、胞系二倍体细胞系具有贴壁依赖和接触抑制的特性具有贴壁依赖和接触抑制的特性有限的增殖能力，有限的增殖能力，50代代无致瘤性无致瘤性一般从胚胎中获得，有限传代一般从胚胎中获得，有限传代WI-38, MRC-5, 2BSWI-38, MRC-5, 2BS等。等。WI-38WI-38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系细胞系传代细胞传代细胞在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处处, , 有时是从肿瘤细胞衍生而来有时是从肿瘤细胞衍生而来, , 由于缺乏有效的由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性科学手段来排除其潜在的致
15、瘤性, , 因而数十年间未因而数十年间未允许允许传代细胞传代细胞用于生产。用于生产。7070年代以后，大量研究工年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性作证实了二倍体细胞的安全性现在现在CCLCCL已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系仍不是理想的生产细胞系。3. 3. 转化细胞系转化细胞系(transformant cell)(transformant cell)l通过某个转化过程形成的，失去正通过某个转化过程形成的，失去正常细胞的特点常细胞的特点。由于染色体的断裂变成由于染色体的断裂变成异倍体异倍体，获得，获得无限增殖无限增殖的
16、的能力能力自发的：正常细胞中自发的转化形成有无限生自发的：正常细胞中自发的转化形成有无限生命力的细胞系；多发生于啮齿类细胞动物命力的细胞系；多发生于啮齿类细胞动物人为转化：采用某些病毒人为转化：采用某些病毒SV40SV40或某些化学试剂或某些化学试剂从动物肿瘤组织中建立的细胞系从动物肿瘤组织中建立的细胞系转化细胞为转化细胞为永生化细胞永生化细胞，无限细胞系，无限细胞系，连续细胞连续细胞系系转化细胞具有无限生命力，倍增时间短，对培养转化细胞具有无限生命力，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求低，更条件和生长因子等要求低，更适于大规模工业化适于大规模工业化生产生产在生物制药中，可通过改造宿主细胞
17、特性，如延在生物制药中，可通过改造宿主细胞特性，如延长细胞周期长细胞周期, 提高工程细胞原始表达水平等来提高提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量。药物的产量。NamalwaNamalwa、CHOCHO、BHK-21BHK-21、VeroVero细胞。细胞。（二）基因工程细胞系的构建（二）基因工程细胞系的构建在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，和在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，和采用基因工程手段构建的各种工程细胞采用基因工程手段构建的各种工程细胞基因工程细胞系基因工程细胞系：用基因工程技术或细胞融合技术：用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获
18、得对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系具有稳定遗传的独特性状的细胞系分分杂种细胞杂种细胞(hybrid cell)(hybrid cell)和和重组细胞重组细胞(reconstituted cell)(reconstituted cell)l（1）杂种细胞杂种细胞的构建：通过细胞融合技术构建的的构建：通过细胞融合技术构建的动物动物细胞融合细胞融合：合并为双核和多核细胞的过程：合并为双核和多核细胞的过程不同基因型的细胞融合为不同基因型的细胞融合为异核体异核体(heterokaryon)(heterokaryon)核体经有丝分裂和染色体重排，可形成具有新核体经
19、有丝分裂和染色体重排，可形成具有新的遗传性状的单核杂种细胞，的遗传性状的单核杂种细胞，合核体合核体(synkaryon)(synkaryon)(1)(1)细胞融合细胞融合（cell fusioncell fusion）：）：正常情况下，因有完整的细胞膜，两个接触的细正常情况下，因有完整的细胞膜，两个接触的细胞不发生融合胞不发生融合诱导物可导致细胞融合：诱导物可导致细胞融合：仙台病毒仙台病毒聚乙二醇聚乙二醇物理方法：电击法，激光法物理方法：电击法，激光法仙台病毒融合法仙台病毒融合法仙台病毒属于副黏病毒科，副流感病毒仙台病毒属于副黏病毒科，副流感病毒I I型，型，RNARNA病毒病毒病毒表面有神经
20、氨酸酶，降解细胞膜上的糖蛋白，病毒表面有神经氨酸酶，降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞粘在病毒周围，细胞互相渗透，融合使细胞粘在病毒周围，细胞互相渗透，融合目前很少使用目前很少使用聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法PEGPEG结构式：结构式：HOHHOH2 2C(CHC(CH2 2OCHOCH2 2) )n nCHCH2 2OHOH分子量分子量200-6200-6，000000常用分子量常用分子量10001000，浓度，浓度50%50%，pH8.0-8.2pH8.0-8.2原理：原理： 50%50%的的PEGPEG，与临近膜的水相结合，导致双，与临近膜的水相结合，导致双脂层的不稳定，使膜发生融合脂层的不稳
21、定，使膜发生融合主要用于生产单克隆抗体的主要用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备杂交瘤细胞的制备电融合法电融合法细胞在短时间的强电场作用下，膜发生可逆性的细胞在短时间的强电场作用下，膜发生可逆性的电击穿，使相邻细胞的膜发生继发性融合电击穿，使相邻细胞的膜发生继发性融合操作简便、无化学毒性、细胞损伤小、融合同步、操作简便、无化学毒性、细胞损伤小、融合同步、融合率高融合率高可比可比PEGPEG高高10-2010-20倍倍可在显微镜下直接观察融合过程可在显微镜下直接观察融合过程用于小鼠骨髓瘤细胞的融合用于小鼠骨髓瘤细胞的融合，构建大量生产人源，构建大量生产人源单克隆抗体的淋巴杂交瘤细胞株单克隆抗体的
22、淋巴杂交瘤细胞株还可用于还可用于真核细胞与原核细胞、动物细胞与植物真核细胞与原核细胞、动物细胞与植物细胞的融合细胞的融合（2 2）杂种细胞筛选）杂种细胞筛选细胞融合后，除目的杂种细胞外，还有同合体细细胞融合后，除目的杂种细胞外，还有同合体细胞和未融合的亲本细胞胞和未融合的亲本细胞筛选方法筛选方法：（1 1）营养缺陷型细胞系或抗性细胞系营养缺陷型细胞系或抗性细胞系作为融合作为融合的亲本细胞，选择培养基来筛选的亲本细胞，选择培养基来筛选（2 2）利用或人为制造两个）利用或人为制造两个亲本细胞的物理差异亲本细胞的物理差异，如大小，密度等进行筛选如大小，密度等进行筛选（3 3）利用或人为制造）利用或人
23、为制造杂种细胞与未融合细胞生杂种细胞与未融合细胞生化或分生能力的差异化或分生能力的差异，进行筛选，进行筛选2.2.重组细胞的构建（基因工程细胞系）重组细胞的构建（基因工程细胞系）在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，和采用基因工程手段构建的各种工程细胞和采用基因工程手段构建的各种工程细胞包括包括CHOCHO，BHK-21,SP2/0BHK-21,SP2/0，VeroVero细胞等细胞等最多用的是最多用的是CHOCHO目前用重组目前用重组DNADNA术改造的术改造的CHOCHO细胞生产细胞生产INFINF、ILIL、EPOEPO、单抗以及、单抗以及p
24、roteinprotein药品已成为国际医药市场药品已成为国际医药市场上的热销产品，但这些产品的生产规模普遍较小上的热销产品，但这些产品的生产规模普遍较小( (大多为大多为5-50L5-50L的小型罐的小型罐) )（1 1） 表达载体的构建表达载体的构建 外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在高效表达载体内，表达载体两类：构建在高效表达载体内，表达载体两类：a.a.病毒载体病毒载体，牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒，牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和杆状病毒和杆状病毒 b.b.质粒载体质粒载体穿梭质粒载体穿梭质粒载体a.a.病毒载体病毒载体p牛痘病毒载体
25、牛痘病毒载体：大容量，广泛地用来构建多价疫大容量，广泛地用来构建多价疫苗苗(重组牛痘多价活疫苗重组牛痘多价活疫苗)。表达外源性病毒抗原基因，表达外源性病毒抗原基因，如：如：HAV、HBV、麻疹病毒、麻疹病毒、I型和型和II型型HSV、EBV，狂，狂犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成的牛痘苗病毒犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成的牛痘苗病毒p腺病毒载体和反转录病毒载体腺病毒载体和反转录病毒载体：正被适用于基因正被适用于基因治疗中治疗中p杆状病毒载体杆状病毒载体：可感染多种哺乳动物细胞，生物可感染多种哺乳动物细胞，生物安全度高，已成功地用于安全度高，已成功地用于300300多种外源基因的高多种
26、外源基因的高效表达。效表达。用杆状病毒进行蛋白质的高效表达用杆状病毒进行蛋白质的高效表达b. b. 质粒载体质粒载体穿梭质粒穿梭质粒:能在两种或两种以上宿主中复制的质粒能在两种或两种以上宿主中复制的质粒 基本成分：基本成分：允许允许载体在细菌内扩增的质粒序列，包括起始位点和抗生载体在细菌内扩增的质粒序列，包括起始位点和抗生素标记基因序列；素标记基因序列；能使基因表达的能使基因表达的调控元件调控元件，包括包括TATA boxTATA box，CAAT boxCAAT box和增和增强子，终止序列、强子，终止序列、3 3端切割序列和端切割序列和polyApolyA序列；序列；选择标记选择标记，一类
27、是仅适用于密切相关的突变细胞株，一类，一类是仅适用于密切相关的突变细胞株，一类是显性作用基因，如新霉素抗性基因是显性作用基因，如新霉素抗性基因(neo);(neo);带有选择性带有选择性增加拷贝数增加拷贝数的扩增系统，常用的是二氢叶酸还的扩增系统，常用的是二氢叶酸还原酶系统，谷氨酰胺合成酶系统和腺苷脱氨酶系统。原酶系统，谷氨酰胺合成酶系统和腺苷脱氨酶系统。（2 2）基因载体的导入和基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选高效表达工程细胞株的筛选DNA-DNA-磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法p溶解的溶解的DNADNA加加NaNa2 2HPOHPO4 4和和CaClCaCl2 2 形成磷酸钙沉淀，形成磷
28、酸钙沉淀， DNADNA被包在磷酸钙沉淀中，形成被包在磷酸钙沉淀中，形成DNADNA磷酸钙共沉磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将用而将DNADNA导入。导入。Na2HPO4溶液溶液+溶解的溶解的DNACaCl2溶液溶液逐逐渐渐加加入入磷酸钙沉淀磷酸钙沉淀DNA被包裹被包裹在沉淀中在沉淀中DNA磷酸钙共沉淀物磷酸钙共沉淀物通过细胞吞噬作用将通过细胞吞噬作用将DNADNA导入导入优点：优点：方法简单方法简单可进行共转化可进行共转化廉价廉价电穿孔法电穿孔法电穿孔仪产生高压脉冲电场电穿孔仪产生高压脉冲电场细胞膜出现瞬时可逆性小孔细胞膜出
29、现瞬时可逆性小孔外源外源DNADNA沿着小孔进入细胞沿着小孔进入细胞优点：优点：转染效率高转染效率高缺点：缺点：进入细胞的进入细胞的DNADNA拷贝数较低拷贝数较低最佳条件：最佳条件：电场强度、脉冲形状、电穿孔介质等电场强度、脉冲形状、电穿孔介质等筛选筛选外源基因导入效率很低，必须从大量的细胞中外源基因导入效率很低，必须从大量的细胞中进行筛选进行筛选利用选择标记，采取相应的筛选系统：利用选择标记，采取相应的筛选系统：NeoNeor r: G418: G418tktk+ +：胸腺嘧啶激酶：胸腺嘧啶激酶hgprthgprt+ +：次黄嘌呤：次黄嘌呤营养缺陷型受体细胞营养缺陷型受体细胞第四节、制药工
30、业中常用的动物细胞第四节、制药工业中常用的动物细胞FDAFDA规定：除原代细胞外，其他细胞株或细胞系一规定：除原代细胞外，其他细胞株或细胞系一旦建成后必须旦建成后必须进细胞库保存进细胞库保存工程细胞必须建立工程细胞必须建立原始细胞库原始细胞库(master cell bank, MCB)(master cell bank, MCB) ：单一来源的均单一来源的均质细胞质细胞原始细胞库原始细胞库所有细胞必须建立档案（细胞系历史），进所有细胞必须建立档案（细胞系历史），进行无菌，无交叉污染和各种有害因子（细菌、真菌、支行无菌，无交叉污染和各种有害因子（细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括原体和各种病毒
31、，包括反转录病毒等）的检测反转录病毒等）的检测生产细胞库生产细胞库（manufacturermanufacturers cell bank, s cell bank, MWCB, MWCB, 工作细胞库工作细胞库) )：从：从MCBMCB来的，或从单一安来的，或从单一安瓿来的，或从多个安瓿混合在一起的，经培养瓿来的，或从多个安瓿混合在一起的，经培养扩增达到一定数量后，再分装储存形成的细胞扩增达到一定数量后，再分装储存形成的细胞库库需建立档案需建立档案,确定最高使用代数确定最高使用代数,进行无菌和细胞进行无菌和细胞交叉污染检查交叉污染检查用于重组的常用细胞株：用于重组的常用细胞株：BHK12细胞
32、C127细胞CHO-K1细胞COS细胞MDCK细胞MRC-5细胞Namalwa细胞Sf-9Vero细胞WI-38细胞SP/0-Ag14细胞u来源来源u特性特性u培养条件培养条件u使用情况使用情况WI-38WI-38细胞细胞是美国是美国WistarWistar解剖和生物学研究所解剖和生物学研究所, ,在在19611961年从女年从女性高加索人的正常肺组织中获得的一株性高加索人的正常肺组织中获得的一株二倍体细二倍体细胞系胞系. .该细胞是该细胞是成纤维细胞成纤维细胞, ,能产生胶原能产生胶原培养基用培养基用BME(Eagle basal medium)BME(Eagle basal medium)
33、加加10%10%小牛血小牛血清清,pH,pH控制在控制在7.2.7.2.细胞的倍增时间为细胞的倍增时间为24 h,24 h,有限寿有限寿命命5050代代. .该细胞是该细胞是最早被认为安全的传代细胞最早被认为安全的传代细胞, ,在在2020世纪世纪6060年代被广泛应用于年代被广泛应用于制备疫苗制备疫苗. .Vero细胞细胞19611961年日本年日本ChibaChiba大学大学YasumuraYasumura等人等人 从正常成年从正常成年非洲绿猴肾非洲绿猴肾中分离获得中分离获得贴壁依赖成纤维细胞，核型贴壁依赖成纤维细胞，核型2n=602n=60培养基：培养基：199+5%199+5%胎牛血清
34、胎牛血清支持多种支持多种病毒增殖，并制成疫苗病毒增殖，并制成疫苗：脊髓灰质炎：脊髓灰质炎病毒，狂犬病毒，乙脑病毒疫苗。已被获准用病毒，狂犬病毒，乙脑病毒疫苗。已被获准用于人体。于人体。BHK-21BHK-21细胞细胞19611961年从年从5 5只生长只生长1 1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的. .它是成纤维样细胞它是成纤维样细胞. .过去常用于增殖病毒过去常用于增殖病毒, ,包括多包括多瘤病毒瘤病毒, ,口蹄疫病毒和狂犬病病毒等并制作疫苗口蹄疫病毒和狂犬病病毒等并制作疫苗, ,现在也已被用于工程细胞的构建现在也已被用于工程细胞的构建.用于用于增殖病毒，制备疫苗，增殖病毒
35、，制备疫苗， 表达外源蛋白表达外源蛋白. .是第二常用的细胞是第二常用的细胞CHOCHO细胞细胞- -最为常用的生产载体最为常用的生产载体 CHO-K1CHO-K1：从中国仓鼠卵巢中分离：从中国仓鼠卵巢中分离 的上皮样细胞。的上皮样细胞。核型：核型：2n=202n=202222。 培养基：培养基：DEMEDEME培养基，培养基，0.1M0.1M次黄嘌呤，次黄嘌呤，0.1M0.1M胸苷，胸苷，10%10%小牛血清，培养时需加入脯氨酸。小牛血清，培养时需加入脯氨酸。用于用于分泌表达外源蛋白分泌表达外源蛋白, ,其糖基化最近似人的糖基其糖基化最近似人的糖基化结构，但糖基化产物是不均一的混合物化结构，
36、但糖基化产物是不均一的混合物 当前被广泛用于构建工程细胞的是一株缺乏二氢当前被广泛用于构建工程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株叶酸还原酶的营养缺陷突变株CHO-dhfr CHO-dhfr Sf-9Sf-9细胞细胞19831983年从亲代年从亲代IPLB-SF21AEIPLB-SF21AE中克隆形成。亲代细胞中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒杆状病毒高高度敏感。度敏感。通常用的培养基为通常用的培养基为GraceGrace培养基，添加培养基，添加3.3g/L3.3g/
37、L水解水解乳蛋白和乳蛋白和3.3g/L3.3g/L酵母浸液，酵母浸液，10%10%胎牛血清。胎牛血清。用于用于高效表达外源蛋白制品高效表达外源蛋白制品。NamalwaNamalwa细胞细胞是是19721972年从肯尼亚患有年从肯尼亚患有BurkittBurkitt淋巴瘤的病人体中淋巴瘤的病人体中取得的一株人的类淋巴母细胞取得的一株人的类淋巴母细胞, ,该细胞有该细胞有2.8%2.8%高倍高倍体率体率, ,多数细胞有多数细胞有1212一一1414条标记染色体条标记染色体, ,单条单条X X染色染色体体, ,无无Y Y染色体染色体. .它已被大规模地用于它已被大规模地用于生产干扰素生产干扰素. .
38、SP2/0SP2/0细胞细胞SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从有羊抗红细胞：通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的活性的BALB/cBALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8P3X63Ag8融合杂交瘤融合杂交瘤SP2/NL-AgSP2/NL-Ag亚克隆中分离获得，亚克隆中分离获得，能耐受能耐受8 8氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤20g/ml20g/ml但在含但在含HATHAT选择培养基选择培养基中不能存活。中不能存活。常用培养基为常用培养基为DMEMDMEM，添加，添加10%10%胎牛血清。胎牛血清。用于用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体生产单抗杂交
39、瘤细胞和抗体。第三节第三节 动物细胞的培养动物细胞的培养一、动物细胞的营养要求一、动物细胞的营养要求环境适应力最差，培养时间长，营养要求高环境适应力最差，培养时间长，营养要求高培养特点：培养特点：p（1）碳源为葡萄糖）碳源为葡萄糖p（2）氮源为氨基酸）氮源为氨基酸p（3）添加小牛血清和动物胚胎浸出液）添加小牛血清和动物胚胎浸出液二、动物细胞的培养条件二、动物细胞的培养条件1.1.温度温度p哺乳动物细胞最佳温度：哺乳动物细胞最佳温度：37370.50.5p昆虫细胞最佳温度：昆虫细胞最佳温度：27272.pH2.pHp细胞培养最适细胞培养最适pHpH：7.2-7.47.2-7.4p低于低于6.86
40、.8或高于或高于pH7.6pH7.6细胞退变或死亡细胞退变或死亡p加入缓冲系统：保持培养环境的加入缓冲系统：保持培养环境的pHpH稳定稳定p培养时空气，培养时空气，CO2CO2等进行等进行PHPH调节调节p酚红做指示剂酚红做指示剂3.3.氧氧p5% CO5% CO2 2的混合气体的混合气体4.4.防止污染：十分重要防止污染：十分重要p培养时间长，培养基营养丰富培养时间长，培养基营养丰富p小牛血清的支原体污染小牛血清的支原体污染l解决：解决：p严格灭菌严格灭菌p抗生素：青霉素，链霉素，卡那霉素等抗生素：青霉素，链霉素，卡那霉素等三、动物细胞的培养基三、动物细胞的培养基1.1.平衡盐溶液平衡盐溶液
41、(balance saline solution, BSS)(balance saline solution, BSS)p生理平衡盐溶液，与生理的生理平衡盐溶液，与生理的PHPH，渗透压等一致。，渗透压等一致。p用于洗涤细胞用于洗涤细胞p常用的有常用的有HanksHanks液，液，EarleEarle液，液，HEPESHEPES溶液等溶液等2.2.合成细胞培养基合成细胞培养基(sythetic)(sythetic)19501950年，年，MorgenMorgen第一个合成培养基：第一个合成培养基：199199培养基培养基已经商品化的基本合成培养基有已经商品化的基本合成培养基有199199、ME
42、MMEM、RPIM RPIM 16401640、DMEMDMEM等等优点：成分明确，组分稳定，可大量生产优点：成分明确，组分稳定，可大量生产基本组分基本组分 基本培养基包括四大类物质：基本培养基包括四大类物质：l氨基酸；维生素；碳水化合物；无机盐氨基酸；维生素；碳水化合物；无机盐氨基酸氨基酸l至少含有上述至少含有上述1313种氨基酸种氨基酸Eagle MEMEagle MEM培养基培养基l最多含最多含2121种氨基酸种氨基酸199199培养基培养基l1212种必需氨基酸种必需氨基酸: :缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸丙、蛋、组、酪、精氨酸
43、、胱氨酸(L(L型型) )l谷氨酰胺谷氨酰胺(glutamine)(glutamine)： 缺乏可导致细胞生长不缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在溶液中很不稳定，良甚至死亡。在溶液中很不稳定，44下放置下放置1 1周周可分解可分解50%50%维生素维生素l脂溶性维生素：脂溶性维生素：(A(A、D D、E E、K)K)常从血清中得到补常从血清中得到补充。充。l水溶性维生素：水溶性维生素：包括生物素、叶酸、烟酸、烟酰包括生物素、叶酸、烟酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、胺、泛酸、吡哆醇、 吡哆醛、偏多酸钙、核黄素吡哆醛、偏多酸钙、核黄素(B2) (B2) 、硫胺素、硫胺素(B1) B12(B1) B12、
44、VcVc、胆碱、肌醇和对氨、胆碱、肌醇和对氨基苯甲酸。基苯甲酸。3.3.天然培养基天然培养基(nature medium)(nature medium)动物体液或组织提取成分做培养液动物体液或组织提取成分做培养液血清最为常用血清最为常用 ：牛血清、马血清、兔血清牛血清、马血清、兔血清l胎牛血清：取自剖腹产的胎牛；胎牛血清是品质最高胎牛血清：取自剖腹产的胎牛；胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。体等对细胞有害的成分最少。l新生牛血清：取自出生新生牛血清：取自出生24 h24 h之内的新生牛；之内的
45、新生牛；l小牛血清：取自出生小牛血清：取自出生10-30 d10-30 d的小牛的小牛维持液维持液生长液生长液目前重点开发的目前重点开发的无血清培养基无血清培养基是在基本合成培养基上加入起血清作用的各种激是在基本合成培养基上加入起血清作用的各种激素和多肽生长因子素和多肽生长因子如转铁蛋白，胰岛素，氢化可的松等如转铁蛋白，胰岛素，氢化可的松等动物培养基采用动物培养基采用膜过滤法灭菌膜过滤法灭菌四、动物细胞的基本技术四、动物细胞的基本技术（一）细胞的原代培养（一）细胞的原代培养（1 1）剪碎剪碎：无菌的解剖刀：无菌的解剖刀和剪子把组织切成小片和剪子把组织切成小片（2 2）胰蛋白酶或胶原酶进）胰蛋白
46、酶或胶原酶进行行消化消化酶解：酶解：（3 3）分散的细胞清洗纯化）分散的细胞清洗纯化后，计数和接种，后，计数和接种，37 37 培培养养原代培养材料来自于胚胎及成体的组织和器官原代培养材料来自于胚胎及成体的组织和器官胚胎组织生命力强，细胞间粘连弱，易于消化分胚胎组织生命力强，细胞间粘连弱，易于消化分解，易于培养和繁殖解，易于培养和繁殖成体组织相反成体组织相反肿瘤细胞繁殖力强，可在体外长期培养繁殖，并肿瘤细胞繁殖力强，可在体外长期培养繁殖，并可进行悬浮培养可进行悬浮培养组织快培养法组织快培养法：组织切成小块，培养。在组织块：组织切成小块，培养。在组织块周围长出新的细胞单层。周围长出新的细胞单层。
47、单层细胞培养法单层细胞培养法：组织中的细胞用酶消化成单个：组织中的细胞用酶消化成单个细胞，制成细胞悬液，培养细胞，制成细胞悬液，培养（二）细胞的传代培养（二）细胞的传代培养细胞的细胞的传代传代(subculture)(subculture)：从原培养容器中分离细胞从原培养容器中分离细胞 操作过程（贴壁细胞）：操作过程（贴壁细胞）：1.1.弃使用过的细胞培养基弃使用过的细胞培养基 2.2.清洗：使用清洗：使用PBSPBS平衡盐溶液清洗细胞。平衡盐溶液清洗细胞。3.3.消化：加入消化液消化：加入消化液(trypsin)(trypsin)到长着细胞的一面。到长着细胞的一面。 孵育在孵育在5-15 m
48、in5-15 min，仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。，仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。 4.4.吹打：当细胞变圆、离开培养皿底部时，吹打：当细胞变圆、离开培养皿底部时， 加入培养基，加入培养基，通过移液管在细胞表面反复吹打分散细胞。计数并再次培养通过移液管在细胞表面反复吹打分散细胞。计数并再次培养细胞细胞（三）细胞的克隆培养（三）细胞的克隆培养克隆培养克隆培养(clonal culture)(clonal culture)：即单细胞分离培养，即单细胞分离培养，由单细胞培养成纯细胞系由单细胞培养成纯细胞系一般用一般用饲养细胞饲养细胞如杂交瘤细胞的筛选和培养如杂交瘤细胞的筛选和培养第
49、五节第五节 细胞的大规模培养细胞的大规模培养p在人工条件下在在人工条件下在细胞生物反应器细胞生物反应器（bioreactorbioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。技术。p2020世纪世纪60-7060-70年代，就已创立了可用于大规模培养年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。技术。p是目前生物高科技药物大规模生产的是目前生物高科技药物大规模生产的核心技术核心技术（一）动物细胞的大规模培养方法（一）动物细胞的大规模培养方法l大规模培养三种培
50、养方法大规模培养三种培养方法: :悬浮培养悬浮培养：CHOCHO细胞细胞( (中华仓鼠卵巢中华仓鼠卵巢) )、BHK-21BHK-21细细胞胞( (仓鼠肾仓鼠肾) )，杂交瘤细胞，昆虫细胞等进行悬，杂交瘤细胞，昆虫细胞等进行悬浮培养浮培养贴壁培养贴壁培养：人二倍体细胞、：人二倍体细胞、 传代细胞传代细胞VeroVero细胞细胞( (非洲绿猴肾非洲绿猴肾) )等利用载体进行贴壁培养等利用载体进行贴壁培养固定化培养固定化培养( (贴壁贴壁- -悬浮培养悬浮培养) )1. 1. 悬浮培养悬浮培养是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程，是细是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程，是细菌发酵基础上改进的菌发
51、酵基础上改进的主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等等, ,也适用于兼性贴壁细胞也适用于兼性贴壁细胞气升式，搅拌式反应器气升式，搅拌式反应器生产重组蛋白和单抗生产重组蛋白和单抗. .微载体培养微载体培养60-250 um60-250 um的颗粒，的颗粒，创造大面积供细胞贴附生长创造大面积供细胞贴附生长载体体积小，比重轻，在载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携带细轻度搅拌下即可携带细胞悬浮于培养基胞悬浮于培养基2020世纪世纪8080年代正式用于工业化生产各种疫苗和细年代正式用于工业化生产各种疫苗和细胞产品胞产品商业化微载体商业化微载体 商品名商
52、品名 基质基质 带电基和带电基和 形状形状 直径大小直径大小 比表面积比表面积 密度密度 透明性透明性 交换当量交换当量 meq/g /um /(cm3.g-1) (g.ml-1)Cytodex1 葡聚糖葡聚糖 DEAE1.5 球状球状 131210 6000 1.03 +Superbeads 葡聚糖葡聚糖 DEAE2.0 球状球状 136205 5000 6000 ND +Biocarrier 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 二甲胺丙基二甲胺丙基1.4 球状球状 120180 5000 1.04 +Cytodex2 葡聚糖葡聚糖 三甲基三甲基-2-羟氨基丙基羟氨基丙基 球状球状 114198 5500
53、 1.04 +Cytodex3 葡聚糖葡聚糖 60ug胶原胶原/cm2 球状球状 133215 4500 1.04 +Ventragel 交联明胶交联明胶 明胶明胶 球状球状 150250 ND ND +Celibeads 交联明胶交联明胶 明胶明胶 球状球状 115235 33004300 1.03 1.04 +Biosilon 聚苯乙烯聚苯乙烯 负电荷负电荷 球状球状 160300 225 1.05 ytosperes 聚苯乙烯聚苯乙烯 负电荷负电荷 球状球状 160300 250 1.04 DE-53 纤维素纤维素 DEAE2.0 柱状柱状 4050 ND ND -.多空载体培养法多空载
54、体培养法近年发展的近年发展的大规模高密度大规模高密度的培养方法的培养方法多空载体是一种支撑材料，内部有网状小孔，细多空载体是一种支撑材料，内部有网状小孔，细胞可以在里面生长胞可以在里面生长即可用于悬浮细胞的固定化连续灌流培养，又可即可用于悬浮细胞的固定化连续灌流培养，又可用于细胞的贴壁培养，细胞生长于内部，可免受用于细胞的贴壁培养，细胞生长于内部，可免受搅拌等机械损伤搅拌等机械损伤常用：陶瓷，明胶，纤维素及衍生物，聚苯乙烯常用：陶瓷，明胶，纤维素及衍生物，聚苯乙烯等材料等材料.微囊培养微囊培养从酶的固定化技术发展而来，把从酶的固定化技术发展而来，把细胞包在微囊里悬浮细胞包在微囊里悬浮培养培养细
55、胞由于包裹而受到保护，避免了剪切力的损害细胞由于包裹而受到保护，避免了剪切力的损害可获得较高的细胞密度，一般在可获得较高的细胞密度，一般在10107 7-10-108 8个细胞个细胞/ml/ml以以上上在控制了微囊的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，有在控制了微囊的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，有利于下游产物的纯化利于下游产物的纯化可采用多种生物反应器进行大规模培养可采用多种生物反应器进行大规模培养5.中空纤维培养法中空纤维培养法模拟体内的模拟体内的三维培养状态三维培养状态，细胞接种在中空纤维的外细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟人腔，利用中空纤维模拟人工毛细血管供给营养，使工毛细血管供给
56、营养，使细胞高密度生长细胞高密度生长材料有硅胶，聚砜，聚丙材料有硅胶，聚砜，聚丙烯等，为烯等，为半透膜半透膜培养筒内由数千根中空纤维所组培养筒内由数千根中空纤维所组成，封存在特制的圆筒里。圆筒成，封存在特制的圆筒里。圆筒内形成内形成2 2个空间：每根纤维的管内个空间：每根纤维的管内为为“内室内室”，灌流无血清培养液，灌流无血清培养液供细胞生长供细胞生长,管与管之间的间隙为管与管之间的间隙为“外室外室”。接种的细胞贴附接种的细胞贴附“外室外室” 管壁上，管壁上，并吸取从并吸取从“内室内室”渗透出来的养渗透出来的养分生长繁殖。分生长繁殖。培养液中的血清也输入到培养液中的血清也输入到外室外室，由于血
57、清和细胞分泌产物如单，由于血清和细胞分泌产物如单抗的分子质量大而无法穿透到抗的分子质量大而无法穿透到内内室室去，只能留在去，只能留在外室外室并且不断并且不断被浓缩。被浓缩。 当需要收集这些产物时，只要把管当需要收集这些产物时，只要把管与管之间的与管之间的“外室外室”总出口打开，总出口打开，产物就能流出来。细胞生长繁殖过产物就能流出来。细胞生长繁殖过程中的代谢废物，因为都属小分子程中的代谢废物，因为都属小分子物质，可以从管壁渗进物质，可以从管壁渗进“内室内室”,最后从最后从“内室内室”总出口排出总出口排出,不会不会对对“外室外室”细胞产生毒害作用。细胞产生毒害作用。一般细胞在接种一般细胞在接种1
58、3周后，就可以周后，就可以完全充满管壁的空隙。细胞厚度最完全充满管壁的空隙。细胞厚度最终可达终可达10层之多。细胞停止增殖后，层之多。细胞停止增殖后，仍可以维持其高水平代谢和分泌功仍可以维持其高水平代谢和分泌功能，长达几个星期甚至几个月能，长达几个星期甚至几个月。 （二）动物细胞生物反应器（二）动物细胞生物反应器实验室规模：小于实验室规模：小于20L20L的反应的反应器，培养工艺研究器，培养工艺研究中试规模：中试规模：20-100L20-100L的反应器，的反应器，提供一定量的产品，共纯化、提供一定量的产品，共纯化、临床前的各种检测和临床观察，临床前的各种检测和临床观察，工艺优化实验等的需要工
59、艺优化实验等的需要生产规模：大于生产规模：大于100L100L，用于生，用于生产，提供产品产，提供产品84搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器最经典最经典、最早用于动物、最早用于动物细胞培养的反应器细胞培养的反应器通气好，搅拌剪切力小，通气好，搅拌剪切力小，有利于长时间，高密度有利于长时间，高密度培养培养主要主要用于悬浮细胞用于悬浮细胞的培的培养、微载体培养、微囊养、微载体培养、微囊和巨载体培养以及结团和巨载体培养以及结团培养培养最早于最早于19841984年由英国科学家年由英国科学家SpierSpier发明。发明。该装置的主要特点是可以避免在向培养基中通气该装置的主要特点是可以避免在向培养基中通
60、气时气泡直接损伤细胞。时气泡直接损伤细胞。同时在采用微载体系统培养时，微载体不会被由同时在采用微载体系统培养时，微载体不会被由于通气所产生的泡沫滞留在气液界面中。于通气所产生的泡沫滞留在气液界面中。NBSNBS则在该研究成果的基础上做了进一步的改进，则在该研究成果的基础上做了进一步的改进，并于并于19871987年前后将其作为商品推向国际市场年前后将其作为商品推向国际市场笼式通气搅拌器的改进笼式通气搅拌器的改进- NBS- NBS装置装置作为对最初设计的笼式通气搅拌器的改进，作为对最初设计的笼式通气搅拌器的改进，NBSNBS装装置中分别包括笼式的通气腔和消泡腔。置中分别包括笼式的通气腔和消泡腔
61、。气液交换在由气液交换在由200200目不锈钢丝网制成的通气腔内实目不锈钢丝网制成的通气腔内实现；而在鼓泡通气过程中所产生的泡沫经管道进现；而在鼓泡通气过程中所产生的泡沫经管道进入液面上部的由入液面上部的由200200目不锈钢丝网制成的笼式消泡目不锈钢丝网制成的笼式消泡腔内，泡沫经钢丝网破碎分成气、液两部分，达腔内，泡沫经钢丝网破碎分成气、液两部分，达到深层通气而不产生泡沫的目的。到深层通气而不产生泡沫的目的。气升式生物反应器气升式生物反应器没有搅拌，气体通过喷没有搅拌，气体通过喷管进入管进入剪切力更小剪切力更小主要用于悬浮细胞的分主要用于悬浮细胞的分批式培养，近年开发用批式培养，近年开发用于
62、贴壁细胞的微载体培于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连养，并进行半连续、连续和灌流式培养续和灌流式培养l气升式细胞培养反应器气升式细胞培养反应器不仅在植物细胞培养中不仅在植物细胞培养中应用广泛应用广泛, ,而且在动物而且在动物细胞培养中也取得了很细胞培养中也取得了很大的成功。大的成功。和搅拌式生物反应器相比，气升式反应器中产生的湍动温和而和搅拌式生物反应器相比，气升式反应器中产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；同时反应器内无机械运动部件，因而细均匀，剪切力相当小；同时反应器内无机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；反应器通过直接喷射空气供氧，氧传递速率胞损伤率比较低；反应器通过直接喷射空气供
63、氧，氧传递速率高；反应器内液体循环量大，细胞和营养成分能均匀分布于培高；反应器内液体循环量大，细胞和营养成分能均匀分布于培养基中。养基中。 中空纤维式生物反应器中空纤维式生物反应器由数百千根中空纤维束组成由数百千根中空纤维束组成既可培养悬浮生长的细胞既可培养悬浮生长的细胞, ,又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密度高达度高达10109 9/mL/mL数量级数量级如果能控制系统不受污染，则能长期运转，具有很高的工业如果能控制系统不受污染，则能长期运转，具有很高的工业应用价值。应用价值。透析袋或膜式生物反应器透析袋或膜式生物反应器培养分为两室或三室，培培养分为两室或三室，培
64、养基与细胞养基与细胞用滤膜用滤膜分开分开既可用于贴壁细胞培养也既可用于贴壁细胞培养也可培养悬浮细胞可培养悬浮细胞优点：可使细胞达到很高优点：可使细胞达到很高密度；可随意组合进行操作，密度；可随意组合进行操作，达到保留和浓缩产品或及时达到保留和浓缩产品或及时分离提纯产品的目的分离提纯产品的目的固定床或流化床式生物反应器固定床或流化床式生物反应器反应器内装不锈钢、玻反应器内装不锈钢、玻璃珠、玻璃环、光面陶瓷、璃珠、玻璃环、光面陶瓷、塑料或有孔的陶瓷、玻璃、塑料或有孔的陶瓷、玻璃、聚氨酯塑料等载体聚氨酯塑料等载体VeraxVerax公司推出的公司推出的CF-CF-IMMOIMMO培养系统（右图）培养
65、系统（右图）专用于比重较大的多孔专用于比重较大的多孔微球的培养微球的培养CellGen plusCellGen plus生物反应器生物反应器NBSNBS公司开发出公司开发出CellGen CellGen plusplus生物反应器，将通气生物反应器，将通气搅拌与搅拌与固定床巧妙结合的固定床巧妙结合的一种新型生物反应器一种新型生物反应器有很大的比表面积和空体有很大的比表面积和空体积积既可用于贴壁细胞的附着，既可用于贴壁细胞的附着，又有利于悬浮细胞在纤维又有利于悬浮细胞在纤维间被固定间被固定6.一次性摇袋细胞培养反应器一次性摇袋细胞培养反应器l通气方式改变lP64l500L三、动物细胞大规模培养的
66、操作方式三、动物细胞大规模培养的操作方式分批操作分批操作(batch)(batch)补料补料- -分批操作分批操作(fed-batch) (fed-batch) ：普遍应用于细菌生：普遍应用于细菌生产，动物细胞培养中较少用。产，动物细胞培养中较少用。半连续式操作半连续式操作(semi-continuous)(semi-continuous)连续式操作连续式操作(continuous) (continuous) ：除个别情况下用于悬：除个别情况下用于悬浮细胞的培养生产外，一般用灌流培养来代替。浮细胞的培养生产外，一般用灌流培养来代替。灌流式操作灌流式操作(perfusion)(perfusion
67、)国内外动物细胞生物反应器现状国内外动物细胞生物反应器现状国外占国外占主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，为提高细胞的产率，可采用流加或灌注培养及微载为提高细胞的产率，可采用流加或灌注培养及微载体培养等相关技术体培养等相关技术GenentechGenentech公司使用公司使用CHOCHO细胞以细胞以12,000L12,000L搅拌式生物搅拌式生物反应器培养槽生产反应器培养槽生产t-PAt-PA重组蛋白以及治疗癌症的生重组蛋白以及治疗癌症的生物药物。物药物。GibcoGibco公司建立的流加悬浮培养公司建立的流加悬浮培养CHOCHO表达表达GalGal系统
68、，系统，采用化学修饰的无蛋白采用化学修饰的无蛋白CHOCHO细胞培养基并增加细胞培养基并增加TCATCA循循环，生物反应器中活细胞密度最高可达环，生物反应器中活细胞密度最高可达10107 7/ml/ml。四军大采用四军大采用5L CelliGen5L CelliGen反应器连续灌注培养杂交瘤反应器连续灌注培养杂交瘤细胞，培养第细胞，培养第9 9天细胞密度达到天细胞密度达到8 810106 6/ml/ml以上以上目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报道道同时我国有关同时我国有关商品化大规模动物细胞反应器产品还商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空
69、白处于空白，有待于进一步改进现有生物反应器，设，有待于进一步改进现有生物反应器，设计或设计新型的生物反应器。计或设计新型的生物反应器。目前，目前，百泰药业百泰药业的哺乳动物细胞培养生产线，是目的哺乳动物细胞培养生产线，是目前中国规模最大、设施最完备、技术最先进的大规前中国规模最大、设施最完备、技术最先进的大规模细胞培养技术平台模细胞培养技术平台(08(08年开始有产品，年开始有产品，灌流规模灌流规模1000L L（实际（实际750L750L），），正在建正在建2500L，预期建成后，预期建成后年生产能力将达到年生产能力将达到40公斤公斤 。目前年产8公斤公斤 )VeroVero细胞和狂犬病毒的
70、培养工艺细胞和狂犬病毒的培养工艺DMEM培养基培养基胎牛血清胎牛血清其他成分其他成分锥形瓶逐级锥形瓶逐级放大培养放大培养加碱（碳酸加碱（碳酸氢钠）氢钠）加糖（葡萄加糖（葡萄糖）糖）灌注培养液灌注培养液微载体微载体5L种子罐培种子罐培养养培养液培养液50L生生物物反反应应器器接种狂犬接种狂犬病毒病毒出液口出液口收获病毒收获病毒国内外生产现状国内外生产现状上个世纪上个世纪8080年代，培养细胞密度最大达到年代，培养细胞密度最大达到2 210106 6/ml/ml，生产期，生产期7 7天，特异产物量为天，特异产物量为50mg/L50mg/L。20042004年，细胞密度最大可达到年，细胞密度最大可达
71、到101010106 6/ml/ml，有效，有效表达时间达到表达时间达到3 3周，表达量接近周，表达量接近5 g/L5 g/L，是，是19801980的的100100倍倍现在世界上最大的细胞发酵罐达到现在世界上最大的细胞发酵罐达到2 2万升。哺乳动万升。哺乳动物细胞生产体系还需要解决的其他问题包括无血物细胞生产体系还需要解决的其他问题包括无血清培养基、延迟细胞凋亡和糖基化改进等清培养基、延迟细胞凋亡和糖基化改进等 生产能力不足生产能力不足已经成为细胞表达的重组药物发展的瓶已经成为细胞表达的重组药物发展的瓶颈。以颈。以EnbrelEnbrel为例，在为例，在19981998年上市年上市6 6个月
72、内仅美国销个月内仅美国销售就超过对全球整年需求的预计，生产规模缺口很大。售就超过对全球整年需求的预计，生产规模缺口很大。又如，又如，HIVHIV蛋白微球（蛋白微球（microbicidesmicrobicides）在局部使用可）在局部使用可以防止以防止HIVHIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产量不够生产量不够。还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家也难以使用，估计有家也难以使用，估计有80%80%的血友病患者无药可用，的血友病患者无药可用，主要是生产能力不足。主要是生产能力不足。生产能力不足也
73、导致其价格不菲生产能力不足也导致其价格不菲。 我国动物细胞工程制药的目标我国动物细胞工程制药的目标(1)(1)建立动物细胞建立动物细胞大规模培养的技术平台大规模培养的技术平台。该平台是。该平台是基因工程药物、单克隆抗体及疫苗等产品的关键，基因工程药物、单克隆抗体及疫苗等产品的关键，由以下几个要素构成：由以下几个要素构成：1)1)高效的真核细胞表达系统高效的真核细胞表达系统。 CHOCHO表达的外源蛋白最接近表达的外源蛋白最接近天然构象，是最为想的表达系统，但存在表达量低、大规天然构象，是最为想的表达系统，但存在表达量低、大规模培养困难、生产成本高昂等问题。对细胞本身的生理特模培养困难、生产成本
74、高昂等问题。对细胞本身的生理特征进行改造，除了要求目的蛋白的表达量高外，必须适应征进行改造，除了要求目的蛋白的表达量高外，必须适应无血清培养基培养，具有即抗细胞衰老凋亡能力；无血清培养基培养，具有即抗细胞衰老凋亡能力；2)2)性能优越的、个性化的细胞培养基，包括低血清培养基、性能优越的、个性化的细胞培养基，包括低血清培养基、无血清培养基无血清培养基；3)3)先进的先进的生物反应器设备；生物反应器设备；(2)(2)减少污染风险减少污染风险、提高产品质量和安全性；、提高产品质量和安全性；(3)(3)实行实行“动物药厂动物药厂”计划，尽快实现转基因动物计划，尽快实现转基因动物乳腺生物反应器的产业化；乳腺生物反应器的产业化；(4)(4)发展下游工程发展下游工程，主要是转基因表达产物及产品，主要是转基因表达产物及产品的分离纯化，在提高产品的纯度和产量同时，降的分离纯化，在提高产品的纯度和产量同时，降低成本。低成本。总之，我国动物细胞工程制药目前仍处于起步阶总之，我国动物细胞工程制药目前仍处于起步阶段，还有很大差距，虽然目前可生产多种有重要段，还有很大差距，虽然目前可生产多种有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，但大部分还处于实验和临床阶段。单克隆抗体等，但大部分还处于实验和临床阶段。
