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1、DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析普通性实验普通性实验-4-4背背 景景层析法也称色析法也称色谱法，是法，是1906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶并命名的。他将植物叶子的色素子的色素经过装填有吸附装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流的柱子，各种色素以不同的速率流动后构成不同的色后构成不同的色带而而被分开，由此得名被分开，由此得名为“色色谱法法Chromatography) 。后来无色物后来无色物质也可利用吸附柱也可利用吸附柱层析分析分别。英国生物学家英国生物学家Martin和和Synge。他。他们首先提出了色首先
2、提出了色谱塔板塔板实际。1944年出年出现纸层析以后，析以后，层析法不断开展，相析法不断开展，相继出出现薄薄层层析、析、亲和和层析、凝胶析、凝胶层析、析、气相气相层析、高析、高压液相液相层析等。析等。叶绿素经过碳酸钙管柱所构成的色谱图叶绿素经过碳酸钙管柱所构成的色谱图层析的两种相层析的两种相固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质如吸附剂，凝胶，离子交换剂固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质如吸附剂，凝胶，离子交换剂等，也可以是液体物质如固定在硅胶或纤维素上的溶液，这些基质能与待分别的等，也可以是液体物质如固定在硅胶或纤维素上的溶液，这些基质能与待分别的化合物进展可逆的吸附
3、，溶解，交换等作用。化合物进展可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在层析过程中，推进固定相上待分别的物质朝着一个方向挪动的液体、气体或流动相：在层析过程中，推进固定相上待分别的物质朝着一个方向挪动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。在柱层析中普通称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。超临界体等，都称为流动相。在柱层析中普通称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差别如吸附力、分子外形及大小、分子层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差别如吸附力、分子外形及大小、分子亲和力、分配系数等，使各组分在两相一相为固定的，称为固定相；另一相流过固亲和力、分配系数等，
4、使各组分在两相一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力定相，称为流动相中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度挪动而到达分别的目的。影响不同，从而使各组分以不同的速度挪动而到达分别的目的。按按层析析过程的机理分程的机理分类：分配分配层析析: : 根据不同根据不同组分在不同溶分在不同溶剂中分配系数不同而使物中分配系数不同而使物质分分别的方法称的方法称为分配分配层析。析。吸附吸附层析析: :吸附是两相成一界面，溶吸附是两相成一界面，溶质在外表密集的景象。以吸附在外表密集的景象
5、。以吸附剂为固定相，根据待固定相，根据待分分别物与吸附物与吸附剂之之间吸附力不同而到达分吸附力不同而到达分别目的的一种目的的一种层析技析技术称称为吸附吸附层析。常析。常用吸附用吸附剂：活性碳、硅。：活性碳、硅。离子交离子交换层析析: : 是以离子交是以离子交换剂为固定相，根据物固定相，根据物质酸碱度、极性和分子大小差酸碱度、极性和分子大小差别而将而将物物质予以分予以分别的一种方法。的一种方法。凝胶凝胶层析分子析分子筛利用凝胶利用凝胶颗粒构成具有三粒构成具有三维空空间多孔性网多孔性网络构造的物构造的物质，不，不带电荷，荷，可起可起滤过或或“筛的作用。的作用。亲和和层析是利用生物分子析是利用生物分
6、子间所具有的所具有的专注性注性亲和力的和力的层析技析技术。层析法分类层析法分类层析法分类层析法分类按两相所处的形状分类：按两相所处的形状分类：流动相有两种形状：液体作为流动相流动相有两种形状：液体作为流动相 气体作为流动相气体作为流动相固定相也有两种形状：固体吸附剂作为固定相固定相也有两种形状：固体吸附剂作为固定相 以吸附在固体上的液体作为固定相以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的形状分为：按两相所处的形状分为：液相层析和气相层析液相层析和气相层析 流动相流动相固定相固定相 液体液体 液相层析液相层析) ) 气体气体 固相层析固相层析 液液 体体 液液- -液层析液层析气气- -液层析液
7、层析 固固 体体 液液- -固层析固层析气气- -固层析固层析层析法分类层析法分类称号称号操作方式操作方式适用范围适用范围柱层析柱层析将固定相装于柱内，使将固定相装于柱内，使样品沿一个方向挪动而样品沿一个方向挪动而到达分别的目的。到达分别的目的。柱层析是常用的层析方式，适用于大量样柱层析是常用的层析方式，适用于大量样品分析、分别。生物化学中常用的凝胶层品分析、分别。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析方式。色谱等都通常采用柱层析方式。薄层层析薄层层析将适当粘度的固定相均将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样匀涂铺
8、在薄板上，点样后用流动相展开，使各后用流动相展开，使各组份分别组份分别薄层层析主要适用于小分子物质的快速检薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分别制备，通常为一次性运测分析和少量分别制备，通常为一次性运用。用。按操作方式不同分类：按操作方式不同分类：吸附层析吸附层析原理：任何两个相都可以构成外表，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在原理：任何两个相都可以构成外表，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在此外表密集景象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得此外表密集景象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得到分的景象就叫吸附层析。到分的景象就叫吸附层析。凡
9、能将其他物质聚集到本人外表的物质称吸附剂，包括硅皮、氧化铝、活性炭、凡能将其他物质聚集到本人外表的物质称吸附剂，包括硅皮、氧化铝、活性炭、淀粉、纤维素及陶土，而聚集于聚集于吸附剂外表的物质称被吸附剂。淀粉、纤维素及陶土，而聚集于聚集于吸附剂外表的物质称被吸附剂。吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外，还有化学作用，如吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外，还有化学作用，如DNS-DNS-氨基酸氨基酸双向聚酰胺薄膜层析时中被分别的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于双向聚酰胺薄膜层析时中被分别的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之间构成氢键。二者之间构成氢键。分配层析技术分配层析技
10、术 液液- -液层析法液层析法原理：利用混合物在两种不相混溶的液相固定相和流动相之间的分配系数的不原理：利用混合物在两种不相混溶的液相固定相和流动相之间的分配系数的不同而到达分别各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。同而到达分别各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。特点：液特点：液- -液层析法适宜于分别同系物或同分异构体液层析法适宜于分别同系物或同分异构体分配层析技术分配层析技术分配系数小的溶分配系数小的溶质在流在流动相中分配的数量多，挪相中分配的数量多，挪动快；分配系数大的溶快；分配系数大的溶质在固定相中在固定相中分配的数量多，挪分配的数量多，挪动慢。因此可彼此分开。慢。因此可
11、彼此分开。分配系数主要与以下要素有关：分配系数主要与以下要素有关： 被分被分别物物质本身的性本身的性质； 固定相和流固定相和流动相的性相的性质； 层析柱的温度。析柱的温度。 相关的概念一：相关的概念一： 分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数浓度之比是个常数，称为分配系数(Kd)。分配系数是层析中分别纯化物质的主要根据。分配系数是层析中分别纯化物质的主要根据 Kd=Cs/Cm 其中其中Cs: 固定相中的浓度，固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度流动相
12、中的浓度分配层析技术分配层析技术相关的概念二：相关的概念二：迁移率：在一定条件下，在一样的时间内某一组分在固定相挪动的间隔与流动相本身迁移率：在一定条件下，在一样的时间内某一组分在固定相挪动的间隔与流动相本身挪动的间隔之比值。常用挪动的间隔之比值。常用RfRf来表示。来表示。物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，物质在一定溶剂中的分配系数是一定的， Rf Rf值也是恒定的，因此可以根据值也是恒定的，因此可以根据RfRf值来鉴定值来鉴定被分别的物质。被分别的物质。Rf =色斑中心至原点中心的间隔色斑中心至原点中心的间隔溶剂前缘至原点中心的间隔溶剂前缘至原点中心的间隔亲和层析法亲和层析法亲和层析亲和
13、层析Affinity Chromatography是利用生物分子间专注性亲和力而进展分别是利用生物分子间专注性亲和力而进展分别的一种层析技术。的一种层析技术。如我们熟习的：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；如我们熟习的：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互和其互补的补的DNA等。亲和层析的分别原理简单的说就是经过将具有亲和力的两个分子中一等。亲和层析的分别原理简单的说就是经过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进展个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进展分别纯化。分别
14、纯化。 亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、从纯化的亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、从纯化的分子中出去剩余的污染物、用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子，分子中出去剩余的污染物、用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子，分别核酸是亲和层析运用的重要方面。分别核酸是亲和层析运用的重要方面。亲和层析纯化过程简单、迅速，且分别效率高。对分别含量极少又不稳定的活性物亲和层析纯化过程简单、迅速，且分别效率高。对分别含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。缺陷是针对某一分别对象，制备专注的配基和寻求层析的稳定条件限质尤为有效。缺陷
15、是针对某一分别对象，制备专注的配基和寻求层析的稳定条件限制了其运用。制了其运用。亲和层析表示图亲和层析表示图离子交换层析离子交换层析离子交换层析是根据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进展分别纯化。离子交换层析是根据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进展分别纯化。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质经过离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质经过一定的化学反响共价结合上某种电荷基团构成的。一定的化学反响共价结合上某种电荷基团构成的。离子交换剂包括交换树脂和交换纤维素两种。离子交换剂包括交换树脂和交换
16、纤维素两种。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，构成一个带电的可进展离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团子聚合物共价结合，构成一个带电的可进展离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反响。平衡离子带正电的离上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反响。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，
17、称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。原理原理聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随流动相经过聚酰聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随流动相经过聚酰胺薄膜时，由于被分别物质与薄膜构成氢键，而各物质构成氢键胺薄膜时，由于被分别物质与薄膜构成氢键，而各物质构成氢键的才干不同，决议吸附力的差别，吸附力强的才干不同，决议吸附力的差别，吸附力强,展层速度慢，吸附展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。力弱，展层速度快。展层溶剂与被分别物质在聚酰胺离子外表竞争构成氢键，选择适当展层溶剂
18、与被分别物质在聚酰胺离子外表竞争构成氢键，选择适当的展层溶剂，使被分别物质在溶剂与聚酰胺薄膜外表之间的分配的展层溶剂，使被分别物质在溶剂与聚酰胺薄膜外表之间的分配系数有最大差别。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度系数有最大差别。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。快，反之，速度慢。 DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析本实验中，聚酰胺上的氨基与氨基酸本实验中，聚酰胺上的氨基与氨基酸AA的羰基构成氢键，酰胺基团上羰基与的羰基构成氢键，酰胺基团上羰基与AA中羟中羟基或酚基构成氢键。由于有些基或酚基构成氢键。由于有些AA构造类似，如只采用一种溶剂系
19、统进展单向层析，难到构造类似，如只采用一种溶剂系统进展单向层析，难到达完全分别的目的。因此可选择另一溶剂系统进展第二向层析。这种层析方法称为双向层达完全分别的目的。因此可选择另一溶剂系统进展第二向层析。这种层析方法称为双向层析。析。 第一向：苯冰醋酸溶剂第一向：苯冰醋酸溶剂 第二向：甲酸水第二向：甲酸水显色：二甲氨基萘磺酰氯显色：二甲氨基萘磺酰氯DNS-Cl可与氨基酸的游离氨基结合成可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。构成的氨基酸。构成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黄色荧光。氨基酸在紫外光下呈黄色荧光。DNS-Cl + AADNS-AA + HCl实验操作实验操作1.DNS-氨基酸的制备已
20、完成氨基酸的制备已完成2.混合混合DNS氨基酸的双向层析氨基酸的双向层析3.点样：在薄膜右下角距两边各点样：在薄膜右下角距两边各0.6cm，直径控制在，直径控制在23mm之间，点在无光泽面，之间，点在无光泽面，可反复点样可反复点样2-3次；次；4.苯冰醋酸层析：将点好样品的薄膜用回形针固定放入展层剂中，展层剂前缘在距苯冰醋酸层析：将点好样品的薄膜用回形针固定放入展层剂中，展层剂前缘在距薄膜顶端薄膜顶端2mm处即可停顿处即可停顿,冷风吹干，紫外灯下察看；冷风吹干，紫外灯下察看；5.甲酸水层析：调转甲酸水层析：调转90度与第一相垂直，放入展层剂中，热风吹干，紫外灯下察看，度与第一相垂直，放入展层剂
21、中，热风吹干，紫外灯下察看，用铅笔悄然标志以免损坏薄膜外表；用铅笔悄然标志以免损坏薄膜外表；6.分析实验结果；分析实验结果；7.将层析后标志好的薄膜以点样点为左下角贴于实验报告中。将层析后标志好的薄膜以点样点为左下角贴于实验报告中。3 3、操作本卷须知：、操作本卷须知：严厉控制点样位置以及点样直径。严厉控制点样位置以及点样直径。展层时勿将点样点浸入展层剂中。展层时勿将点样点浸入展层剂中。展层后必需经电吹风将膜吹干。展层后必需经电吹风将膜吹干。紫外光对眼睛有害不要把头伸到灯下察看。紫外光对眼睛有害不要把头伸到灯下察看。颉颉亮亮苯苯丙丙赖赖甘甘丝丝天天脯脯谷谷DNS-氨基酸的双向层析预期实验结果氨基酸的双向层析预期实验结果
