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1、 造血干细胞捐献者血样的造血干细胞捐献者血样的 HLA HLA基因定型及资料录入基因定型及资料录入 邓志辉邓志辉 深圳市输血医学研究所深圳市输血医学研究所 2005年年5月月16日日Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.主要工作流程主要工作流程一、各一、各“工作站工作站”将审核、遴选合格的造血干细胞捐将审核、遴选合格的造血干细胞捐献者血样(贴有骨髓条码),以及捐献者样本清献者血样(贴有骨髓条码),以及捐献者
2、样本清单(捐献者姓名及骨髓编号),一并送达我研究单(捐献者姓名及骨髓编号),一并送达我研究所免疫遗传实验室;所免疫遗传实验室;二、免疫遗传实验室对捐献者血样进行二、免疫遗传实验室对捐献者血样进行HLA-AHLA-A、B B和和DRB1DRB1基因定型,对送检血样的基因定型,对送检血样的HLAHLA基因定型结果负基因定型结果负责;责; 三、出具三、出具“捐献者捐献者HLAHLA基因分型检测结果基因分型检测结果”报告。报告。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright
3、 2004-2011 Aspose Pty Ltd.主要内容主要内容 (1 1)捐献者)捐献者HLAHLA基因定型血样的运输基因定型血样的运输 (2 2)HLAHLA相关基本概念相关基本概念 (3 3)HLAHLA分型(定型)技术分型(定型)技术 HLA HLA血清学分型技术血清学分型技术 HLA HLA基因分型技术基因分型技术Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.捐献者捐献者HLAHLA基因定型血样的运输
4、基因定型血样的运输注意事项:注意事项:1 1、因、因“登记表登记表”中填写的内容审核不合格血样、中填写的内容审核不合格血样、以及经以及经HBVHBV等化验检查健康不合格的血样,予等化验检查健康不合格的血样,予以剔除;以剔除;2 2、检查血样管有无破管;、检查血样管有无破管;3 3、路途远、条件许可,可放置适量干冰;、路途远、条件许可,可放置适量干冰;4 4、由专人运送,防震、防颠覆;、由专人运送,防震、防颠覆;5 5、合格的、合格的HLAHLA基因定型血样与捐献者样本清单基因定型血样与捐献者样本清单一并送往组织配型实验室。一并送往组织配型实验室。Evaluation only.Created
5、with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.人类白细胞抗原人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA)(Human Leucocyte Antigen, HLA)v1958年,年,Dausset采用白细胞凝集实验,检测出第一个人类采用白细胞凝集实验,检测出第一个人类白细胞白细胞 抗原抗原Mac(A2)。)。v为高度复杂的遗传多态性系统,每个人的为高度复杂的遗传多态性系统,每个人的HLAHLA千差万别,即人千差万别,即人体生物学的体
6、生物学的“身份证身份证” ” , v不同的民族、同一民族不同的地域,不同的民族、同一民族不同的地域,HLAHLA基因及单倍型分布有基因及单倍型分布有其特点,其特点,vHLAHLA为人类主要组织相容性系统(为人类主要组织相容性系统(MHCMHC),与移植排斥反应密切),与移植排斥反应密切相关,又称移植抗原。相关,又称移植抗原。v是机体是机体“识别自身识别自身”、“排除异已排除异已”的主要遗传标记,参与免的主要遗传标记,参与免疫应答反应。疫应答反应。 vHLAHLA基因家族位于人类第基因家族位于人类第6 6号染色体短臂,全长号染色体短臂,全长3.6 Mb3.6 Mb,HLAHLA基基因家族是迄今为
7、止最复杂、多态性最丰富、免疫功能相关基因家族是迄今为止最复杂、多态性最丰富、免疫功能相关基因最集中、与疾病关联最密切的一个区域。因最集中、与疾病关联最密切的一个区域。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA抗原的分类抗原的分类vHLA-IHLA-I类:由一条具有多态性的类:由一条具有多态性的多肽链和一条没有多态性多肽链和一条没有多态性的的 2 2微球蛋白通过非共价键组成异二聚体。微球蛋白通过非共价
8、键组成异二聚体。 经典经典HLA-IHLA-I类抗原:包括类抗原:包括HLA-AHLA-A、B B、C C位点抗原,分布于几乎位点抗原,分布于几乎所有有核细胞表面上。如所有有核细胞表面上。如T T淋巴细胞、淋巴细胞、B B淋巴细胞等,血小板淋巴细胞等,血小板上吸附上吸附HLA-AHLA-A、B B抗原。抗原。 非经典非经典HLA-IHLA-I类抗原:包括类抗原:包括HLA-EHLA-E、G G 、F F位点抗原,抗原在位点抗原,抗原在特定时间选择性分布。特定时间选择性分布。vHLA-IIHLA-II类:由类:由34KD34KD的的 链和链和29KD29KD的的链以非共价键连接而成,链以非共价键
9、连接而成,包括包括HLA-DRHLA-DR、DPDP、DQDQ抗原;抗原; 仅分布于仅分布于B B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞等少数细胞表面。淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞等少数细胞表面。vHLA-HLA-类:主要包括补体分子类:主要包括补体分子C2C2、C4C4及及BfBf等。等。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA抗原结构抗原结构Evaluation only.Created with As
10、pose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA的免疫原性及骨髓库建库工作中的免疫原性及骨髓库建库工作中常规检测的常规检测的HLAHLA位点位点vHLAHLA是一个高度复杂的遗传多态性系统,如:是一个高度复杂的遗传多态性系统,如: 经典经典HLA-IHLA-I类抗原:类抗原:HLA-AHLA-A、B B、C C位点抗原;位点抗原; 非经典非经典HLA-IHLA-I类抗原:类抗原:HLA-EHLA-E、G G 、F F位点抗原位点抗原 HLA-II HLA-II类:类
11、:HLA-DRHLA-DR、DPDP、DQDQ位点抗原位点抗原vHLAHLA的免疫原性,主要以的免疫原性,主要以HLA-AHLA-A、B B和和DRB1DRB1的免疫原性较强,的免疫原性较强,因此,骨髓库建库工作中,通常仅对因此,骨髓库建库工作中,通常仅对HLA-AHLA-A、B B和和DRB1DRB1位点进位点进行定型。行定型。v无关供者骨髓移植中,无关供者骨髓移植中,NMDPNMDP、JMDPJMDP有研究资料表明,供有研究资料表明,供/ /受受者对者对HLA-CHLA-CW W基因的匹配程度,与基因的匹配程度,与GVHDGVHD、移植成活率相关。、移植成活率相关。Evaluation o
12、nly.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA基因基因v定位于人类第定位于人类第6 6号染色体短臂(号染色体短臂(6p21.316p21.31),全长),全长3.6 Mb3.6 Mb,占,占人类基因组碱基数的人类基因组碱基数的0.1%0.1%。vHLA-IHLA-I类基因:有类基因:有1010个遗传座位,靠近染色体顶端,个遗传座位,靠近染色体顶端,HLA-AHLA-A、B B、C C、E E、G G、 F F为表达基因,为表达
13、基因,H H、J J、K K、L L为假基因,无基因为假基因,无基因产物。产物。v HLA- HLA-类基因:靠近染色体着丝粒端,主要包括类基因:靠近染色体着丝粒端,主要包括HLA-DRHLA-DR、DPDP、DQDQ基因座。基因座。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA基因结构基因结构v体细胞为二倍体,同源体细胞为二倍体,同源染色体之间相互配对,染色体之间相互配对,v每一每一HLAHLA位点有
14、位点有2 2个等位个等位基因,一个来自于母亲,基因,一个来自于母亲,另一个来自于父亲。另一个来自于父亲。v检测检测HLA-AHLA-A、B B和和DRB1DRB1三三个位点,有个位点,有6 6个等位基因,个等位基因,即即6 6个个HLAHLA分型数据。分型数据。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.检出的检出的HLAHLA抗原及等位基因抗原及等位基因v2003年年世世界界卫卫生生组组织织(WHO)HLA因因
15、子子命命名名委委员员会会命命名名的的HLA等等位位基基因:因: HLA座位座位 等位基因等位基因 特异性特异性 HLA-A 250 24 HLA-B 490 49 HLA-Cw 119 13 HLA-DRB1 315 17 HLA-DPB1 99 6 HLA-DQB1 53 7vHLA 系统等位基因丰富,每个人的等位基因型千差万别,可以说在随机系统等位基因丰富,每个人的等位基因型千差万别,可以说在随机人群中,难以有完全相同的。人群中,难以有完全相同的。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile
16、5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA的命名的命名1、血血清清学学命命名名:遗遗传传位位点点后后用用数数字字表表示示,如如A1A1、A2A2、A3A3、B5B5等。等。 以以大大写写字字母母A A、B B、CC表表示示HLAHLA的的遗遗传传座座位位;HLAHLA特特异异性性以以数数字字表表示示;除除HLA-AHLA-A、B B位位点点抗抗原原的的特特异异性性的的命命名名数数字字不不重重复复外外,其其它它位位点点抗抗原原连连续续独独立命名;立命名;C C位点抗原以位点抗原以C Cw w为字首命名,以和补体系统区别。为字首命名,以和补体
17、系统区别。2 2、HLAHLA等等位位基基因因命命名名原原则则:位位点点后后加加“*”“*”,再再加加数数字字表表示示。如如DRB4*01 03 1 02 NDRB4*01 03 1 02 N 第第1 1、2 2位数表示位数表示HLAHLA抗原的特异性,第抗原的特异性,第3 3、4 4位数表示等位基因(亚型)位数表示等位基因(亚型),结尾加,结尾加N N表示无效等位基因或不表达基因。表示无效等位基因或不表达基因。v HLA HLA等位基因所对应的血清学特异性,可查阅过等位基因所对应的血清学特异性,可查阅过WHOWHO公布的公布的HLAHLA字典。字典。v HLAHLA低分辨水平基因定型:确定低
18、分辨水平基因定型:确定HLAHLA基因前基因前2 2位数。位数。vHLAHLA高分辨水平基因定型:确定高分辨水平基因定型:确定HLAHLA基因第基因第4 4位以后的数字。位以后的数字。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLA的生物学功能的生物学功能vHLAHLA参与免疫应答反应,与抗原肽结合形成参与免疫应答反应,与抗原肽结合形成HLA-HLA-抗原肽复合物,抗原提呈细胞将此复合抗原肽复合物,抗原提呈细胞
19、将此复合物交由物交由T T淋巴细胞处理,淋巴细胞处理,T T细胞上的细胞上的T T细胞受体细胞受体(TCRTCR)能够对抗原提呈细胞上的)能够对抗原提呈细胞上的HLA-HLA-抗原肽抗原肽复合物产生双识别,从而介导免疫反应。复合物产生双识别,从而介导免疫反应。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.T T细胞受体对细胞受体对HLA-HLA-抗原肽复合物的抗原肽复合物的双识别作用双识别作用Evaluation
20、only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.人类白细胞抗原(人类白细胞抗原(HLA)的应用)的应用vHLA分型在骨髓和器官移植组织型分型在骨髓和器官移植组织型v法医学亲子鉴定和个体识别法医学亲子鉴定和个体识别v人类种群学人类种群学v安全输血安全输血v疾病相关联的研究等领域疾病相关联的研究等领域(如(如HLA-B27)Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Clie
21、nt Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLA分型技术分型技术1、传统的血清学和细胞学分型方法、传统的血清学和细胞学分型方法 因需要有活性的细胞、定型血清或分型细胞来源困难、分型准确性较因需要有活性的细胞、定型血清或分型细胞来源困难、分型准确性较差等原因,已逐步被淘汰。差等原因,已逐步被淘汰。 2、PCR为基础的为基础的HLA基因分型技术基因分型技术 分型所需要的血样量少,不需要有活性的细胞,实验重复性好、结果的准确分型所需要的血样量少,不需要有活性的细胞,实验重复性好、结果的准确性高,易于质控和准标化。性高,易于质控和准标化
22、。HLA基因分型技术取代了血清学方法。基因分型技术取代了血清学方法。 当前的当前的“中国造血干细胞捐献者资料库中国造血干细胞捐献者资料库”的建库技术,不同于以的建库技术,不同于以往的往的“中华骨髓库中华骨髓库”。前者采用基因定型技术检测。前者采用基因定型技术检测HLA-A、B、DRB1基因,后者采用血清学方法检测基因,后者采用血清学方法检测HLA-A、B抗原。抗原。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.“中
23、国造血干细胞捐献者资料库中国造血干细胞捐献者资料库”对捐献者对捐献者血样血样HLA基因分型技术的要求基因分型技术的要求v对对HLA-AHLA-A、B B和和DRB1DRB1进行基因分型,分辨率达低分辨进行基因分型,分辨率达低分辨水平。水平。v结果既报告每一样本的基因型,同时报告对应的特结果既报告每一样本的基因型,同时报告对应的特异性。异性。v通过各省级组织配型实验室室内质控,以及国家通过各省级组织配型实验室室内质控,以及国家“HLA“HLA质控实验室质控实验室”组织的室间质控对组织的室间质控对HLAHLA基因分型基因分型的准确性进行质量监控。的准确性进行质量监控。Evaluation only
24、.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLA基因分型技术基因分型技术vPCR-序列特异性引物(序列特异性引物(PCR-SSP)vPCR-SSO流式磁珠分析流式磁珠分析vHLA测序分型(测序分型(SBT)vPCR-序列特异性寡核苷酸探针(序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)v基因芯片技术基因芯片技术v参比链介导的构象分析参比链介导的构象分析(RSCA) vHLA单倍体基因测序单倍体基因测序Evaluation only.Create
25、d with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA基因分型的步骤基因分型的步骤 1、DNA提取提取 2、PCR扩增扩增 3、PCR扩增产物的检测扩增产物的检测 4、结果分析(判别受检者、结果分析(判别受检者HLA基因型)基因型) 5、HLA基因定型报告基因定型报告 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-
26、2011 Aspose Pty Ltd. PCR-PCR-序列特异性引物(序列特异性引物(PCR-SSP)分型技术)分型技术 基本原理:基本原理: 使用序列特异性引物(使用序列特异性引物(SSP)特异性扩增特异性扩增HLA等位基因,电泳等位基因,电泳分离分离PCR扩增产物,根据是否存扩增产物,根据是否存在在PCR产物以及片段大小,确定产物以及片段大小,确定相应基因。相应基因。 主要步骤:主要步骤: 1、DNA提取提取 2、PCR扩增扩增 3、琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶电泳检测 4、结果分析、结果分析Evaluation only.Created with Aspose.Slides for
27、 .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.PCR-PCR-序列特异性引物(序列特异性引物(PCR-SSP)分型技术)分型技术Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.PCR-PCR-序列特异性引物序列特异性引物(PCR-SSP)分型技术)分型技术v特点:简便、快速、直观等,特别适合于尸特点:简便、快速、直观等,特别适合
28、于尸肾移植的组织配型;所需设备简单,易于开肾移植的组织配型;所需设备简单,易于开展;为常规采用的经典展;为常规采用的经典HLA基因分型技术。基因分型技术。v应用:适合于经典应用:适合于经典HLA-、类分子的基类分子的基因分型因分型v分辨率:低分辩、高分辩基因分型水平。分辨率:低分辩、高分辩基因分型水平。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.PCR-SSO流式磁珠分析技术流式磁珠分析技术 v基本原理:基本原理
29、:以反向核酸杂交为基础,杂交产物以反向核酸杂交为基础,杂交产物采用流式磁珠仪进行自动检测,为高通量采用流式磁珠仪进行自动检测,为高通量HLAHLA基因定型技术。基因定型技术。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.PCR-SSO流式磁珠分析技术的特点(一)流式磁珠分析技术的特点(一)v实验原理、引物设计、扩增产物的检测等,与实验原理、引物设计、扩增产物的检测等,与SSPSSP分分型技术不同。型技术不同。vPC
30、R扩增反应结束后,将标记探针的磁珠直接加入扩增反应结束后,将标记探针的磁珠直接加入PCRPCR产物中,微量离心管(反应板)置于产物中,微量离心管(反应板)置于PCR扩增仪扩增仪上进行分子杂交;上进行分子杂交;v杂交产物用流式磁珠仪进行自动进样检测,用杂交产物用流式磁珠仪进行自动进样检测,用HLAHLA分分析软件确定析软件确定HLA基因型。基因型。 Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.流式磁珠分析技术的特点
31、(二)流式磁珠分析技术的特点(二)v配合配合DNADNA全自动全自动DNADNA提取仪及多个提取仪及多个PCRPCR基因扩增仪,具基因扩增仪,具有高通量、操作简便、快速特点。适合骨髓库、脐有高通量、操作简便、快速特点。适合骨髓库、脐血库大批量样本的血库大批量样本的HLA基因分型工作。基因分型工作。v基于流式磁珠分析技术,已有多家商品化、低分辩基于流式磁珠分析技术,已有多家商品化、低分辩水平的水平的HLAHLA基因分型试剂盒。基因分型试剂盒。v可用于可用于HLA-AHLA-A、B B、C C、DRB1DRB1和和DQB1DQB1座位的基因分型。座位的基因分型。Evaluation only.Cr
32、eated with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA测序分型(测序分型(SBTSBT)技术)技术 HLA-座位座位 检测对象检测对象 HLA-A第第2,3,4 外显子的正、反向序列外显子的正、反向序列 HLA-B第第2,3,4 外显子的正、反向序列外显子的正、反向序列 HLA-Cw第第2,3外显子正、反向序列外显子正、反向序列 HLA-DRB1第第2外显子正、反向序列,外显子正、反向序列,Condon 86反反向序列。向序列。 HLA-DQB1
33、第第2外显子正、反向序列,第外显子正、反向序列,第3外显子的外显子的反向测序。若存在反向测序。若存在DQB1*0201/0202 或或 0301/0309,分析第,分析第3外显子的测序结果。外显子的测序结果。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA测序分型(测序分型(SBTSBT)技术)技术v国际公认的国际公认的HLA基因分型方法,高分辨率、基因分型方法,高分辨率、高精度;高精度;vHLA测序分型
34、技术较复杂,受实验室设备条测序分型技术较复杂,受实验室设备条件、试剂价格的限制,以往能够开展件、试剂价格的限制,以往能够开展HLA测测序分型的实验室尚不多;序分型的实验室尚不多;v随着非血缘关系造血干细胞移植供随着非血缘关系造血干细胞移植供/受者对受者对HLA高分辩确认实验,以及人类学研究、高分辩确认实验,以及人类学研究、HLA与疾病相关联等领域的需要,与疾病相关联等领域的需要,SBT技术技术的开展已日益增多。的开展已日益增多。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyr
35、ight 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA测序分型(测序分型(SBTSBT)技术)技术v可在同一可在同一PCR反应条件反应条件、同一测序反应的条件下,、同一测序反应的条件下,对不同对不同HLA座位进行同步座位进行同步扩增,简化了实验操作;扩增,简化了实验操作;v随着毛细管电泳基因测随着毛细管电泳基因测序仪及新的序仪及新的HLA分析软件分析软件的应用,的应用,HLA测序分型处测序分型处理样本的能力逐步高通量理样本的能力逐步高通量化。化。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Pro
36、file 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.HLAHLA基因分型技术的展望基因分型技术的展望vHLA基因分型技术呈现多元化趋势,基因分型技术呈现多元化趋势,HLA基因分型基因分型涵盖面不断扩大;涵盖面不断扩大;v低分辩、中分辩向高分辩水平发展;低分辩、中分辩向高分辩水平发展;v分型结果的准确性和精确度不断提高;分型结果的准确性和精确度不断提高;v实验操作更为简便快速;实验操作更为简便快速;v不同的不同的HLA分型技术,其实验原理、优缺点不同,分型技术,其实验原理、优缺点不同,因而各实验室可根据自身的目的、需要并结合自身因而各实验室可根据自身的目的、需要并结合自身的技术工作平台,加以选择应用。的技术工作平台,加以选择应用。Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 谢谢!Evaluation only.Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.