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1、标题标题 第三章第三章 免疫分析法免疫分析法第一节 概述免疫分析法是以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法。 1959 1959年年，美国美国R.Yallow和和BersonBerson等人：等人：开创性地开创性地 放射性同位素示踪技术的高灵敏性放射性同位素示踪技术的高灵敏性 免疫反应的高特异性免疫反应的高特异性 测定糖尿病人血浆中的胰岛素，从而创立了测定糖尿病人血浆中的胰岛素，从而创立了RIARIA法，法，19771977年年获诺贝尔医学奖。获诺贝尔医学奖。启发：启发：酶免疫分析法酶免疫分析法 EIA化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法CLIA荧光免疫分析法荧光免疫分析法FIA独立学科独立学
2、科用于测定蛋白质、酶等大分子，小分子量药物用于测定蛋白质、酶等大分子，小分子量药物-体内药分的基本技术体内药分的基本技术免疫分析法在药物分析中的应用：1、在科学研究中；2、测定生物利用度；3、在临床检测中；4、在药物生产中；5、对特定的微量有害杂质。基本条件基本条件 免疫分析必需三种基本免疫分析必需三种基本试剂：标记抗原、非抗原、非标记抗抗原和特异抗体原和特异抗体（一）抗原及其制备（一）抗原及其制备1.全抗原与半抗原全抗原与半抗原 2.人工抗原的制备人工抗原的制备 3.人工抗原的鉴定人工抗原的鉴定（二）特异抗体的制备及鉴定（二）特异抗体的制备及鉴定1.特异抗体特异抗体 2.抗体的制备抗体的制备
3、 3.抗体的鉴定抗体的鉴定 第二节 抗原抗原的定义：系指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。人工抗原的合成：药物分子由于相对分子量较小，其免疫原性弱，故通常认为是半抗原。为了得到高效价的抗血清，通常要将其制成合成抗原。第三节 抗体抗体：是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白，通常由两条相同的重链和两条相同的轻链所组成。抗体具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原起专一的反应。抗体示意图第四节、免疫分析法及其应用免疫分析法具有灵敏度高、选择性强的特点。已广泛应用于科学研究、药物分析、临床检验、环境监测等多个领域。一、方法分类按标记物的种类按标记物的种类按是否加入分离剂按是否加入分离
4、剂放射免疫分析法放射免疫分析法酶免疫分析法酶免疫分析法化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法荧光免疫分析法荧光免疫分析法均相免疫分析均相免疫分析 -EMIT、FPIA非均相免疫分析非均相免疫分析 RIAEIACLIAFIA方方法法分分类类 放射免疫分析放射免疫分析 RIARIA定义：将放射性同位素示踪技术的高灵敏性与定义：将放射性同位素示踪技术的高灵敏性与免疫反应的高特异性相结合的免疫分析方法。免疫反应的高特异性相结合的免疫分析方法。一、放射性同位素标记抗原一、放射性同位素标记抗原常用的放射性同位素有：常用的放射性同位素有：3H、14C、125I、131I半衰期：半衰期： 3H 12.3年；年；
5、 14C 5700年；放射性废料年；放射性废料 处理困难。处理困难。 131I仅仅8天，天， 125I 60天天目前多用目前多用3H、125I 3H发发射射的的射射线线能能量量较较低低，要要用用价价格格较较贵贵的的液液体体闪闪烁计数器检测；烁计数器检测；125I衰衰变变发发射射的的-射射线线能能量量较较高高，可可用用一一般般的的-射射线线计计数器检测。数器检测。放射免疫测定中结合或游离放射物质的分离分离结合或者游离的放射物质，进而进行测定是放射免疫分析的关键。二、F与B的分离技术a. 对分离方法的要求： 使结合部分（B）与游离部分（F）尽可能分离完全 分离后便于放射性测量 分离效果不受外界干扰
6、因素的影响 操作简便、分离迅速、重复性好 与游离标记物的非特异性结合尽可能小 试剂来源广泛、价格低廉 b. 常用的分离方法 沉淀法：抗体为蛋白，常用蛋白沉淀剂 -硫酸铵吸附法：固体吸附剂吸附游离抗原，有 DCC、纤维素、硅酸盐等。固相法：抗原、抗体结合物B附在固相载体表面，游离抗原F在反应液中。双抗体法：第二抗体沉淀可溶性抗原-抗体结合物，离心分离。三、放射性免疫测定仪（1）125I、131I射线， 计数器（2）3H、14C射线， 液体闪烁测量仪放射免疫分析的临床应用放射免疫分析的临床应用临床常用近临床常用近 200 种种（1）肿瘤相关抗原的测定：）肿瘤相关抗原的测定：AFP、CEA 、CA1
7、99、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA 等等（2）激素的测定：）激素的测定：下丘脑下丘脑-垂体垂体-甲状腺轴激素，下丘脑甲状腺轴激素，下丘脑-垂体垂体-性腺轴性腺轴激素，下丘脑激素，下丘脑-垂体垂体-肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲状旁腺素与降钙素，生长激素等状旁腺素与降钙素，生长激素等（3）非激素蛋白质的测定：）非激素蛋白质的测定：铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、肌红蛋白、血栓素、肌红蛋白、血栓素、III 型前胶原肽、层黏蛋白等型前胶原肽、层黏蛋白等（4）酶的测定：）酶的
8、测定：前列腺酸性磷酸酶、前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE 等等（5）药物及维生素的测定：）药物及维生素的测定：地高辛、叶酸、地高辛、叶酸、VitB12 等等（6）免疫分子的测定：）免疫分子的测定：各种各种 Ig、抗、抗 DNA、IL、CD、CIC（7）病原学研究：）病原学研究：现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定的价值的价值（8）其它：）其它：甘胆酸、透明质酸等甘胆酸、透明质酸等五、方法评价RIA是最早建立的免疫分析方法是最早建立的免疫分析方法优点：灵敏度高、特异性强、取样量少、适优点：灵敏度高、特异性强、取样量少、适用于大批量样品的测定。用于大
9、批量样品的测定。缺点：放射性同位素危害健康、污染环境；需专缺点：放射性同位素危害健康、污染环境；需专用的同位素实验室及测量仪器，成本高，现用的同位素实验室及测量仪器，成本高，现少用少用 酶免疫分析法酶免疫分析法 EIAEIAEIA是以酶作为标记物的免疫测定方法。是以酶作为标记物的免疫测定方法。 与与RIARIA的不同之处是用具有高效专一催的不同之处是用具有高效专一催化特性的标记酶代替放射性同位素标记物。化特性的标记酶代替放射性同位素标记物。用酶和底物的化学反应作为放大系统，提用酶和底物的化学反应作为放大系统，提高灵敏度高灵敏度均相酶免疫分析均相酶免疫分析-常用常用 非均相免疫分析非均相免疫分析
10、常用酶常用底物 反应 颜色1、辣根过氧化物酶（HRP）H2O2不溶性供氢体：3，3-二氨基联苯胺（DAB）黄褐色可溶性供氢体：3-邻苯二胺（OPD）橙色2、碱性磷酸酶对硝基酚磷酸盐（无毒性）黄色3、葡萄糖氧化酶与HRP类似棕色常用的标记酶及底物常用的标记酶及底物一、酶标记抗原一、酶标记抗原酶标药物的制备考虑原则对酶和抗体的活性无影响或影响很小对酶和抗体的活性无影响或影响很小生成的结合物是可溶性的，稳定的生成的结合物是可溶性的，稳定的反应条件容易控制反应条件容易控制制备方法应简单、重复性好制备方法应简单、重复性好制备方法与人工抗原的准备方法类似制备方法与人工抗原的准备方法类似均相免疫分析均相免疫
11、分析 在某些免疫分析中，当抗原在某些免疫分析中，当抗原-抗体反抗体反应达到平衡后，反应液中结合的标记药应达到平衡后，反应液中结合的标记药物与游离的标记药物之中物与游离的标记药物之中有一种不产生有一种不产生信号或信号消失，因此无需信号或信号消失，因此无需将反应液分将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行测定，作两相，即可在均相溶液中进行测定，故称为均相免疫分析。故称为均相免疫分析。 是指酶标抗原是指酶标抗原(AgE)同抗体同抗体(Ab)结合后，所形成的结合后，所形成的酶标抗原酶标抗原-抗体结合物抗体结合物(AgE-Ab)可使酶的活性发生改可使酶的活性发生改变变(增强或减弱增强或减弱)，且（因而）不
12、需将游离的酶标药物，且（因而）不需将游离的酶标药物(AgE)与结合的与结合的(AgE-Ab)酶标药物分开，就可直接通酶标药物分开，就可直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。 该法最大的特点是不必将结合部分和游离部分分开，不需该法最大的特点是不必将结合部分和游离部分分开，不需温育，便可直接用分光光度计测定其吸收度。温育，便可直接用分光光度计测定其吸收度。其代表是酶增强（放大）免疫测定技术（其代表是酶增强（放大）免疫测定技术（Enzyme Multiplied Immunoassay Technique,EMIT ）三、非均相三、非均相EIA 在此法
13、中，酶标抗原在此法中，酶标抗原-抗体结合物与游离的酶标抗体结合物与游离的酶标抗原均有酶活性，需将二者分离后才能测定。抗原均有酶活性，需将二者分离后才能测定。 常用的分离方法是固相法，现通常被称为酶联免常用的分离方法是固相法，现通常被称为酶联免疫吸附测定（疫吸附测定（Enzyme linked Immunosorbent Assay, ELISA）ELISA简介简介 1971年瑞典学者年瑞典学者 Engvall 和和Perlmann，荷兰学者，荷兰学者Van Weeman和和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称体液中微量物质
14、的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（为酶联免疫吸附实验（ELISA） ELISA原理原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关 ELISA原理图原理图ELISA基本的实验过程基本的实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反
15、应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色ELISA基本的实验过程基本的实验过程举例：了解利用双抗体夹心法测定甲胎举例：了解利用双抗体夹心法测定甲胎蛋白（蛋白（AFPAFP）的方法）的方法实实验材料AFPAFP诊断试剂盒诊断试剂盒AFPAFP阳性品，阴性对照品，待检品阳性品，阴性对照品，待检品微量加样器微量加样器标记笔标记笔 实验步骤实验步骤1.将包被孔编号，分别加入阳性对照、阴性对照及待测样品各100ul，37温育30分钟2.各孔分别加入洗涤液2滴，摇匀，弃去，用蒸馏水或自来水加满各孔甩掉，反复5次，然后在吸水纸上吸干（倒扣在吸水纸上）3.在各孔内加入酶结合物2滴，37温育15分
16、钟4.重复步骤25.各孔内加入底物1滴，随即加入显色剂1滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应25min，观察结果结果判定结果判定若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为阴性若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性临床意义临床意义可以用作原发性肝癌的大规模普查可以用作原发性肝癌的大规模普查 阴阴 性性: : 一般不考虑一般不考虑 弱阳性弱阳性: : 建议动态观察建议动态观察. . 阳阳 性性: : 结合病史、临床症状及体结合病史、临床症状及体症等综合判断症等综合判断可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤四、方法评价四、方法评价优
17、点：对人体无放射性伤害、不污染环境优点：对人体无放射性伤害、不污染环境, 标记物稳定，半衰期？可超过一年，标记物稳定，半衰期？可超过一年， 均相均相EIA可直接测定，可直接测定， 信号用普通的分光光度计测定，价廉。信号用普通的分光光度计测定，价廉。缺点：缺点： 不像同位素、荧光可直接产生信号，需加不像同位素、荧光可直接产生信号，需加入底物、辅酶进行酶反应后测定。入底物、辅酶进行酶反应后测定。 化学发光免疫分析化学发光免疫分析 CLIACLIA定义：是将化学发光反应（氧化反应）的高灵敏度高灵敏度和免疫反应的高度专一性高度专一性结合起来，用于测定超微量物质的一种检测技术。一、原理一、原理化学发光反
18、应化学发光反应是利用某些特定的化学反应所产生的能量使其产物或反应中间态分子激发，形成电子激发态分子，当这种激发态分子回到稳定的基态时所释放出的化学能量能以可见光的形式发射。 能产生化学发光反应的物质称为化学发光能产生化学发光反应的物质称为化学发光剂或化学发光底物。剂或化学发光底物。 将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，通过测量发光强度，根据标准曲线得到待测物通过测量发光强度，根据标准曲线得到待测物的浓度。的浓度。 二、化学发光免疫分析的类型 （一） 直接化学发光物质标记法（二）（
19、二） 化学发光酶免疫分析法化学发光酶免疫分析法鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物作为酶的发光底物鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物作为酶的发光底物发光增强剂发光增强剂三、方法评价三、方法评价1. 与与RIA相比，不用放射性物质，不污染环相比，不用放射性物质，不污染环境，不危害健康；且准确性、重复性好，线境，不危害健康；且准确性、重复性好，线性范围宽，更适合定量分析。性范围宽，更适合定量分析。2.与与FIA相比，不易受自然荧光或生物样品中相比，不易受自然荧光或生物样品中基体荧光的干扰，可得到较高的信噪比。基体荧光的干扰，可得到较高的信噪比。3.使用增敏化学发光液为底物，大大提高灵敏度使用增敏化学发光液为底物，大
20、大提高灵敏度因此，本法具有广阔的应用前景因此，本法具有广阔的应用前景 荧光免疫分析 FIA 书书： FIA是以荧光物质作为标记物与是以荧光物质作为标记物与待测物待测物结合，结合，所形成的荧光标记药物能与抗体发生免疫反应，引起所形成的荧光标记药物能与抗体发生免疫反应，引起荧荧光光强度发生变化强度发生变化的一种分析方法。的一种分析方法。 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。 是以小分子的荧光物质标记抗原或抗体，将抗原抗是以小分子
21、的荧光物质标记抗原或抗体，将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。或超微量物质进行定量测定。灵敏度高，无辐射伤害，无环境污染，易自动化灵敏度高，无辐射伤害，无环境污染，易自动化荧光免疫测定荧光免疫测定均相荧光免疫测定均相荧光免疫测定（易实现自动化操作，在体内药物分析中（易实现自动化操作，在体内药物分析中主要用此法）主要用此法）非均相荧光免疫测定非均相荧光免疫测定（heterogeneous fluorescen
22、ce heterogeneous fluorescence immunoassayimmunoassay）一、荧光标记物1.具有同待测药物连接的活性基团，连接后的具有同待测药物连接的活性基团，连接后的标记药物同抗体结合后，其荧光性质最好能标记药物同抗体结合后，其荧光性质最好能发生改变。发生改变。2.稳定，并具有较高的荧光效率；稳定，并具有较高的荧光效率；3.药物上的抗原决定物上的抗原决定簇簇不能被覆盖不能被覆盖 荧光标记物的基本要求荧光标记物的基本要求常用荧光标记物：常用荧光标记物：荧光素荧光素 罗丹明罗丹明二、荧光免疫分析的类型I.底物标记荧光免疫分析底物标记荧光免疫分析II.荧光偏振免疫分
23、析荧光偏振免疫分析III.荧光猝灭免疫分析荧光猝灭免疫分析IV.IV.荧光增强免疫分析荧光增强免疫分析V.时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定 方法评价方法评价 样品用量少样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好重复性好 快速，易自动化快速，易自动化 适于小、中等分子物质检适于小、中等分子物质检 据报道该法测定血清中地高辛的最低浓度据报道该法测定血清中地高辛的最低浓度为为0.2ng/m1；日内；日内RSD小于小于5，日间，日间RSD小小于于7，在，在389天后制作的标准曲线仍与原标准天后制作的标准曲线仍与原标准曲线基本重叠。曲线基本重叠。 还有人报
24、道应用不同免疫分析方法与还有人报道应用不同免疫分析方法与HPLC法同时测定同一样本中的苯妥英，只有法同时测定同一样本中的苯妥英，只有FIA法和法和HPLC法相关性较好。另外应用法相关性较好。另外应用FIA法时，无需分离游离的和结合的荧光标记药物，法时，无需分离游离的和结合的荧光标记药物，再加上有再加上有TDx自动分析仪，使得测定非常方便，自动分析仪，使得测定非常方便，所以所以FIA法应用日益普遍。法应用日益普遍。荧光猝灭免疫分析荧光猝灭免疫分析 FQIA定义：定义： 是利用游离标记药物具有荧光，当是利用游离标记药物具有荧光，当其与抗体结合之后即失去荧光这一性质来测其与抗体结合之后即失去荧光这一
25、性质来测定样品含量的一种荧光分析方法。定样品含量的一种荧光分析方法。荧光增强免疫分析荧光增强免疫分析 FEIA定义：定义： 是利用荧光标记药物与抗体结合之是利用荧光标记药物与抗体结合之后，能使其荧光强度增加的性质来测定样品后，能使其荧光强度增加的性质来测定样品的含量。的含量。 免疫分析法的一个共同缺点免疫分析法的一个共同缺点是代谢物的干扰问题！是代谢物的干扰问题！每一种免疫分析方法都需要特殊、专用的仪器每一种免疫分析方法都需要特殊、专用的仪器第五节 免疫扩散法免疫扩散是根据抗原和抗体在琼脂介质中扩散的结果，对其性质进行分析的一种方法。双向免疫扩散双向免疫扩散 （Double Immunodif
26、fusion) 是将抗原与抗体分别加是将抗原与抗体分别加是将抗原与抗体分别加是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，入琼脂凝胶的小孔中，入琼脂凝胶的小孔中，入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并二者自由向周围扩散并二者自由向周围扩散并二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形相遇，在比例合适处形相遇，在比例合适处形相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体成沉淀线。如果反应体成沉淀线。如果反应体成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原系中含两种以上的抗原系中含两种以上的抗原系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可抗体系统，则小孔间可抗体系统，则小孔间可抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。出
27、现两条以上的沉淀线。出现两条以上的沉淀线。出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体本法常用于抗原或抗体本法常用于抗原或抗体本法常用于抗原或抗体的定性的定性的定性的定性 、组成和两种抗、组成和两种抗、组成和两种抗、组成和两种抗原相关性分析的检测。原相关性分析的检测。原相关性分析的检测。原相关性分析的检测。实验原理：实验原理：实验原理：实验原理： 免疫双向扩散实验免疫双向扩散实验免疫双向扩散是利用琼脂糖凝胶为介质的一免疫双向扩散是利用琼脂糖凝胶为介质的一种沉淀反应。种沉淀反应。其原理为抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝其原理为抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，在二者比例合适的地方，生胶中扩
28、散相遇，在二者比例合适的地方，生成肉眼可见的线状沉淀物。成肉眼可见的线状沉淀物。该方法简便，易于观察结果该方法简便，易于观察结果 效价：抗血清效价为效价：抗血清效价为6464实验结果实验结果实验结果实验结果免疫双向扩散实验免疫双向扩散实验注意事项注意事项注意事项注意事项 铺板后，琼脂凝胶均匀，切忌凸凹不平；铺板后，琼脂凝胶均匀，切忌凸凹不平； 免疫双向扩散实验免疫双向扩散实验琼脂凝胶温度琼脂凝胶温度3030左右时，左右时，铺板。温度铺板。温度过高或过低均不能得到理想凝胶板。过高或过低均不能得到理想凝胶板。 练习与思考1、简述免疫分析法的基本原理及应满足的基本条件？2、简述免疫分析法的几种常用的方法及其特点？3、简述酶联免疫测定的基本原理与操作？
