植物细胞制药

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1、第五章第五章植物细胞工程制药植物细胞工程制药植物细胞培养与细胞工程植物细胞培养与细胞工程植物器官培养和快繁植物器官培养和快繁植物器官培养和快繁植物器官培养和快繁茎尖培养和无毒苗生产茎尖培养和无毒苗生产茎尖培养和无毒苗生产茎尖培养和无毒苗生产胚胎培养和胚挽救技术胚胎培养和胚挽救技术胚胎培养和胚挽救技术胚胎培养和胚挽救技术( ( ( (包括胚乳培养、试包括胚乳培养、试包括胚乳培养、试包括胚乳培养、试管受精管受精管受精管受精) ) ) )花药培养和单倍体育种花药培养和单倍体育种花药培养和单倍体育种花药培养和单倍体育种细胞培养和次生代谢产物的工业化生产细胞培养和次生代谢产物的工业化生产细胞培养和次生代

2、谢产物的工业化生产细胞培养和次生代谢产物的工业化生产植物突变体筛选利用和体细胞无性系变异植物突变体筛选利用和体细胞无性系变异植物突变体筛选利用和体细胞无性系变异植物突变体筛选利用和体细胞无性系变异原生质体培养和融合原生质体培养和融合原生质体培养和融合原生质体培养和融合人工种子人工种子人工种子人工种子细胞工程细胞工程应用的原理和方法应用的原理和方法研究的水平研究的水平研究的目的研究的目的细胞生物学和细胞生物学和分子生物学分子生物学细胞整体水平细胞整体水平或细胞器水平或细胞器水平按照人们的意愿来按照人们的意愿来改变细胞内的遗传改变细胞内的遗传物质或获得细胞产物质或获得细胞产品品概念概念分类分类植物

3、细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程理论基础理论基础细胞的细胞的全能性全能性植物细胞工程制药植物细胞工程制药第一节第一节序言序言 从从从从植植植植物物物物中中中中寻寻寻寻找找找找高高高高效效效效、低低低低毒毒毒毒、廉廉廉廉价价价价的的的的药药药药物物物物，以以以以期期期期攻攻攻攻克克克克许许许许多多多多危害人类的疾病、癌症、艾滋病等。危害人类的疾病、癌症、艾滋病等。危害人类的疾病、癌症、艾滋病等。危害人类的疾病、癌症、艾滋病等。 高高高高等等等等植植植植物物物物的的的的次次次次生生生生代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物丰丰丰丰富富富富多多多多样样样样，在在在在食食食食品品品品、医医医医药

4、药药药、化化化化工、农业中做为原料得到广泛的应用。工、农业中做为原料得到广泛的应用。工、农业中做为原料得到广泛的应用。工、农业中做为原料得到广泛的应用。 人人人人工工工工合合合合成成成成单单单单一一一一的的的的植植植植物物物物次次次次生生生生代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物十十十十分分分分困困困困难难难难：收收收收率率率率低低低低、成本高、合成工艺复杂、合成后的异构体拆分困难。成本高、合成工艺复杂、合成后的异构体拆分困难。成本高、合成工艺复杂、合成后的异构体拆分困难。成本高、合成工艺复杂、合成后的异构体拆分困难。 植植植植物物物物细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养是是是是获获获获得得得得植植植植

5、物物物物次次次次生生生生代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物的的的的捷捷捷捷径径径径，但但但但技技技技术术术术仍有待完善。仍有待完善。仍有待完善。仍有待完善。有些极其昂贵的生物药物，如抗癌首选药物有些极其昂贵的生物药物，如抗癌首选药物有些极其昂贵的生物药物，如抗癌首选药物有些极其昂贵的生物药物，如抗癌首选药物-紫杉醇等，紫杉醇等，紫杉醇等，紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量高达杉组织培养中获得生长量高达

6、杉组织培养中获得生长量高达杉组织培养中获得生长量高达0.49gFWd0.49gFWd0.49gFWd0.49gFWd-1-1-1-1的细胞系，每的细胞系，每的细胞系，每的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达升细胞培养物中紫杉醇的产量可达升细胞培养物中紫杉醇的产量可达升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg0.25mg0.25mg0.25mg。细胞的全能性细胞的全能性概念概念大小大小原因原因必要条件必要条件受精卵受精卵生殖细胞生殖细胞体细胞体细胞细胞离体、一定的营养物质、细胞离体、一定的营养物质、激素和其他外界条件激素和其他外界条件基本概念植物细胞的全能性植物细胞的全能性：植物体中任何一个

7、具有完整：植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个性。都可以重新再分化形成原来的个性。植物的植物的分化分化（differentiation）可以分为胚胎发生和器官发）可以分为胚胎发生和器官发生两个阶段。前者是从精子与卵细胞结合开始，分化为幼生两个阶段。前者是从精子与卵细胞结合开始，分化为幼胚进而发育为成熟胚和种子；后者是种子在适宜的条件下胚进而发育为成熟胚和种子；后者是种子在适宜的条件下萌发，形成根、茎、叶、花和果实。萌发，形成根、茎、叶、花和果实。脱分化脱分化（dedifferentiation)

8、：已经分化的细胞、组织和器官：已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞组织的过程。在人工培养的条件下又变成未分化的细胞组织的过程。再分化再分化（redifferentiation)：通过脱分化诱导形成的愈伤组：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。器官。由体细胞或性细胞通过脱分化形成胚状体；由体细胞或性细胞通过脱分化形成胚状体；这这愈伤组织直接形成胚状体。上述两种途径都可进一步发育愈伤组织直接形成胚状体。上述两种途径都可进一步发育成同母体相同的植株，即植物细胞全能性。成同母体相同

9、的植株，即植物细胞全能性。外植体外植体（explant）：是指用于植物组织（细胞）：是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花等均可作为外植体进行组织培养。药和花等均可作为外植体进行组织培养。无性繁殖系无性繁殖系（clone）又叫克隆，在植物细胞工）又叫克隆，在植物细胞工程中是指使用母体培养物反复进行继代培养时，程中是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。代。同一无性

10、系分离出来的两个或多个不同的系列，同一无性系分离出来的两个或多个不同的系列，称为无性系的称为无性系的变异体变异体。植物细胞工程植物细胞工程植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交过程过程离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽植物体植物体外植体外植体脱分化脱分化植物激素：细胞分裂植物激素：细胞分裂素、生长素素、生长素再分化再分化次次级级代谢代谢作用和次级代谢作用和次级代谢产物产物初级代谢产物初级代谢产物：维持细胞生长必需的：维持细胞生长必需的代谢产物，它包括合成代谢的中间产代谢产物，它包括合成代谢的中间产物及终产物。物及终产物。次次级级代谢产

11、物代谢产物：由初级代谢产物衍生：由初级代谢产物衍生而来，对生物的生存、生长、繁殖无而来，对生物的生存、生长、繁殖无关的那类代谢产物。关的那类代谢产物。植物细胞与组织培养植物细胞的结构特征植物细胞的结构特征基本特征：基本特征：有刚性的细胞壁和大的液有刚性的细胞壁和大的液泡，以及质体（如叶绿体）泡，以及质体（如叶绿体）。主要生理活性特质主要生理活性特质：酶类、维生素、酶类、维生素、植物激素、抗生素和植物杀菌素、生植物激素、抗生素和植物杀菌素、生物碱、糖甘类、挥发油、有机酸等。物碱、糖甘类、挥发油、有机酸等。植物培养细胞的生理特性植物培养细胞的生理特性第四节 植物细胞培养基本技术一、一、一、一、 植

12、物材料的准备植物材料的准备植物材料的准备植物材料的准备1 1、外植体、外植体、外植体、外植体(explant)(explant)的选择的选择的选择的选择 用于直接分离细胞的外植体的选择用于直接分离细胞的外植体的选择用于直接分离细胞的外植体的选择用于直接分离细胞的外植体的选择叶片是直接分离单细胞的最好材料。叶片是直接分离单细胞的最好材料。叶片是直接分离单细胞的最好材料。叶片是直接分离单细胞的最好材料。选选选选择择择择适适适适当当当当生生生生长长长长期期期期健健健健康康康康植植植植株株株株，并并并并选选选选择择择择细细细细胞胞胞胞之之之之间间间间粘粘粘粘连程度比较小的组织。连程度比较小的组织。连程

13、度比较小的组织。连程度比较小的组织。但但但但从从从从外外外外植植植植体体体体直直直直接接接接分分分分离离离离细细细细胞胞胞胞由由由由于于于于受受受受到到到到酶酶酶酶或或或或机机机机械械械械的的的的作作作作用用用用，细细细细胞胞胞胞结结结结构构构构会会会会受受受受到到到到一一一一定定定定程程程程度度度度的的的的损损损损伤伤伤伤，获获获获得完整细胞的数量较少，使用受到限制。得完整细胞的数量较少，使用受到限制。得完整细胞的数量较少，使用受到限制。得完整细胞的数量较少，使用受到限制。取自活体植物体、接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。取自活体植物体、接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。取自活体

14、植物体、接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。取自活体植物体、接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。第四节第四节植物细胞培养基本技术一、一、植物材料的准备植物材料的准备1 1、外植体、外植体、外植体、外植体(explant)(explant)的选择的选择的选择的选择 用于愈伤组织诱导的外植体的选择用于愈伤组织诱导的外植体的选择用于愈伤组织诱导的外植体的选择用于愈伤组织诱导的外植体的选择不同植物种类对于诱导条件的反应不同；不同植物种类对于诱导条件的反应不同；不同植物种类对于诱导条件的反应不同；不同植物种类对于诱导条件的反应不同；同一植物不同部位的诱导难易程度不同；同一植物不同部位的诱导难易程

15、度不同；同一植物不同部位的诱导难易程度不同；同一植物不同部位的诱导难易程度不同；基因型对愈伤组织诱导的影响；基因型对愈伤组织诱导的影响；基因型对愈伤组织诱导的影响；基因型对愈伤组织诱导的影响；外植体生理状态直接影响诱导；外植体生理状态直接影响诱导；外植体生理状态直接影响诱导；外植体生理状态直接影响诱导；取材季节也是成功的重要条件之一；取材季节也是成功的重要条件之一；取材季节也是成功的重要条件之一；取材季节也是成功的重要条件之一；选用产生欲生产的次生代谢产物的组织器官。选用产生欲生产的次生代谢产物的组织器官。选用产生欲生产的次生代谢产物的组织器官。选用产生欲生产的次生代谢产物的组织器官。第四节第

16、四节植物细胞培养基本技术一、一、一、一、 植物材料的准备植物材料的准备植物材料的准备植物材料的准备1 1、外植体、外植体、外植体、外植体(explant)(explant)的选择的选择的选择的选择 用于分离原生质体的外植体的选择用于分离原生质体的外植体的选择用于分离原生质体的外植体的选择用于分离原生质体的外植体的选择苗龄和叶龄对于原生质体的产率影响最重要；苗龄和叶龄对于原生质体的产率影响最重要；苗龄和叶龄对于原生质体的产率影响最重要；苗龄和叶龄对于原生质体的产率影响最重要；苗龄对用子叶或下胚轴诱导原生质体培养影响明显；苗龄对用子叶或下胚轴诱导原生质体培养影响明显；苗龄对用子叶或下胚轴诱导原生质

17、体培养影响明显；苗龄对用子叶或下胚轴诱导原生质体培养影响明显；使用叶片做外植体时，叶片中部原生质体得率最高；使用叶片做外植体时，叶片中部原生质体得率最高；使用叶片做外植体时，叶片中部原生质体得率最高；使用叶片做外植体时，叶片中部原生质体得率最高；第四节第四节植物细胞培养基本技术一、一、一、一、 植物材料的准备植物材料的准备植物材料的准备植物材料的准备2 2、外植体的预处理、外植体的预处理、外植体的预处理、外植体的预处理 外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理茎尖、茎段及叶片的处理：茎尖、茎段及叶片的处理：茎尖、茎段及叶片的处理：茎尖、茎段及叶片的处理：

18、自自自自来来来来水水水水充充充充分分分分冲冲冲冲洗洗洗洗，用用用用粘粘粘粘肥肥肥肥皂皂皂皂粉粉粉粉或或或或洗洗洗洗洁洁洁洁精精精精的的的的软软软软毛毛毛毛刷刷洗，吸干水分；刷刷洗，吸干水分；刷刷洗，吸干水分；刷刷洗，吸干水分；7575酒精浸泡酒精浸泡酒精浸泡酒精浸泡10-3010-30秒钟，无菌水冲洗秒钟，无菌水冲洗秒钟，无菌水冲洗秒钟，无菌水冲洗 2-3 2-3次；次；次；次；2 2-10-10次次次次氯氯氯氯酸酸酸酸钠钠钠钠中中中中10-15 10-15 minmin，或或或或0.1-0.2%0.1-0.2%升升升升汞汞汞汞浸浸浸浸泡泡泡泡5-10 5-10 minmin； 如如如如果果果

19、果材材材材料料料料表表表表面面面面不不不不平平平平或或或或有有有有茸茸茸茸 毛毛毛毛 ， 可可可可 在在在在 消消消消 毒毒毒毒 液液液液 中中中中 加加加加 几几几几 滴滴滴滴 Triton Triton X X或或或或Tween-80Tween-80以强化灭菌效果；以强化灭菌效果；以强化灭菌效果；以强化灭菌效果；材材材材料料料料灭灭灭灭菌菌菌菌后后后后立立立立即即即即取取取取出出出出，用用用用无无无无菌菌菌菌水水水水冲冲冲冲洗洗洗洗4-54-5遍遍遍遍，用无菌滤纸擦干；用无菌滤纸擦干；用无菌滤纸擦干；用无菌滤纸擦干；第四节第四节植物细胞培养基本技术一、一、一、一、 植物材料的准备植物材料的

20、准备植物材料的准备植物材料的准备2 2、外植体的预处理、外植体的预处理、外植体的预处理、外植体的预处理 外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理 果实及种子的消毒处理：果实及种子的消毒处理：果实及种子的消毒处理：果实及种子的消毒处理：自来水冲洗，用自来水冲洗，用自来水冲洗，用自来水冲洗，用7575酒精迅速漂洗一次；酒精迅速漂洗一次；酒精迅速漂洗一次；酒精迅速漂洗一次；果实：用果实：用果实：用果实：用2 2次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡10 min10 min，无菌水冲洗几次；，无菌水冲洗几次；，无菌水冲洗几次；，无菌水冲洗几次；种子：种

21、子：种子：种子：1010次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡20-30 min20-30 min，甚至几小时；，甚至几小时；，甚至几小时；，甚至几小时； 还可用还可用还可用还可用0.1%0.1%升汞再处理升汞再处理升汞再处理升汞再处理 5 min 5 min；对于做胚或胚乳培；对于做胚或胚乳培；对于做胚或胚乳培；对于做胚或胚乳培养的种子，可先去掉种皮，养的种子，可先去掉种皮，养的种子，可先去掉种皮，养的种子，可先去掉种皮，4%-8%4%-8%次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡8-8-10 min10 min，用无菌水冲洗多次。，用无菌水冲洗多次。，用无菌水冲洗多次。，

22、用无菌水冲洗多次。第四节第四节植物细胞培养基本技术一、一、一、一、 植物材料的准备植物材料的准备植物材料的准备植物材料的准备2 2、外植体的预处理、外植体的预处理、外植体的预处理、外植体的预处理 外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理 根及地下贮藏器官的消毒处理：根及地下贮藏器官的消毒处理：根及地下贮藏器官的消毒处理：根及地下贮藏器官的消毒处理：用自来水冲洗干净，用软毛刷刷洗；用自来水冲洗干净，用软毛刷刷洗；用自来水冲洗干净，用软毛刷刷洗；用自来水冲洗干净，用软毛刷刷洗；用滤纸吸干后用纯酒精漂洗；用滤纸吸干后用纯酒精漂洗；用滤纸吸干后用纯酒精漂洗；用滤

23、纸吸干后用纯酒精漂洗；0.1%-0.2%0.1%-0.2%升汞浸泡升汞浸泡升汞浸泡升汞浸泡5-10 min5-10 min，或，或，或，或2%2%次氯酸钠次氯酸钠次氯酸钠次氯酸钠浸泡浸泡浸泡浸泡10-15 min10-15 min；无菌水洗无菌水洗无菌水洗无菌水洗3-43-4次。次。次。次。第四节第四节植物细胞培养基本技术一、一、植物材料的准备植物材料的准备2 2、外植体的预处理、外植体的预处理、外植体的预处理、外植体的预处理 外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理外植体的灭菌消毒处理 花药的消毒处理：花药的消毒处理：花药的消毒处理：花药的消毒处理：发育适宜时期的花药被严

24、密地包裹在花萼、花发育适宜时期的花药被严密地包裹在花萼、花发育适宜时期的花药被严密地包裹在花萼、花发育适宜时期的花药被严密地包裹在花萼、花瓣或颖片之中，属自然无菌状态；瓣或颖片之中，属自然无菌状态；瓣或颖片之中，属自然无菌状态；瓣或颖片之中，属自然无菌状态；花蕾用花蕾用花蕾用花蕾用7070酒精擦拭；酒精擦拭；酒精擦拭；酒精擦拭；将花蕾浸泡在饱和漂白粉的上请液中将花蕾浸泡在饱和漂白粉的上请液中将花蕾浸泡在饱和漂白粉的上请液中将花蕾浸泡在饱和漂白粉的上请液中10 min10 min；无菌水冲洗无菌水冲洗无菌水冲洗无菌水冲洗 2-3 2-3 次；次；次；次；小麦、水稻、玉米等的幼穗去掉外层苞片，小麦

25、、水稻、玉米等的幼穗去掉外层苞片，小麦、水稻、玉米等的幼穗去掉外层苞片，小麦、水稻、玉米等的幼穗去掉外层苞片，7070简单消毒后即可接种。简单消毒后即可接种。简单消毒后即可接种。简单消毒后即可接种。第四节第四节第四节第四节 植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基碳源：以蔗糖为主，具有叶绿体的细胞可以利用碳源：以蔗糖为主，具有叶绿体的细胞可以利用碳源：以蔗糖为主，具有叶绿体的细胞可以利用碳源：以蔗糖为主，具有叶绿体的细胞可以利用COCO2 2；氮源：硝态氮对植物细胞生长有利；氮源：硝态氮对植物细胞生长有利；氮源：硝态氮对植物细胞生长有利；氮源：硝态氮对植物细胞生长有利；无机

26、盐：在各种培养基中的大量元素和微量元素，以无机盐：在各种培养基中的大量元素和微量元素，以无机盐：在各种培养基中的大量元素和微量元素，以无机盐：在各种培养基中的大量元素和微量元素，以磷酸盐、硫酸盐和硝酸盐的形式提供；磷酸盐、硫酸盐和硝酸盐的形式提供；磷酸盐、硫酸盐和硝酸盐的形式提供；磷酸盐、硫酸盐和硝酸盐的形式提供；生长因素：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生长激素生长因素：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生长激素生长因素：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生长激素生长因素：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生长激素第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基来源：不含或少含某些离子的重

27、蒸水（双蒸来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸水）或去离子水。水）或去离子水。水）或去离子水。水）或去离子水。目的：保持培养基成分完全人为控制。目的：保持培养基成分完全人为控制。目的：保持培养基成分完全人为控制。目的：保持培养基成分完全人为控制。 作用：起媒介作用作用：起媒介作用作用：起媒介作用作用：起媒介作用 组成作物体（占组成作物体（占组成作物体（占组成作物体（占7580%7580%7580%7580%） 提供提供提供提供O O O O、H H H H元素元素元素元素 运输物质、调节渗透压运输物质、调节渗透压运输

28、物质、调节渗透压运输物质、调节渗透压1 1 1 1、水：培养基大部分是水、水：培养基大部分是水、水：培养基大部分是水、水：培养基大部分是水第四节第四节第四节第四节 植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基大量元素：每升培养基含大量元素：每升培养基含大量元素：每升培养基含大量元素：每升培养基含 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM以上以上以上以上微量元素：每升培养基含微量元素：每升培养基含微量元素：每升培养基含微量元素：每升培养基含 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM以下以下以下以下大量元素：大量元素：大量元素：大量元素：O O O O、

29、H H H H、N N N N、C C C C、P P P P、K K K K、MgMgMgMg、S S S S、CaCaCaCa2 2 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素第四节第四节第四节第四节 植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基 来源：硝态或氨态氮，或两者混用。来源：硝态或氨态氮，或两者混用。来源：硝态或氨态氮，或两者混用。来源：硝态或氨态氮，或两者混用。 作用：作用：作用：作用：N N N N吸收转化吸收转化吸收转化吸收转化氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 蛋白质

30、主要组分是蛋白质主要组分是蛋白质主要组分是蛋白质主要组分是N N N N； 核酸含核酸含核酸含核酸含N N N N； 酶本身是蛋白质；酶本身是蛋白质；酶本身是蛋白质；酶本身是蛋白质； 细胞生长分化需细胞生长分化需细胞生长分化需细胞生长分化需N N N N；2 2 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素N N N N第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基2 2 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素来源：

31、来源：来源：来源：NaHNaH2 2POPO4 4 或或或或 KH KH2 2POPO4 4作用：是植物体必需元素之一；作用：是植物体必需元素之一；作用：是植物体必需元素之一；作用：是植物体必需元素之一； 与蛋白质合成有关，缺磷蛋白质含量降；与蛋白质合成有关，缺磷蛋白质含量降；与蛋白质合成有关，缺磷蛋白质含量降；与蛋白质合成有关，缺磷蛋白质含量降； 高能磷酸键的化合物，供能高能磷酸键的化合物，供能高能磷酸键的化合物，供能高能磷酸键的化合物，供能ATPATP； 形成核蛋白、含形成核蛋白、含形成核蛋白、含形成核蛋白、含P P化合物、核酸组分；化合物、核酸组分；化合物、核酸组分；化合物、核酸组分；

32、碳水化合物、蛋白质、脂肪合成、相互转化需磷。碳水化合物、蛋白质、脂肪合成、相互转化需磷。碳水化合物、蛋白质、脂肪合成、相互转化需磷。碳水化合物、蛋白质、脂肪合成、相互转化需磷。P P P P第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基2 2 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素MgMgMgMg、S S S S来源：来源：来源：来源：MgSOMgSOMgSOMgSO4 4 4 4.7H.7H.7H.7H2 2 2 2O O O O满足硫镁的需要。满足硫镁的需要。满足硫镁的需要。满足硫镁的

33、需要。作用：镁是叶绿素组分；作用：镁是叶绿素组分；作用：镁是叶绿素组分；作用：镁是叶绿素组分；S S S S是蛋白质、氨基酸、酶的组分，缺是蛋白质、氨基酸、酶的组分，缺是蛋白质、氨基酸、酶的组分，缺是蛋白质、氨基酸、酶的组分，缺S S S S影响蛋白质合成、影响叶绿素形成。影响蛋白质合成、影响叶绿素形成。影响蛋白质合成、影响叶绿素形成。影响蛋白质合成、影响叶绿素形成。第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基2 2 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素K K K K、CaCaCaCa

34、K K： 来源：来源：来源：来源：KClKCl、KNOKNO3 3、KHKH2 2POPO4 4 作用：酶促反应活化剂。作用：酶促反应活化剂。作用：酶促反应活化剂。作用：酶促反应活化剂。CaCa： 来源：来源：来源：来源：CaClCaCl2 2 . H. H2 2O O 或或或或 Ca(NO Ca(NO3 3) )2 2 . 4H. 4H2 2O O、 作用：影响酶的活性方向。作用：影响酶的活性方向。作用：影响酶的活性方向。作用：影响酶的活性方向。 决定新陈代谢的过程。决定新陈代谢的过程。决定新陈代谢的过程。决定新陈代谢的过程。 构造细胞壁，影响细胞分裂。构造细胞壁，影响细胞分裂。构造细胞壁，

35、影响细胞分裂。构造细胞壁，影响细胞分裂。第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基2 2 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素FeFe、CuCu、NaNaFeFe： 来源：来源：来源：来源：NaNa2 2EDTAEDTA螯合剂加螯合剂加螯合剂加螯合剂加FeSOFeSO4 4 . 7H. 7H2 2O O和乙二胺四乙酸二钠（和乙二胺四乙酸二钠（和乙二胺四乙酸二钠（和乙二胺四乙酸二钠（EDTAEDTA） 螯螯螯螯合铁，合铁，合铁，合铁，pH 7.6-8.0pH 7.6-8.0。 作用：植

36、物组织延长生长有作用。作用：植物组织延长生长有作用。作用：植物组织延长生长有作用。作用：植物组织延长生长有作用。CuCu：促离体根生长。促离体根生长。促离体根生长。促离体根生长。NaNa：酶的组成成分，防叶绿素破坏。酶的组成成分，防叶绿素破坏。酶的组成成分，防叶绿素破坏。酶的组成成分，防叶绿素破坏。第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基MnMn：与植物呼吸作用、光合作用有关。与植物呼吸作用、光合作用有关。与植物呼吸作用、光合作用有关。与植物呼吸作用、光合作用有关。B B：影响蛋白质合成。影响蛋白质合成。影响蛋白质合成。影响蛋白质合成。注意注意注意注意: : :

37、 :不同培养基无机盐浓度相差有的高达不同培养基无机盐浓度相差有的高达不同培养基无机盐浓度相差有的高达不同培养基无机盐浓度相差有的高达10101010倍；倍；倍；倍；高浓度无机盐保证组织生长需要的矿质营养，高浓度无机盐保证组织生长需要的矿质营养，高浓度无机盐保证组织生长需要的矿质营养，高浓度无机盐保证组织生长需要的矿质营养，使生长加快；使生长加快；使生长加快；使生长加快；根要求无机盐浓度低些。根要求无机盐浓度低些。根要求无机盐浓度低些。根要求无机盐浓度低些。2 2 2 2、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素、无机盐、大量元素、微量元素MnMn、B

38、B无机盐的影响无机盐的影响无机盐的影响无机盐的影响NoMSsaltsNoMSsalts外植体没有任外植体没有任外植体没有任外植体没有任何再生迹象何再生迹象何再生迹象何再生迹象MSsaltsreducedto0.47g/L长出一些根，长出一些根，长出一些根，长出一些根，但芽不发育但芽不发育但芽不发育但芽不发育MSsaltsincreasedto9.52g/L外植体上表面发育外植体上表面发育外植体上表面发育外植体上表面发育出芽，但没有根和出芽，但没有根和出芽，但没有根和出芽，但没有根和愈伤组织。愈伤组织。愈伤组织。愈伤组织。第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基

39、碳源碳源碳源碳源来源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或来源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或来源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或来源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或多糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶；多糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶；多糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶；多糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶； 一般为一般为一般为一般为 23% 23% 23% 23%的蔗糖。的蔗糖。的蔗糖。的蔗糖。作用：维持培养基的合适渗透压；作用：维持培养基的合适渗透压；作用：维持培养基的合适渗透压；作用：维持培养基的合适渗透压；构造植物体；构造植物体；构造植物体；构造植物体；参与新陈代谢。参与新陈

40、代谢。参与新陈代谢。参与新陈代谢。注意：不同浓度影响细胞的增殖分化。注意：不同浓度影响细胞的增殖分化。注意：不同浓度影响细胞的增殖分化。注意：不同浓度影响细胞的增殖分化。 3 3 3 3、有机化合物、有机化合物、有机化合物、有机化合物 碳源、维生素、氨基酸、植物激素碳源、维生素、氨基酸、植物激素碳源、维生素、氨基酸、植物激素碳源、维生素、氨基酸、植物激素蔗糖的影响蔗糖的影响蔗糖的影响蔗糖的影响 1 1Growthmediumisoptimizedforregenerationofplantlets外植体上表面完全被绿色芽外植体上表面完全被绿色芽外植体上表面完全被绿色芽外植体上表面完全被绿色芽覆

41、盖，下表面发育出根。覆盖，下表面发育出根。覆盖，下表面发育出根。覆盖，下表面发育出根。Nosucrose(0%)外植体发育出稀少的芽，但外植体发育出稀少的芽，但外植体发育出稀少的芽，但外植体发育出稀少的芽，但没有生出根和愈伤组织。没有生出根和愈伤组织。没有生出根和愈伤组织。没有生出根和愈伤组织。蔗糖的影响蔗糖的影响蔗糖的影响蔗糖的影响 2 2Sucrosereducedto1%外植体上表面边际芽发育出来，外植体上表面边际芽发育出来，外植体上表面边际芽发育出来，外植体上表面边际芽发育出来，也出现了一些根。也出现了一些根。也出现了一些根。也出现了一些根。Sucroseincreasedto5%外植

42、体表面覆盖发育的芽，外植体表面覆盖发育的芽，外植体表面覆盖发育的芽，外植体表面覆盖发育的芽，同时，下表面出现根。同时，下表面出现根。同时，下表面出现根。同时，下表面出现根。第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基3 3 3 3、有机化合物、有机化合物、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素 维生素类维生素类维生素类维生素类：V-CV-CV-CV-C（抗坏血酸）：强还原能力，防组织氧化变褐。（抗坏血酸）：强还原能力，防组织氧化变褐。（抗坏血酸）：强还原能力，防组织氧化

43、变褐。（抗坏血酸）：强还原能力，防组织氧化变褐。V-BV-BV-BV-B1 1 1 1（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤组织活力有关。（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤组织活力有关。（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤组织活力有关。（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤组织活力有关。V-BV-BV-BV-B2 2 2 2（烟酸或维生素（烟酸或维生素（烟酸或维生素（烟酸或维生素PPPPPPPP）：促代谢，促胚的发育，高浓度会抑）：促代谢，促胚的发育，高浓度会抑）：促代谢，促胚的发育，高浓度会抑）：促代谢，促胚的发育，高浓度会抑制生长。制生长。制生长。制生长。V-BV-BV-BV-B6 6 6 6（吡哆

44、醇）：促根生长。（吡哆醇）：促根生长。（吡哆醇）：促根生长。（吡哆醇）：促根生长。肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用，但有助活性物质发挥肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用，但有助活性物质发挥肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用，但有助活性物质发挥肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用，但有助活性物质发挥作用。作用。作用。作用。第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基 氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸来源：常用甘氨酸及多种氨基的混合来源：常用甘氨酸及多种氨基的混合来源：常用甘氨酸及多种氨基的混合来源：常用甘氨酸及多种氨基的混合水解酪蛋白，水解乳蛋白等。水解酪蛋白，水解乳蛋白等。

45、水解酪蛋白，水解乳蛋白等。水解酪蛋白，水解乳蛋白等。作用：是蛋白质的组分；促进器官增作用：是蛋白质的组分；促进器官增作用：是蛋白质的组分；促进器官增作用：是蛋白质的组分；促进器官增殖；可作有机氮源。殖；可作有机氮源。殖；可作有机氮源。殖；可作有机氮源。3 3 3 3、有机化合物、有机化合物、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基3 3 3 3、有机化合物、有机化合物、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生

46、素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素 植物激素植物激素植物激素植物激素：生长素生长素生长素生长素 吲哚乙酸（吲哚乙酸（吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAAIAAIAAIAA）： 特性：天然生长素特性：天然生长素特性：天然生长素特性：天然生长素 作用：促离体组织生长、促进愈伤组织形成。作用：促离体组织生长、促进愈伤组织形成。作用：促离体组织生长、促进愈伤组织形成。作用：促离体组织生长、促进愈伤组织形成。 萘乙酸（萘乙酸（萘乙酸（萘乙酸（NAANAANAANAA）： 特性：人工合成的化学物质。特性：人工合成的化学物质。特性：人工合成的化学物质。特性：人工合成的化学物质

47、。 作用：利发根，但根较细弱，作用：利发根，但根较细弱，作用：利发根，但根较细弱，作用：利发根，但根较细弱，IAA + IBA(IAA + IBA(IAA + IBA(IAA + IBA(吲吲吲吲哚丁酸哚丁酸哚丁酸哚丁酸) ) ) )处理使根生长健壮。处理使根生长健壮。处理使根生长健壮。处理使根生长健壮。 2,4-D2,4-D2,4-D2,4-D（二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸）：）：）：）： 作用：促愈伤组织形成，诱导作用比作用：促愈伤组织形成，诱导作用比作用：促愈伤组织形成，诱导作用比作用：促愈伤组织形成，诱导作用比IAAIAAIAAIAA高高高高10101010倍

48、。抑制器官、绿芽、根形成，特别是高浓倍。抑制器官、绿芽、根形成，特别是高浓倍。抑制器官、绿芽、根形成，特别是高浓倍。抑制器官、绿芽、根形成，特别是高浓度时抑制作用更强。度时抑制作用更强。度时抑制作用更强。度时抑制作用更强。激素的影响激素的影响激素的影响激素的影响NAANAANoNAA少量芽发育，根不发育少量芽发育，根不发育少量芽发育，根不发育少量芽发育，根不发育大量愈伤组织出现，少大量愈伤组织出现，少大量愈伤组织出现，少大量愈伤组织出现，少量芽发育，根不发育。量芽发育，根不发育。量芽发育，根不发育。量芽发育，根不发育。NAAreducedto0.1mg/L外植体上、下面发育大外植体上、下面发育

49、大外植体上、下面发育大外植体上、下面发育大量根，芽很少，也有一量根，芽很少，也有一量根，芽很少，也有一量根，芽很少，也有一些愈伤组织出现。些愈伤组织出现。些愈伤组织出现。些愈伤组织出现。NAAincreasedto5.0mg/L第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基3 3 3 3、有机化合物、有机化合物、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素 植物激素植物激素植物激素植物激素：细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素 6- 6-呋喃甲基腺呋喃甲基腺呋喃甲基腺呋喃甲

50、基腺嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤 ( (激动素、激动素、激动素、激动素、KT)KT)：化学合成物质。：化学合成物质。：化学合成物质。：化学合成物质。 作用：广泛诱导芽的形成，诱导愈伤组织时，适量加作用：广泛诱导芽的形成，诱导愈伤组织时，适量加作用：广泛诱导芽的形成，诱导愈伤组织时，适量加作用：广泛诱导芽的形成，诱导愈伤组织时，适量加 KT KT 能改善器官发生状况。能改善器官发生状况。能改善器官发生状况。能改善器官发生状况。 6- 6-苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤 (6-BA)(6-BA)：人工合成：人工合成：人工合成：人工合成 作用：广泛诱导芽的形成，作用：广泛诱导芽的形成，作用：广

51、泛诱导芽的形成，作用：广泛诱导芽的形成，BABA效力比效力比效力比效力比 KT KT大。大。大。大。 玉米素玉米素玉米素玉米素 (ZT) (ZT)：天然产物：天然产物：天然产物：天然产物 作用：对某些植物有特效。作用：对某些植物有特效。作用：对某些植物有特效。作用：对某些植物有特效。 腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤 (AD) (AD)： 作用：诱导植物细胞分裂，对芽形成有促进作用。作用：诱导植物细胞分裂，对芽形成有促进作用。作用：诱导植物细胞分裂，对芽形成有促进作用。作用：诱导植物细胞分裂，对芽形成有促进作用。激素的影响激素的影响激素的影响激素的影响BAPBAPNoBAP大量根发育，少量芽生长；外植

52、大量根发育，少量芽生长；外植大量根发育，少量芽生长；外植大量根发育，少量芽生长；外植体边缘出现未分化的愈伤组织。体边缘出现未分化的愈伤组织。体边缘出现未分化的愈伤组织。体边缘出现未分化的愈伤组织。BAPreducedto0.1mg/L根与芽的发育更加平衡，外植体根与芽的发育更加平衡，外植体根与芽的发育更加平衡，外植体根与芽的发育更加平衡，外植体边缘正在发育未分化的愈伤组织。边缘正在发育未分化的愈伤组织。边缘正在发育未分化的愈伤组织。边缘正在发育未分化的愈伤组织。植物组织和细胞培养物的生长过程植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和主要取决于生长素和分裂素的比例。分裂素的比例。高浓度生长

53、素和低浓度分裂素刺激细胞分裂；而低浓度高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂；而低浓度生长素和高浓度分裂素则刺激细胞生长。生长素和高浓度分裂素则刺激细胞生长。极个别植物组织含有合成足够和量内源植物激素的能力；极个别植物组织含有合成足够和量内源植物激素的能力；绝大多数植物组织和细胞培养基加入一定量的植物生长绝大多数植物组织和细胞培养基加入一定量的植物生长调节剂。少数培养物在经历了多次继代培养后也可能自调节剂。少数培养物在经历了多次继代培养后也可能自发成长为激素自养型（不稳定表型），此类组织的优点发成长为激素自养型（不稳定表型），此类组织的优点是其生长率高和费用低。是其生长率高和费用低。第四节第四

54、节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基3 3 3 3、有机化合物、有机化合物、有机化合物、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素碳、维生素、氨基酸、植物激素第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基来源：从红藻等海藻中提取的高分子化合物。来源：从红藻等海藻中提取的高分子化合物。来源：从红藻等海藻中提取的高分子化合物。来源：从红藻等海藻中提取的高分子化合物。特特特特性性性性：90909090熔熔熔熔解解解解，40404040以以以以下下下下凝凝凝凝固固固固；过过过过酸酸酸酸、过过过过碱

55、碱碱碱或或或或加加加加高高高高温温温温会会会会发发发发生生生生水水水水解解解解丧丧丧丧失失失失凝凝凝凝固固固固力力力力，存存存存放放放放过过过过久久久久会变褐丧失凝固力。会变褐丧失凝固力。会变褐丧失凝固力。会变褐丧失凝固力。用量：用量：用量：用量：琼脂琼脂琼脂琼脂 0.6-1.0% 0.6-1.0% 0.6-1.0% 0.6-1.0%，卡拉胶卡拉胶卡拉胶卡拉胶 0.4-0.8% 0.4-0.8% 0.4-0.8% 0.4-0.8%。作用：凝固剂，固体培养时使液体培养基凝固。作用：凝固剂，固体培养时使液体培养基凝固。作用：凝固剂，固体培养时使液体培养基凝固。作用：凝固剂，固体培养时使液体培养基凝

56、固。4 4 4 4、琼脂琼脂第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基培养基母液的配制培养基母液的配制培养基母液的配制培养基母液的配制1 1、大量元素、大量元素、大量元素、大量元素1010倍母液：倍母液：倍母液：倍母液： 分别称取分别称取分别称取分别称取1010倍量的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、倍量的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、倍量的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、倍量的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙，分别溶解，按上述顺序混合，定硫酸镁、氯化钙，分别溶解，按上述顺序混合，定硫酸镁、氯化钙，分别溶解，按上述顺序混合，定硫酸镁、氯化钙，分别溶解，按上述顺序混合

57、，定容至容至容至容至1000 ml1000 ml；配制；配制；配制；配制1000 ml1000 ml培养基取培养基取培养基取培养基取100 ml100 ml。2 2、微量元素、微量元素、微量元素、微量元素100100倍母液：倍母液：倍母液：倍母液： 分别称取分别称取分别称取分别称取10001000倍量的硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘倍量的硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘倍量的硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘倍量的硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、硫酸铜、氯化钴、钼酸钠，分别溶解，按化钾、硫酸铜、氯化钴、钼酸钠，分别溶解，按化钾、硫酸铜、氯化钴、钼酸钠，分别溶解，按化钾、硫酸铜、氯化钴、钼酸钠，分别溶解，按上述顺序混合，

58、定容至上述顺序混合，定容至上述顺序混合，定容至上述顺序混合，定容至100 ml100 ml；配制；配制；配制；配制1000 ml1000 ml培培培培养基取养基取养基取养基取 1 ml 1 ml。第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基3 3、铁盐、铁盐、铁盐、铁盐100100倍母液倍母液倍母液倍母液 分别称取分别称取分别称取分别称取100100倍的倍的倍的倍的FeSOFeSO3 3和和和和NaNa2 2EDTA EDTA ，分别溶解，然，分别溶解，然，分别溶解，然，分别溶解，然后混合，定容至后混合，定容至后混合，定容至后混合，定容至100 ml100 ml，配

59、制，配制，配制，配制1000 ml1000 ml培养基取培养基取培养基取培养基取10 10 mlml。 4 4、维生素与氨基酸母液、维生素与氨基酸母液、维生素与氨基酸母液、维生素与氨基酸母液培养基母液的配制培养基母液的配制培养基母液的配制培养基母液的配制每种单独配制成每种单独配制成每种单独配制成每种单独配制成1mg/ml1mg/ml的的的的100 ml100 ml母液；母液；母液；母液；氨基酸用量一般较高，可直接称取加入培养基；氨基酸用量一般较高，可直接称取加入培养基；氨基酸用量一般较高，可直接称取加入培养基；氨基酸用量一般较高，可直接称取加入培养基；肌醇、酵母提取物、酪蛋白水解物等用量大，也

60、肌醇、酵母提取物、酪蛋白水解物等用量大，也肌醇、酵母提取物、酪蛋白水解物等用量大，也肌醇、酵母提取物、酪蛋白水解物等用量大，也无需配制母液，直接称取加入培养基即可。无需配制母液，直接称取加入培养基即可。无需配制母液，直接称取加入培养基即可。无需配制母液，直接称取加入培养基即可。第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基培养基母液的配制培养基母液的配制培养基母液的配制培养基母液的配制5 5、植物激素母液、植物激素母液、植物激素母液、植物激素母液单独称量，单独配制成单独称量，单独配制成单独称量，单独配制成单独称量，单独配制成0.10.12.0 mg/ml2.0 mg/

61、ml的母液；的母液；的母液；的母液；生长素类先用少量生长素类先用少量生长素类先用少量生长素类先用少量0.1 M NaOH0.1 M NaOH溶解，细胞分裂素需溶解，细胞分裂素需溶解，细胞分裂素需溶解，细胞分裂素需用用用用1 M HCl1 M HCl少许先行溶解，再稀释到所需浓度；少许先行溶解，再稀释到所需浓度；少许先行溶解，再稀释到所需浓度；少许先行溶解，再稀释到所需浓度； 赤霉素赤霉素赤霉素赤霉素( (GAGA3 3) )在水中不稳定，需用在水中不稳定，需用在水中不稳定，需用在水中不稳定，需用9595酒精配制母酒精配制母酒精配制母酒精配制母液；液；液；液；脱落酸脱落酸脱落酸脱落酸( (ABA

62、ABA) )需先少量丙酮助溶，然后加水溶解；需先少量丙酮助溶，然后加水溶解；需先少量丙酮助溶，然后加水溶解；需先少量丙酮助溶，然后加水溶解；一般生长素浓度的使用为一般生长素浓度的使用为一般生长素浓度的使用为一般生长素浓度的使用为0.05-5mg0.05-5mgL L，细胞分裂，细胞分裂，细胞分裂，细胞分裂素素素素0.0510mg0.0510mgL L。第四节第四节植物细胞培养基本技术二、二、二、二、培养培养培养培养基基基基激素的配比模式激素的配比模式激素的配比模式激素的配比模式无激素的培养基被称为无激素的培养基被称为无激素的培养基被称为无激素的培养基被称为基本培养基基本培养基基本培养基基本培养

63、基。植物组织和细胞培。植物组织和细胞培。植物组织和细胞培。植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和细胞分裂素的比例：养物的生长过程主要取决于生长素和细胞分裂素的比例：养物的生长过程主要取决于生长素和细胞分裂素的比例：养物的生长过程主要取决于生长素和细胞分裂素的比例：形成愈伤组织、长根还是长芽。形成愈伤组织、长根还是长芽。形成愈伤组织、长根还是长芽。形成愈伤组织、长根还是长芽。 高高高高 有利于根和愈伤组织的形成有利于根和愈伤组织的形成有利于根和愈伤组织的形成有利于根和愈伤组织的形成生长素生长素生长素生长素/ / / /细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素 适中适中适中适中 有利于根

64、芽的分化有利于根芽的分化有利于根芽的分化有利于根芽的分化 低低低低 有利于芽的形成有利于芽的形成有利于芽的形成有利于芽的形成第四节第四节植物细胞培养基本技术三、三、三、三、培养方法培养方法培养方法培养方法 植物细胞植物细胞植物细胞植物细胞/ /组织培养方法很多，其分类也不尽相同。组织培养方法很多，其分类也不尽相同。组织培养方法很多，其分类也不尽相同。组织培养方法很多，其分类也不尽相同。1.固体培养固体培养包括利用琼脂作为支技物的固体培养和固定化细包括利用琼脂作为支技物的固体培养和固定化细胞培养。胞培养。特点：特点：简便易行、培养所占空间小简便易行、培养所占空间小缺点：缺点：培养条件不均一，易堆

65、积有害代谢物，难培养条件不均一，易堆积有害代谢物，难以控制和检测以控制和检测常用固化剂：常用固化剂：琼脂琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶明胶、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。第四节第四节植物细胞培养基本技术三、三、三、三、培养方法培养方法培养方法培养方法第四节第四节植物细胞培养基本技术三、三、三、三、培养方法培养方法培养方法培养方法固固固固体体体体培培培培养养养养：用用用用琼琼琼琼脂脂脂脂(0.6%-1.0%)(0.6%-1.0%)、明明明明胶胶胶胶(10%)(10%)等等等等做做做做支支支支持持持持 物的固体培养因简便易行而被

66、普遍使用。物的固体培养因简便易行而被普遍使用。物的固体培养因简便易行而被普遍使用。物的固体培养因简便易行而被普遍使用。液体培养：无凝固剂支持物的悬浮培养。液体培养：无凝固剂支持物的悬浮培养。液体培养：无凝固剂支持物的悬浮培养。液体培养：无凝固剂支持物的悬浮培养。控温控温控温控温：251251控控控控光光光光：有有有有些些些些植植植植物物物物材材材材料料料料在在在在诱诱诱诱导导导导愈愈愈愈伤伤伤伤组组组组织织织织阶阶阶阶段段段段需需需需要要要要避避避避光光光光，但生长、分化和再生都需光。用日光灯供光，但生长、分化和再生都需光。用日光灯供光，但生长、分化和再生都需光。用日光灯供光，但生长、分化和再

67、生都需光。用日光灯供光，16h/d16h/d。外外外外植植植植体体体体在在在在培培培培养养养养3 3周周周周左左左左右右右右必必必必须须须须更更更更换换换换到到到到新新新新鲜鲜鲜鲜培培培培养养养养基基基基中中中中( (继继继继代代代代培养培养培养培养) )。2.液体培养液体培养一种外植一种外植体体经过一定次数的继代培养，待愈伤组织变经过一定次数的继代培养，待愈伤组织变得较为疏松时，其培养物就可用于悬浮培养。得较为疏松时，其培养物就可用于悬浮培养。液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和振培养、半连续

68、和连续培养。悬浮培养可分为静止和振荡两类。荡两类。静止培养简便易行，而且不会出现营养物质浓度差的静止培养简便易行，而且不会出现营养物质浓度差的现象。现象。振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，利用振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，利用磁力搅拌或摇床在不断振（摇）动的情况下进行培养，磁力搅拌或摇床在不断振（摇）动的情况下进行培养，此法可克服静止培养的许多缺点。此法可克服静止培养的许多缺点。第四节第四节植物细胞培养基本技术三、三、三、三、培养方法培养方法培养方法培养方法1.成批培养法成批培养法将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细

69、胞的操作方式称为成批培养法。定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。最适于植物细胞培养的生物反应器当属最适于植物细胞培养的生物反应器当属气升式气升式反应器反应器，它用通气代替搅拌，避免了使用机械，它用通气代替搅拌，避免了使用机械搅拌所致的细胞破碎、通气受限制、培养物易搅拌所致的细胞破碎、通气受限制、培养物易污染等缺点。污染等缺点。植物细胞两步培养法：第一个反应器用于细胞植物细胞两步培养法：第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。物的生产。（实例：紫草宁）（实例：紫草宁）第四节第四节植物细胞培养基本技术 三、三、三、三、培养

70、方法培养方法培养方法培养方法植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统2.半连续培养法半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。培养方法称为半连续培养法。通过调整收获细胞的数量和次数来保持通过调整收获细胞的数量和次数来保持细胞重量的恒定细胞重量的恒定。实例：实例：烟草细胞培养烟草细胞培养第四节第四节植物细胞培养基本技术 三、三、三、三、 培养方法培养方法培养方法培养方法植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统植

71、物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统植物细胞悬浮培养反应器植物细胞悬浮培养反应器（搅拌式）（搅拌式）3.连续培养法连续培养法利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。 = =maxmax S / S /（K Ks s+S+S）连续培养法培养时间长，其细胞的生产能力比较高，但连续培养法培养时间长，其细胞的生产能力比较高，但技术条件要求较为苛刻。技术条件

72、要求较为苛刻。在培养特定细胞或生产次级代谢产物时，又应用了二阶在培养特定细胞或生产次级代谢产物时，又应用了二阶段连续培养法段连续培养法第一罐投入生长培养基进行连续培养，第一罐投入生长培养基进行连续培养，第二罐第二罐投入生产培养基进行连续培养，两罐间连通管道投入生产培养基进行连续培养，两罐间连通管道连接。连接。实例：实例：生物烟草细胞生物烟草细胞第四节第四节植物细胞培养基本技术 三、三、三、三、培养方法培养方法培养方法培养方法植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统4.固定化培养法固定化培养法植物细胞固定化培养技术，可使细胞块中各个植物细胞固定化培

73、养技术，可使细胞块中各个细胞处于一定理化梯度下，与完整植株类似，细胞处于一定理化梯度下，与完整植株类似，是目前相对优化的培养方法。是目前相对优化的培养方法。固定化反应器：网状多孔板、尼龙网套、中孔固定化反应器：网状多孔板、尼龙网套、中孔纤维膜等。纤维膜等。突出优点是细胞位置固定，易于获得高密度细突出优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物理化学梯度，利于细胞胞群体及维持细胞间物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。次级代谢产物。实例：辣椒细胞固定化培养生产辣椒素。实例：辣椒细胞固定化培养生产辣椒素。第四节第四节植物细胞培养基本技术 三、三、三、三、 培养方法培养方法培养方法培养方法植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统植物细胞大规模培养系统