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1、 教学目的：教学目的：v1、掌握传代培养的概念和方法、掌握传代培养的概念和方法v2、了解细胞系的建立过程、了解细胞系的建立过程v3、掌握克隆细胞的几种方法、掌握克隆细胞的几种方法细胞系细胞系cell line：原代培养物经首次传代后即成。：原代培养物经首次传代后即成。有限细胞系有限细胞系finite cell line: 不能继续传代或传代数有不能继续传代或传代数有限。限。连续细胞系连续细胞系continuous cell line：可连续传代的细胞：可连续传代的细胞系，即已建成的细胞系。系，即已建成的细胞系。细胞株细胞株cell strain：通过选择法和克隆形成法从原代：通过选择法和克隆形
2、成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质和标志的培养培养物或细胞系中获得的具有特殊性质和标志的培养物。物。一、传代培养一、传代培养（passage）v概念：无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移概念：无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。或移植到另一个培养瓶。v（一）传代培养的方法（一）传代培养的方法1、从生长器皿上解离细胞的方法：、从生长器皿上解离细胞的方法：1）震荡法。）震荡法。2）胰蛋白酶消化法）胰蛋白酶消化法3）胰蛋白酶）胰蛋白酶-柠檬酸盐柠檬酸盐4）用）用EDTA洗细胞再用胰蛋白酶洗细胞再用胰蛋白酶-柠檬酸盐处理柠檬酸盐处理5） EDTA洗再用胰蛋白酶洗再用胰蛋
3、白酶-EDTA消化消化6） EDTA洗再用胰蛋白酶洗再用胰蛋白酶-胶原酶配合柠檬酸盐或胶原酶配合柠檬酸盐或 EDTA消化消化 7）机械刮削法（）机械刮削法（scraping） 8）分散酶（）分散酶（0.1mg/ml)或蛋白酶或蛋白酶(0.1-1.0 1mg/ml)2.单层培养细胞的一般传代步骤单层培养细胞的一般传代步骤:倒出旧液倒出旧液PBS洗涤洗涤胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化吸出消化液吸出消化液加入培养液加入培养液吹散细胞吹散细胞计数计数稀释稀释培养培养离心法：离心后去上清，加培养液，吹离心法：离心后去上清，加培养液，吹 打，打，传代。传代。直接传代法：将细胞慢慢沉淀，将上清吸去直接传代法：将细
4、胞慢慢沉淀，将上清吸去1/2-2/3，加培养基，传代。，加培养基，传代。3、悬浮细胞的传代培养、悬浮细胞的传代培养(二二) 传代培养的注意事项传代培养的注意事项1、传代时机与传代培养的细胞密度：细胞没生长、传代时机与传代培养的细胞密度：细胞没生长到足以覆盖的瓶底壁的大部分表面前，不要急于传到足以覆盖的瓶底壁的大部分表面前，不要急于传代。代。2、传代数或代数：指对培养物传代的次数。、传代数或代数：指对培养物传代的次数。3、尽量少传代，避免转化。、尽量少传代，避免转化。二、细胞系的建立正常细胞系建立的程序包括：正常细胞系建立的程序包括：原代培养原代培养 第一次传代第一次传代 常规传代和冻存、常规传
5、代和冻存、 复苏等阶段。复苏等阶段。 细胞系的维持细胞系的维持细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代时间等；时间等；传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；另外，要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；另外，细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。v1、证明细胞系的种系。染色体分析、同工酶分析、证明细胞系的种系。染色体分析、同工酶分析、DNA指
6、纹技术。指纹技术。v2、明确细胞系的组织来源、明确细胞系的组织来源 细胞抗原标记的方法细胞抗原标记的方法v3、细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化正常、细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化正常细胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体。细胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体。v4 、 细胞有无交叉污染细胞有无交叉污染 。同工酶方法是快速有。同工酶方法是快速有效的，每一个细胞系在琼脂糖电泳上有特异的同效的，每一个细胞系在琼脂糖电泳上有特异的同工酶带型。工酶带型。DNA指纹技术也可以鉴定。指纹技术也可以鉴定。鉴定细胞系的内容：三三 、细胞克隆、细胞克隆v细细胞胞克克隆隆（clone）是是指指单单个个细细胞
7、胞通通过过有有丝丝分分裂裂形形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。成的细胞群体，他们的遗传特性相同。v细细胞胞克克隆隆化化培培养养（cell cloning culture）：又又称称单单个个细细胞胞分分离离培培养养，是是指指将将单单个个细细胞胞在在一一定定支支持持物物上上增殖培养而产生细胞群落的过程。增殖培养而产生细胞群落的过程。（一）克隆培养技术稀释铺板法稀释铺板法饲养层克隆法饲养层克隆法胶原膜板胶原膜板琼脂克隆法等琼脂克隆法等分类：1.稀释铺板法：最常用稀释铺板法：最常用消化消化低密度细胞悬液制备低密度细胞悬液制备接种接种标记与培养标记与培养分离扩大培养分离扩大培养观察观察移植瓶或皿内培养
8、移植瓶或皿内培养稀释铺板法图解v注意事项：注意事项：v1）确保一个细胞）确保一个细胞v2）轮廓清晰完整，体积适宜健康）轮廓清晰完整，体积适宜健康v3）不需换液）不需换液2、饲养层克隆法、饲养层克隆法v饲养细胞（饲养细胞（feeder cell）：也称滋养细胞，是一）：也称滋养细胞，是一层经过射线或丝裂霉素层经过射线或丝裂霉素C处理过的供其它细胞附处理过的供其它细胞附着的细胞层。成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。着的细胞层。成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。v注意：注意：3周内饲养细胞即死亡，要及时应用周内饲养细胞即死亡，要及时应用饲饲养养层层克克隆隆图图解解3、胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法： 1
9、）胶原膜板或血纤维蛋白膜板的制备 2）消化、稀释、接种和培养待克隆细胞血纤维蛋白膜板制备血纤维蛋白膜板制备A液：液：0.2g凝血酶凝血酶,100ml培养液培养液B液液:250mg 牛血纤维蛋白原、牛血纤维蛋白原、800mg NaCl、25mg 柠檬酸钠、柠檬酸钠、1000毫升双蒸水毫升双蒸水A：B=4：14、琼脂克隆法： 用于病毒转化细胞、恶性转化细胞。 2%琼脂母液-45水浴-混合成0.33%琼脂培养液加入试管内 2.5ml- 45水浴琼琼脂脂克克隆隆法法图图解解5、在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化 2%琼脂母液-45水浴（琼脂母液和2倍浓度培养液）-1：1混合- 45水浴铺板细胞悬液内加等体
10、积的1.5%甲基纤维素混合后铺于琼脂层上培养在在琼琼脂脂基基底底上上用用甲甲基基纤纤维维素素克克隆隆化化图图解解（二）影响克隆形成率的因素v克隆形成率克隆形成率 (cloning efficiency)是指向底物是指向底物接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数 v影响因素：影响因素：1、细胞密度。、细胞密度。10个个/ml2、培养液。、培养液。HamF12k3、血清、血清4、饲养细胞、饲养细胞5、激素和生长因子：胰岛素，地塞米松，、激素和生长因子：胰岛素，地塞米松，EGF，BFGF。6、CO27、适应性生长基质：胶原层，血浆纤维蛋白层，多聚右、适应性生长基质：
11、胶原层，血浆纤维蛋白层，多聚右旋赖氨酸，纤维连接蛋白，琼脂旋赖氨酸，纤维连接蛋白，琼脂（三）克隆的分离（三）克隆的分离克克隆隆化化环环分分离离法法v2、射线照射分离克隆法、射线照射分离克隆法将培养瓶倒置放于将培养瓶倒置放于X射线或射线或钴钴60源下，用源下，用2mm厚的铅片盖住选中的克隆。厚的铅片盖住选中的克隆。v3、悬浮细胞克隆分离、悬浮细胞克隆分离v24孔板加入孔板加入1ml培养液培养液用毛细吸管吸取群用毛细吸管吸取群落落吹入培养板内吹入培养板内v1、概念：细胞系，细胞株，传代培养，、概念：细胞系，细胞株，传代培养，细胞克隆，克隆形成率细胞克隆，克隆形成率v2、鉴定细胞系应包含的内容、鉴定细胞系应包含的内容v3、常见的克隆培养技术有哪几种，简要、常见的克隆培养技术有哪几种，简要叙述其技术要点叙述其技术要点v4、影响克隆形成率的因素、影响克隆形成率的因素v5、克隆分离的方法和技术要点、克隆分离的方法和技术要点
