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1、生物信息学中的生物信息学中的生物学生物学分子生物学分子生物学7/29/20241内容内容生物信息学中的生物学、分子生物信息学中的生物学、分子生物学基础生物学基础基因工程和核酸研究技术简介基因工程和核酸研究技术简介7/29/20242生物信息学中的生物学、生物信息学中的生物学、分子生物学基础知识分子生物学基础知识7/29/20243 地球上的生命史地球上的生命史120亿年前：第一次大爆炸，宇宙产生亿年前：第一次大爆炸，宇宙产生50亿年前：太阳系诞生亿年前：太阳系诞生40亿年前：海洋里出现了类似藻类的原始生物亿年前：海洋里出现了类似藻类的原始生物30亿年前：出现原核细胞生物亿年前：出现原核细胞生物
2、7亿年前：演化出各种多细胞生物，无脊椎动物亿年前：演化出各种多细胞生物，无脊椎动物7/29/202445亿年前：寒武纪大爆发，海洋中出现大量物亿年前：寒武纪大爆发，海洋中出现大量物 种，大气中氧含量剧增种，大气中氧含量剧增4亿年前：至留纪大爆发，亿年前：至留纪大爆发，O2, , 生命进入陆地生命进入陆地350万年前：古脊椎动物中出现猩猩科和人科万年前：古脊椎动物中出现猩猩科和人科50万年前：直立人出现，万年前：直立人出现，“北京猿人北京猿人”3.5万年前：早期智人出现万年前：早期智人出现2万年前：早期人类出现，万年前：早期人类出现，“山顶洞人山顶洞人”7/29/20245 生物的分类生物的分类
3、生物分类体系：生物分类体系：界（界（Kingdom）门（门（Phyla）纲（纲（Class)目（目（Order）科（科（Family）属（属（Genus）种（种（Species） 7/29/20246原核生物（原核生物（Prokaryote）：）：古细菌（古细菌（Archaea）真细菌（真细菌（Eubacteria)真核生物（真核生物（Eurokaryote）生物的进化和亲缘关系：生物的进化和亲缘关系：遗传密码统一性遗传密码统一性基本生物化学过程一致性基本生物化学过程一致性共同祖先演化而来共同祖先演化而来7/29/20247EubacteriaArchaeaEucarya7/29/20248
4、噬菌体噬菌体 病毒病毒 大肠杆菌大肠杆菌 酿酒酵母酿酒酵母 秀丽线虫秀丽线虫 果蝇果蝇模式生模式生物物 拟南芥拟南芥 水稻水稻 非洲爪蛙非洲爪蛙 斑马鱼斑马鱼 家鼠家鼠 人人7/29/20249 糖：单糖、双糖、多糖糖：单糖、双糖、多糖作用：储存能量、结构材料、分子识别作用：储存能量、结构材料、分子识别 脂肪酸：储存能量、参与代谢脂肪酸：储存能量、参与代谢 核苷酸和核酸：核苷酸和核酸： A、C、G、TDNA、RNA 氨基酸氨基酸蛋白质蛋白质 构成生物的四类分子构成生物的四类分子7/29/202410 DNA复制复制DNA聚合酶聚合酶DNA单链单链5 3复制复制 mRNA转录：转录：mRNA前体
5、前体剪接剪接 蛋白质翻译蛋白质翻译 mRNA反转录反转录cDNA 蛋白质折叠蛋白质折叠 分子生物学的中心法则分子生物学的中心法则7/29/202411中心法则中心法则DNADNADNAcDNA结构结构蛋白质蛋白质/ /酶酶mRNA转录转录翻译翻译折叠折叠相互利用相互利用复制复制转录转录表现型表现型基因型基因型7/29/202412基因工程和核酸研究基因工程和核酸研究技术简介技术简介7/29/202413 限制性内切酶（限制性内切酶（Restriction Endonuclease）限制性内切酶限制性内切酶 + 甲基化酶甲基化酶 载体：质粒、噬菌体、酵母载体：质粒、噬菌体、酵母 分子克隆：分子克
6、隆： 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR） 超速离心超速离心 凝胶电泳凝胶电泳 印迹法印迹法 DNA测序方法测序方法7/29/202414阿尔伯阿尔伯Wemer Arber瑞士生物学家瑞士生物学家巴塞尔巴塞尔Biozentrum大学大学1929内森斯内森斯Danien Nathans美国微生物学家美国微生物学家霍普金斯大学医学院霍普金斯大学医学院1931史密斯史密斯Hamilton OSmith美国微生物学家美国微生物学家霍普金斯大学医学院霍普金斯大学医学院1931限制性核酸内切酶的发现者限制性核酸内切酶的发现者7/29/202415 凝胶电泳凝胶电泳 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 聚丙烯胺凝胶电泳聚
7、丙烯胺凝胶电泳 脉冲场电泳脉冲场电泳 梯度电泳（梯度电泳（DGGE/TGGE） 二维凝胶电泳：蛋白质电泳二维凝胶电泳：蛋白质电泳7/29/20241616S rRNA gene PCR16S-23S rRNA gene PCR16S-23S rRNA gene PCR M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 117/29/202417聚丙烯胺凝胶电泳聚丙烯胺凝胶电泳7/29/202418分离大分子分离大分子DNA的方法。的方法。 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 （PFGE，PulsedFieldGelElectrophoresis）7/29/202419 1 2 3 4 5 6 7 8 9
8、变性梯度电泳变性梯度电泳DGGE温度梯度电泳温度梯度电泳TGGE7/29/202420二维凝胶电泳二维凝胶电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了泳技术结合了等电聚焦等电聚焦技术（根据蛋白质等电技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及点进行分离）以及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大技术（根据蛋白质的大小进行分离）。这两项小进行分离）。这两项技术结合形成的二维电技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。有效的一种电泳手段。 7/29/202421 印迹法印迹法凝胶凝胶硝酸纤维膜硝酸纤维膜DNA探针探针(32P) DN
9、A印迹法印迹法(Southern Blotting) RNA印迹法印迹法(Northern Blotting) 蛋白质印迹法蛋白质印迹法(Western Blotting)7/29/202422Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern blot）是）是1975年由英国人年由英国人southern创建，是研究创建，是研究DNA图谱的基图谱的基本技术，在遗传病诊断、本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及图谱分析及PCR产产物分析等方面有重要价值。物分析等方面有重要价值。Southern Blotting7/29/202423Northern Blotting1979年，年，J.C.Al
10、wine等提出：将电泳凝胶等提出：将电泳凝胶中的中的RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用使它们结合，因性滤纸上，通过共价交联作用使它们结合，因其方法同其方法同Southern杂交十分相似，故称之为杂交十分相似，故称之为Northern杂交。杂交。 7/29/202424Western Blotting与与Southern或或Northern杂交方法类似，但杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的二
11、抗。经过用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋
12、白成分。该技术也广泛应用于离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。检测蛋白水平的表达。7/29/202425 DNA测序方法测序方法 末端终止末端终止(Sanger)法：法：dNTPddNTP 化学降解化学降解 (Maxam-Gilbert)法：法： 焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术(pyrosequencing)： 7/29/202426是由是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应焦磷酸测序技术。其原理是学发光反应焦磷酸测序技术。其原理是:引物与模引物与模板板DNA 退火后在退火后在DNA 聚合酶聚合酶(DNA poly
13、merase) ATP 硫酸化酶硫酸化酶(ATP sulfurylase) 荧光素酶荧光素酶(luciferase) 和和三磷酸腺苷双磷酸酶三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase) 4 种酶的协同作用下将引物上每一个种酶的协同作用下将引物上每一个dNTP 的聚合与的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来通过检测荧光的释一次荧光信号的释放偶联起来通过检测荧光的释放和强度达到实时测定放和强度达到实时测定DNA 序列的目的。序列的目的。 焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术(pyrosequencing)： 7/29/202427焦磷酸测序技术的反应体系：焦磷酸测序技术的反应体系：反应底物、待测单链、测序引物和反应底
14、物、待测单链、测序引物和4种酶。种酶。反应底物反应底物: 5-磷酰硫酸磷酰硫酸(adenosine- 5-phosphosulfat，APS)、荧光素、荧光素(Luciferin)。7/29/202428 如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反应释放出的成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度光信号
15、实时被仪器配置的高灵敏度CCD（Charge-coupled Device）捕获到。有一个碱基和测序模板进）捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。7/29/2024297/29/202430GS FLX Titanium系统摒弃了传统的细菌克隆与挑系统摒弃了传统的细菌克隆与挑选，将选，将DNA打断成随机片段，并寻找到乳液打断成随机片段，并寻找到乳液PCR这种方法来克隆每个片段。（将这种方法来克隆每个片段。（将DNA放入油包水放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管，并利用表面活的乳液中，这样就省去了反应管，并利用表面活性剂来维持乳液的热稳定性。）性剂来维持乳液的热稳定性。）一个片段一个片段 = 一个磁珠一个磁珠 = 一条读长一条读长One fragment = One bead = One read454 GS FLX测序仪测序仪7/29/2024317/29/2024327/29/202433谢谢！谢谢！7/29/202434
