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1、第二章第二章 分子克隆工具酶分子克隆工具酶 本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶第二节第二节 甲基化酶甲基化酶第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶第四节第四节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶 在过去20多年里，生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为DNA物理图的特殊标记，利用限制性内切酶可产生特定大小的DNA片段并使纯化这些DNA片段成为可能，获得的限制性DN
2、A片段可作为DNA操作中的基本介质。对DNA进行修饰的工具的出现，为重组DNA的实现创造了条件。第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶一、限制与修饰一、限制与修饰1、限制与修饰现象：、限制与修饰现象：限制限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶限制性内切酶（restriction ednonuclease）的作用，破坏入侵的噬菌体的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主范围受到限制。，导致噬菌体的寄主范围受到限制。 限制作用实际就是限制性内切酶限制作用实际就是限制性内切酶降解外源降解外源DNA，维护宿主遗，维护宿主遗传稳定的保护机制。
3、传稳定的保护机制。修饰修饰(modification)：指寄主本身的指寄主本身的DNA，由于在合成后通过，由于在合成后通过甲基化酶（甲基化酶（methylase）的作用得以甲基化，使的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。从而免遭自身限制性酶的破坏。 修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外识别自身遗传物质和外来遗传物质来遗传物质的目的。的目的。甲基化作用：最主要的碱基修饰，使腺嘌呤甲基化作用：最主要的碱基修饰，使腺嘌呤A成为成为N6-甲基腺嘌呤，甲基腺嘌呤，胞嘧啶成为胞嘧啶成为5-甲基胞嘧啶。甲基胞嘧啶。2.2
4、.限制酶的发现限制酶的发现起始于起始于2020世纪世纪6060年代对细菌的研究。年代对细菌的研究。至至2006年年2月，共发现月，共发现3773种限制性内切酶，种限制性内切酶，I、II、III型各有型各有68、3692、10种，甲基化指导的种，甲基化指导的3种，商品化的种，商品化的609种，种，II型型中共有中共有223种特异性。种特异性。限制酶是一类能够识别双链限制酶是一类能够识别双链DNADNA分子中的某种特定核苷酸序列，分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割并由此切割DNADNA双链结构的核酸水解酶。双链结构的核酸水解酶。 限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中没有限制酶。碱
5、基对（base pair, bp）限制性核酸内切酶的命名原则限制性核酸内切酶的命名原则19731973年年H.O. SmithH.O. Smith和和D. NathamsD. Nathams首次提出命名原首次提出命名原则，则，19801980年年RobertsRoberts在此基础上进行了系统分类在此基础上进行了系统分类限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名表该酶的宿主菌属名(genus); 第二、三个字母第二、三个字母(小小写，斜体写，斜体)代表宿主菌种名代表宿主菌种名(species)。第四个字母代表宿主菌的株或型第四个字母代
6、表宿主菌的株或型(strain)，正体，正体。若若从从一一种种菌菌株株中中发发现现了了几几种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶，即即根根据据发发现现和和分分离离的的先先后后顺顺序序用用罗罗马马字字母母表表示示，正体写在第正体写在第4个字母之后，字母间无间隔个字母之后，字母间无间隔。例：例：EcoEcoR R、Hind、Sal限制性核酸内切酶的命名原则：限制性核酸内切酶的命名原则：属名属名 种名种名 株名株名Haemophilus influenzae strain d 流感嗜血杆流感嗜血杆菌菌d株株 Hind Hind同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核
7、酸内切酶3.3.限制性核酸内切酶的种类限制性核酸内切酶的种类据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为修饰酶活性，可分为、型三大类。型三大类。型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链上产生切口，上产生切口，ss型识别序列和切割位置特殊。型识别序列和切割位置特殊。主要特性主要特性型型型型型型酶酶分子分子识别位点位点切割位点切割位点限制与甲基限制与甲基化化辅因子因子多寡，用途多寡，用途内切内切酶酶与甲基化与甲基化酶酶不不在一起在一起4-6bp，多，多为回文序列
8、回文序列识别序列内或附近特序列内或附近特异切割异切割分开的反分开的反应Mg2+种种类多，用途大多，用途大三三亚基双功能基双功能酶酶二分非二分非对称称无特异性，距无特异性，距识别序序列列1kb处外外互斥互斥ATP Mg2+ SAM种种类少，用途小少，用途小二二亚基双功能基双功能酶酶5-7bp非非对称称距距识别序列下游序列下游24- 26bp处同同时竞争争ATP Mg2+种种类少，用途小少，用途小2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程8二、限制酶识别的序列二、限制酶识别的序列1、限制酶识别序列的长度、限制酶识别序列的长度(n)：一般为：一般为4-8个碱基对，最常见个碱基对，最常见为为6b
9、p。识别位点出现频率：识别位点出现频率：4n2、限制酶识别序列的结构、限制酶识别序列的结构：多数为：多数为回文结构回文结构（palindrome）即镜像对称结构。即镜像对称结构。一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的，一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的，还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之间可以还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之间可以间隔一定长度的任意碱基。间隔一定长度的任意碱基。3、限制酶的切割位置、限制酶的切割位置：多数在识别序列内部，也有在外部、：多数在识别序列内部，也有在外部、两端、两侧或单侧的。两端、两侧或单侧的。三、三、限制酶的功能和产生的
10、末端类型限制酶的功能和产生的末端类型限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解内切方式水解DNADNA链中的磷酸二酯键，产生的链中的磷酸二酯键，产生的DNADNA片段片段5 5端端为为P P，33端为端为OHOH，识别序列一般为，识别序列一般为4 46 6个碱基对，通常是个碱基对，通常是反向重复顺序，具有反向重复顺序，具有180180的旋转对称性，即的旋转对称性，即回文结构回文结构。限制性核酸内切酶切割双链限制性核酸内切酶切割双链DNADNA产生产生3 3种不同的末端类型种不同的末端类型。 1 1、对称型突出末端：回文结构决定对
11、称，分为、对称型突出末端：回文结构决定对称，分为5 5突出和突出和3 3突出的粘性末端（突出的粘性末端（cohesive/sticky endcohesive/sticky end）两种。）两种。2 2、平末端（、平末端（blunt endblunt end）：任何平末端酶的酶切产物可以互）：任何平末端酶的酶切产物可以互连，但连接效率比粘性末端低连，但连接效率比粘性末端低100100倍左右。倍左右。3 3、非对称的突出末端：、非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、简并的或因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对称的。即使是存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对
12、称的。即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性。单酶切限制片段在连接时也具有方向性。4 4、同裂酶（、同裂酶（isoschizomerisoschizomer）：）：不同的酶识别序列相同，切割位不同的酶识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、同序异切酶、点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、同序异切酶、同功多位酶和其它类型。同功多位酶和其它类型。 例：例：SmaSma(CCCGGG)(CCCGGG)和和XmaXma(CCCGGG)(CCCGGG)5 5、同尾酶（、同尾酶（isocaudarnerisocaudarner）：）：不同限制酶识别序列可以相同，不同限制酶识别序列
13、可以相同，也可以不同，但它们产生的末端是一样的，末端间可以相互也可以不同，但它们产生的末端是一样的，末端间可以相互连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。 例：例：XhoXho(C(CTCGATCGAG)G)与与SalSal(G(GTCGATCGAC)C)、 BamBamHI(GHI(GGATCGATCC)C)和和BglBgl(A(AGATCGATCT)T)6 6、归位内切酶（、归位内切酶（homing endonucleasehoming endonuclease）：一些线粒体、叶绿）：一些线粒体、叶绿体、核体、核DNADNA和和T
14、 T偶数噬菌体的内含子编码内切酶（称为偶数噬菌体的内含子编码内切酶（称为I-I-prefixprefix）或内含肽（）或内含肽（inteinintein）具有内切酶活性（称为）具有内切酶活性（称为PI-PI-prefixprefix）。它们识别序列很长，核心识别序列一般为）。它们识别序列很长，核心识别序列一般为10-10-12bp12bp，识别位点极少。，识别位点极少。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程14四、四、DNADNA末端长度对限制酶切割效率的影响末端长度对限制酶切割效率的影响限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序列两侧具限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序
15、列两侧具有一定长度的有一定长度的DNADNA，否则会降低切割效率。，否则会降低切割效率。对侧翼长度敏感性较低的酶有对侧翼长度敏感性较低的酶有EcoEcoRR等，只要一个侧翼碱基等，只要一个侧翼碱基即保证即保证90%90%的效率。的效率。 对侧翼长度敏感性高的酶有对侧翼长度敏感性高的酶有AccAcc、HinHindd、PstPst等，侧翼等，侧翼3 3个碱基以上也未必理想。个碱基以上也未必理想。设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载体构建设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载体构建时多克隆位点中的相临位置的酶的切割序列的选择也很重时多克隆位点中的相临位置的酶的切割序列的选择也很重
16、要。要。限制酶的活性单位（限制酶的活性单位（unitunit）：）：1 1个单位的酶是指在建议的缓冲个单位的酶是指在建议的缓冲液及温度下，在液及温度下，在2020l反反应液中反液中反应1h，使，使1g DNA（多用（多用）完全消化所需要的）完全消化所需要的酶酶的量。的量。五、位点偏爱五、位点偏爱某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的切割效率不某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的切割效率不同，表现出偏爱性，这种现象称作同，表现出偏爱性，这种现象称作位点偏爱位点偏爱。某些噬菌体某些噬菌体DNADNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同。中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同。噬菌体
17、噬菌体DNADNA为为48502bp48502bp，两端为，两端为12bp12bp粘性末端。粘性末端。EcoEcoRR酶切酶切割割噬菌体中的噬菌体中的5 5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快比分子中间的位点切割快1010倍；倍；EcoEcoRR对腺病毒对腺病毒2DNA2DNA不同位不同位置切点的切割速率也不同。置切点的切割速率也不同。由于位点偏爱性，由于位点偏爱性， DNA DNA用用HinHindd消化而制备的消化而制备的 HinHind d DNA markerDNA marker中中4.3kb4.3kb条带甚至比条带甚至比2.0
18、kb2.0kb条带还弱。条带还弱。原因：切割时需要同时与原因：切割时需要同时与2 2个识别位点作用（如个识别位点作用（如NarNar等），或等），或识别和切割时要求在识别和切割时要求在DNADNA上有上有2 2个明显不同的结合位点，其中个明显不同的结合位点，其中1 1个是另个是另1 1个的被切割时起激活作用的变构位点。个的被切割时起激活作用的变构位点。应对办法：超量用酶、延长切割时间。应对办法：超量用酶、延长切割时间。六、限制酶的酶切反应条件六、限制酶的酶切反应条件1、缓冲液（多数商家提供、缓冲液（多数商家提供10贮藏液藏液）多数多数II型限酶需要相似的缓冲液，但盐离子强度差异明显：型限酶需要
19、相似的缓冲液，但盐离子强度差异明显： Tris-HCl 50 mmol/L pH7.5 MgCl2 10 mmol/L NaCl 0-100 mmol/L（0、50、100分别为低、中、高）分别为低、中、高） DTT 1 mmol/L 一些限制酶还需要一些限制酶还需要添加添加BSA（牛血清白蛋白）。（牛血清白蛋白）。 一些公司开发了一些公司开发了通用缓冲液通用缓冲液，适用于多数不同的限制酶在同，适用于多数不同的限制酶在同一体系中进行双酶切或多酶切，如一体系中进行双酶切或多酶切，如MBI Fermentas的的Tango buffer、Pharmacia的的One-Phor-All buffer
20、 plus (OPA+体系体系) ，NEB (New England Biolabs)的的U buffer为特殊为特殊buffer。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程172、体积和温度体积和温度：反应体系一般用：反应体系一般用20-100 L，视情况可大可小。，视情况可大可小。多数限制酶的最佳反应温度为多数限制酶的最佳反应温度为37，一部限制酶在，一部限制酶在50-65时时最高效，少数在最高效，少数在25-30时最理想。时最理想。3、反应时间反应时间：较纯的：较纯的DNA（如试剂盒提取）在标准酶用量下（如试剂盒提取）在标准酶用量下反应反应1-4 h后可以达到完全，低的后可以达到完
21、全，低的DNA纯度会降低酶切效率，纯度会降低酶切效率，增加酶的用量可缩短酶时间（但会增加星活力风险），延长增加酶的用量可缩短酶时间（但会增加星活力风险），延长反应时间可以减少酶的用量，进行部分酶切时要大大缩短反反应时间可以减少酶的用量，进行部分酶切时要大大缩短反应时间并减少酶的用量，真核生物尤其是植物基因组总应时间并减少酶的用量，真核生物尤其是植物基因组总DNA完全消化（如完全消化（如Southern）时一般要消化）时一般要消化24 h左右。左右。4、终止酶切反应的方法终止酶切反应的方法：添加：添加EDTA、加热法、纯化法。、加热法、纯化法。七、限制酶的星活性七、限制酶的星活性(star ac
22、tivity)(star activity)在在极极端端非非标标准准反反应应条条件件下下，限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶能能切切割割与与特特异异识识别别序序列列不不同同但但相相似似的的序序列列，降降低低酶酶切切反反应应的的特特异异性性，这这种种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性星活性。产生原因：产生原因： 反应体系中甘油的浓度大于反应体系中甘油的浓度大于5%。 酶用量过大，大于酶用量过大，大于100 U/g DNA。 低离子强度，小于低离子强度，小于25 mmol/L。 高高pH，大于，大于8.0。 含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等含有机剂如
23、乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非等非Mg2+的二价离子的存在的二价离子的存在。易发生星活性的内切酶有：易发生星活性的内切酶有：EcoEcoRIRI、HinHindd、KpnKpnI I、PstPstI I、SalSalI I、HinHinfIfI等。等。 办法：对因改进。办法：对因改进。八、单链八、单链DNADNA的切割的切割多数限制酶很难切割单多数限制酶很难切割单DNADNA模板。模板。部部分分限限制制酶酶除除切切割割双双链链DNADNA外外，还还可可切切割割单单DNADNA，但但活活性性一一般般都不高。都不高。切口酶虽然识别双链，但只在单链上切
24、口，名称前要加一个切口酶虽然识别双链，但只在单链上切口，名称前要加一个N N。九、酶切位点的引入九、酶切位点的引入现现代代基基因因工工程程中中通通过过引引物物化化学学合合成成等等方方式式可可以以很很方方便便进进向向目目标标位置引入设计的酶切位点。位置引入设计的酶切位点。通通过过不不同同酶酶切切末末端端的的连连接接重重组组也也可可产产生生新新的的酶酶切切位位点点，对对具具体体情况的分析在设计中有价值：情况的分析在设计中有价值： 5 5突出末端补平后重连；突出末端补平后重连； 同尾末端连接；同尾末端连接； 平末端连接。平末端连接。十、影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度样品的纯度 DNA
25、样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性。等都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性：可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，加大酶的用量，1g DNA用用10U酶酶加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程21DNA样品的甲基化程度样品的甲基化程度大肠杆菌中的大肠杆菌中的damdam甲基化酶在甲基化酶在5 5GATC3GATC3序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6N6位引入甲基，受其影响的酶有位引入甲基，受其影响的酶有BclBclI I、MbolMbol等
26、，但等，但BamBamHIHI、BglBglIIII、SauSau3AI3AI不受影响。不受影响。大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcmdcm甲基化酶在甲基化酶在5 5CCAGG3CCAGG3或或5 5CCTGG3CCTGG3序序列中的胞嘧啶列中的胞嘧啶C5C5位上引入甲基，受其影响的酶有位上引入甲基，受其影响的酶有EcoEcoRIIRII等，等，但但BglBglI I、KpnKpnI I不受影响。不受影响。采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止，可防止DNA的甲基化。的甲基化。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程22十一、基因组中酶切位
27、点分布的不均一性在基因组中酶切位点的分布并不是均一的。在基因组中酶切位点的分布并不是均一的。大肠杆菌中六碱基识别的酶大肠杆菌中六碱基识别的酶Spe平均平均60kb才出现才出现1次。次。酵母中重复序列以外富含酵母中重复序列以外富含GC的识别序列较少。的识别序列较少。哺乳动物基因组中哺乳动物基因组中CGCG序列只有随机概率值的序列只有随机概率值的1/51/5，且多数发，且多数发生胞嘧啶甲基化，生胞嘧啶甲基化，SmaSma位平均约位平均约65kb65kb才出现才出现1 1次。次。果蝇和线虫中果蝇和线虫中CG基序虽然少，但不发生甲基化。基序虽然少，但不发生甲基化。2024/7/31西南大学生物技术专业
28、 基因工程23限制性核酸内切酶操作的注意事项限制性核酸内切酶操作的注意事项商商品品化化的的限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶均均为为浓浓缩缩液液，每每次次操操作作时时应应使使用用新新的的吸吸头头去去取取酶酶，加加入入酶酶的的体体积积应应不不超超过过总总体体积积的的10%，否则酶液中的甘油浓度超过，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性时将会抑制酶的活性。整整个个操操作作应应在在0进进行行，即即在在冰冰浴浴中中进进行行，而而且且是是在在加加入入其其它试剂之后，最后加入酶它试剂之后，最后加入酶。当当切切割割大大量量DNA时时，通通常常采采用用延延长长反反应应时时间间，减减少少酶酶的的用用量量
29、。当当DNA需需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应下一个酶切反应。正确保存、分装和取用限制酶，抽提高质量的正确保存、分装和取用限制酶，抽提高质量的DNA。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程24限制性核酸内切酶的主要用途限制性核酸内切酶的主要用途在特异位点上切割在特异位点上切割DNADNA，产生特异的限制性酶片段。，产生特异的限制性酶片段。建立建立DNADNA分子的限制酶图谱。分子的限制酶图谱。构建基因文库构建基因文库。
30、用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。改建质粒。改建质粒。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程25第二节第二节 甲基化酶甲基化酶一、甲基化酶的种类一、甲基化酶的种类原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（methylase），又），又称甲基转移酶（称甲基转移酶（methyltransferase），大肠杆菌中有），大肠杆菌中有3种。种。1、Dam甲基化酶甲基化酶可在可在GATC序列中的腺嘌呤的序列中的腺嘌呤的N6位置上引入甲基。一般哺乳动物位置上引入甲基。一般哺乳动物DNA不会发生腺嘌呤的不会发生腺嘌呤的
31、N6甲基化。甲基化。一些酶对一些酶对Dam甲基化敏感甲基化敏感，如，如Bcl、Cla、Xba等。等。一些酶一些酶对对Dam甲基化不敏感甲基化不敏感，如，如BamH、SaU3A、Bgl、PvuPvu等。等。2、Dcm甲基化酶甲基化酶识别识别CCAGG或或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶序列，在第二个胞嘧啶C的的C5位置引入甲位置引入甲基。基。一些酶对一些酶对Dcm甲基化敏感甲基化敏感，如，如Acc65、Apa、Eae等。等。一些酶一些酶对对Dcm甲基化不敏感甲基化不敏感，如，如Ban、Bgl、Kpn等。等。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程263、EcoK甲基化酶甲基化酶研究较少。研
32、究较少。4、Sss甲基化酶甲基化酶来自螺旋体，可使来自螺旋体，可使CG序列中的序列中的C在在C5位置上发生甲基化位置上发生甲基化敏感的酶有：敏感的酶有：Cla、Xho、Sal等。等。不敏感的酶有：不敏感的酶有：BamH、EcoR、Sph、KpnKpn等等二、依赖于甲基化的限制系统二、依赖于甲基化的限制系统大肠杆菌中至少有大肠杆菌中至少有3种依赖于甲基化的限制系统：种依赖于甲基化的限制系统： McrA、McrBC、Mrr。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程27三、甲基化对限制酶切的影响三、甲基化对限制酶切的影响1、修饰酶切位点、修饰酶切位点：敏感的酶不能切开。：敏感的酶不能切开。2
33、、产生新的酶切位点、产生新的酶切位点：为依赖于甲基化的限制酶创造切点。：为依赖于甲基化的限制酶创造切点。3、对基因组作图的影响、对基因组作图的影响：哺乳动物具有较多的：哺乳动物具有较多的m5CG序列具序列具有组织细胞特异性，而且一个细胞内的有组织细胞特异性，而且一个细胞内的m5CG甲基化不彻甲基化不彻底，所以用底，所以用m5CG甲基化敏感的限制酶作图时具有可变性，甲基化敏感的限制酶作图时具有可变性，对图的稳定性带来影响。对图的稳定性带来影响。植物的基因组植物的基因组DNA的甲基化程度高，作图时也要求选用对的甲基化程度高，作图时也要求选用对m5CG甲基化不敏感的限制酶。甲基化不敏感的限制酶。第三
34、节第三节 DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶（聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）的主要活性是催化）的主要活性是催化DNADNA的合成的合成（在具备模板、引物、（在具备模板、引物、dNTPsdNTPs等情况下）及其相辅的活性。等情况下）及其相辅的活性。真核生物有真核生物有4 4种种DNADNA聚合酶：聚合酶：、线粒体型。、线粒体型。原核生物有原核生物有3 3种种DNADNA聚合酶：聚合酶：、型。型。一、大肠杆菌一、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I（DNA polymerase I）基本用途二、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragmen
35、t)（1）Klenow酶的基本性质：酶的基本性质：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I经枯草杆菌蛋白酶处理经枯草杆菌蛋白酶处理, ,获得获得N N端三分之端三分之二的大肽段二的大肽段, ,即即KlenowKlenow酶。酶。KlenowKlenow酶仍拥有酶仍拥有5353的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3535的核的核酸外切酶活性，但酸外切酶活性，但失去了失去了5 35 3核酸外切酶活性核酸外切酶活性。（2）Klenow酶的基本用途（可被酶的基本用途（可被T4 DNA聚合酶代替）：聚合酶代替）：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的3粘性凹陷末端粘性凹陷末端抹平抹平DN
36、A的的3粘性凸出末端粘性凸出末端DNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNA序列序列三、T4 DNA聚合酶(T4 phage DNA polymerase)（1）T4 DNA酶的基本特性：酶的基本特性：有有35的核酸外切酶活性和的核酸外切酶活性和53的的DNA聚合酶活性。聚合酶活性。在无在无dNTP时，可以从任何时，可以从任何3-OH端外切端外切在只有一种在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。时，外切至互补核苷酸。在四种在四种dNTPs均存在时，聚合活性占主导地位。均存在时，聚合活性占主导地位。（2 2）基本用途
37、）基本用途2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程37四、T7噬菌体DNA聚合酶(T7 phage DNA polymerase)持续合成能力最强持续合成能力最强有有35 外切酶活性是外切酶活性是Klenow酶的酶的1000。可代替可代替T7噬菌体DNA聚合酶的用途。五、耐热性的DNA聚合酶（第八章详讲）来自噬高温细菌，如来自噬高温细菌，如Taq、Pfu等。等。高温下具有高温下具有53 DNA聚合酶活性，一般在聚合酶活性，一般在72最理想。最理想。有有53 外切酶活性。外切酶活性。具具35 外切酶活性者具校正（外切酶活性者具校正（proofreading）功能，如）功能，如Pfu。否则
38、无校正功能，如。否则无校正功能，如Taq。用于PCR扩增。六、反转录酶六、反转录酶(reverse transcriptase, RTase) 反转录酶是依赖于反转录酶是依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶，以聚合酶，以RNARNA为模板聚合为模板聚合cDNAcDNA链，具有链，具有5 533的的DNADNA聚合酶活性、聚合酶活性、5 533的的RNARNA外切核酸外切核酸酶活性和酶活性和RNase HRNase H活性，活性，但缺乏但缺乏3 355RNA外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，所以反转录过程中无校正功能所以反转录过程中无校正功能。 用于用于cDNA第一链甚至第二链的合成，构建第一
39、链甚至第二链的合成，构建cDNA文库、文库、RACE、RT-PCR等。等。 AMV（禽源）适温（禽源）适温42，、，、MMLV（鼠源）适温（鼠源）适温37 。野生型反转录酶能双向外切降解野生型反转录酶能双向外切降解DNA-RNA杂合链中杂合链中的的RNA链，基因工程可敲除其链，基因工程可敲除其RNase H活性。活性。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程40七、末端转移酶七、末端转移酶(terminal deoxynucleotide (terminal deoxynucleotide transferase, TdT)transferase, TdT)是不依赖于模板的是不依赖于模
40、板的DNA聚合酶，催化聚合酶，催化dNTP加于加于DNA分子的分子的3羟基端羟基端。可产生同源多聚尾用于连接、引物退火，也可用于末端标记。可产生同源多聚尾用于连接、引物退火，也可用于末端标记。 2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程41第四节第四节 其它分子克隆工具酶其它分子克隆工具酶一、依赖于一、依赖于DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶ATP（DNA dependent RNA polymerase）包括）包括SP6噬菌体和噬菌体和T4噬菌体噬菌体RNA聚合酶。聚合酶。活性：转录活性，无需引物，但活性：转录活性，无需引物，但识别特异启动
41、子序列。识别特异启动子序列。用途：体外合成用途：体外合成RNA分子作探针分子作探针等。用于表达外源基因的等。用于表达外源基因的mRNA，然后用于翻译蛋白。，然后用于翻译蛋白。二、二、DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)DNADNA连接酶连接酶能催化双链能催化双链DNADNA切口处的切口处的5 5- -磷酸根和磷酸根和3 3- -羟基生羟基生成成磷酸二酯键磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的菌的DNADNA连接酶以连接酶以NADNAD+ +作为能量来源，动物细胞和噬菌体的作为能量来源，动物细胞和噬菌体的
42、连接酶则以连接酶则以ATPATP作为能量来源。作为能量来源。1、T4 DNA连接酶的作用机制：ATP + DNA ligase (E) E-AMP + PPi。E-AMP上上的的AMP转转移移到到DNA的的5磷磷酸酸根根上上，使使其其活活化化，释释放出酶放出酶。活活化化的的5磷磷酸酸根根与与相相邻邻的的3羟羟基基形形成成3,5-磷磷酸酸二二酯酯键键，并并释释放出放出AMP。修复双链修复双链DNADNA缺口处的磷酸二酯键缺口处的磷酸二酯键修复与修复与RNA结合的结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键链上缺口处的磷酸二酯键连接多个平头双链连接多个平头双链DNA分子：分子：2、DNA连接酶的反应条件连接
43、酶的反应条件Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5MgCl2 10mmol/LATP 0.5-1mmol/LDTT 5mmol/LVolume 10-20LTemperature 4-25 (16 optimal) Time 4-16h3、平头双链、平头双链DNA片段的连接操作片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。提高平
44、头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）。倍大于粘性末端的连接）。加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。加入加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用。，促进大分子之间的有效作用。加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度最终浓度150-200 mmol/L。三、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）四、碱性磷酸酶四、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程53五、核酸酶（五、核酸酶（Nu
45、clease）1 1、BAL 31BAL 31核酸酶核酸酶来源于交替单胞菌，从线性DNA两条链的3末端迅速去除单核苷酸，随后从单链内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短的平末端双链DNA及以带有5个核苷酸突出单链的截短分子。用来从两头缩短DNA，用于构建嵌套缺失体。2.S1核酸酶核酸酶S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌降解单链降解单链DNA速度比降解双链速度比降解双链DNA快快75000倍倍Zn2+必需必需最适最适pH范围为范围为4.0-4.3需要需要NaCl 10-300mmol/L降解单链降解单链DNA的速度比降解单链的速度比降解单链RNA快快7倍倍用于分析用
46、于分析DNA:RNA杂交体的结构，去掉双链核酸中突出杂交体的结构，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链的单链尾从而产生平末端，打开双链cDNA合成产生的发合成产生的发夹环。夹环。3. 绿豆核酸酶（绿豆核酸酶（mung bean nuclease）类似于类似于S1酶，但比酶，但比S1酶更温和。酶更温和。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程574 4、核糖核酸酶、核糖核酸酶A A（ribonulease Aribonulease A或或RNase ARNase A）为内切核酸酶，可特异性攻击为内切核酸酶，可特异性攻击RNA上嘧啶残基的上嘧啶残基的3端，不端，不需要需要Mg
47、2+，用于，用于DNA中中RNA的去除，使用前高温加热以的去除，使用前高温加热以去除去除DNase。可在高温下活性，不易灭活。可在高温下活性，不易灭活。5、脱氧、脱氧核糖核酸酶（核糖核酸酶（DNaseDNase）为内切核酸酶，优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链为内切核酸酶，优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA，需要，需要Mg2+，用于去除，用于去除RNA中的中的DNA、切口平移法、切口平移法探针标记等。探针标记等。适温为适温为37。6 6、外切酶核酸、外切酶核酸催化双链DNA的3羟基端逐一去除单核苷酸的反应，用途广泛，如DNA截短、探针合成等。2024/7/31西南大学生物技术专业 基
48、因工程597 7、核糖核酸酶、核糖核酸酶H H（RNase HRNase H）是内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA链，不降解单核酸、双链DNA和双链RNA，用于cDNA第二链合成之前去除与cDNA第一链结合的原模板mRNA。8 8、RNase OneRNase One为Promega公司开发，可降解RNA至小片段甚至单核苷酸，是唯一可在所有4种碱基处切割磷酸二酯链的酶。2024/7/31西南大学生物技术专业 基因工程60六、核酸酶抑制剂（六、核酸酶抑制剂（RNase inhibitorRNase inhibitor）一些重要的公司均有开发，可特异结合并抑制RNase，用于RNA反转录过
49、程中作为RNA的保护剂。七、琼脂糖酶（七、琼脂糖酶（agaraseagarase）可将琼脂亚单位水解为新琼脂寡糖，用于从低熔点琼脂糖中分离纯化大片段DNA或RNA分子。八、八、DNADNA结合蛋白结合蛋白1、单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB）：削弱链内二级结构，用于DNA电镜观察、增加DNA长链的合成能力等。2、RecA蛋白：可与单链DNA结合，还可促进双链DNA对同源单链DNA的吸收作用，是一个依赖于DNA的ATP酶。3、拓扑异构酶（topoisomerase）：瞬时破坏并再生磷酸二酯链，解除共价闭环dsDNA的超螺旋。本章重点掌握的内
50、容本章重点掌握的内容限制性核酸内切酶的定义、命名、类型和末端属性。限制性核酸内切酶的定义、命名、类型和末端属性。限制酶的主要性质、影响酶活性的因素、星活力原因。限制酶的主要性质、影响酶活性的因素、星活力原因。甲基化和甲基化酶的基本特征和在实践的指导作用。甲基化和甲基化酶的基本特征和在实践的指导作用。反转录酶的特点和主要用途。反转录酶的特点和主要用途。KlenowKlenow酶和酶和T T4 4 DNADNA聚合酶的性质及用途。聚合酶的性质及用途。TaqTaq DNA DNA聚合酶的基本特征和用途。聚合酶的基本特征和用途。T T4 4 DNA DNA连接酶的用途和作用机制。连接酶的用途和作用机制。其它工具酶的基本功能及其用途。其它工具酶的基本功能及其用途。
