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1、生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实实 验验 二二蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应与与等电点测定等电点测定生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验n 了解蛋白质的两性解离性质了解蛋白质的两性解离性质n 掌握测定蛋白质等电点的方法掌握测定蛋白质等电点的方法实验目的实验目的生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验PCOOHNH2PCOO-NH3+PCOO-NH2PCOOHNH3+pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI兼性离子兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子实验原理实验原理生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 在在等等电电点点时时蛋蛋白白质
2、质颗颗粒粒上上的的净净电电荷荷为为零零，缺缺乏乏同同电电相相斥斥的的因因素素，蛋蛋白白质质溶溶解解度最小，最容易析出沉淀度最小，最容易析出沉淀u 维持蛋白质胶体稳定的因素：维持蛋白质胶体稳定的因素：表面电荷、水化膜表面电荷、水化膜生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 本本实实验验配配制制了了各各种种不不同同pHpH值值的的缓缓冲冲液液，沉沉淀淀出出现现最最多多的的缓缓冲冲液液pHpH值值即即为为酪蛋白的等电点酪蛋白的等电点生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验器材与试剂实验器材与试剂 大试管、滴管、刻度吸量管大试管、滴管、刻度吸量管 0.5酪蛋白醋酸钠溶液酪蛋白醋酸
3、钠溶液 0.01溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂(指示范围指示范围: pH3.8-5.4) 0.02M HCL溶液溶液、 0.02M NaOH溶液溶液 0.01M醋酸溶液、醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、醋酸溶液、 1.00M醋酸溶液醋酸溶液生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 蛋白质的两性反应（蛋白质的两性反应（1 1）实验步骤实验步骤取一干净试管取一干净试管酪蛋白液酪蛋白液10滴滴溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂3滴滴观察溶液颜色观察溶液颜色并解释现象并解释现象生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 蛋白质的两性反应（蛋白质的两性反应（2 2）滴加滴加0.02M HCL溶液溶液
4、边滴加边混匀边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加继续滴加0.02M HCL溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 蛋白质的两性反应（蛋白质的两性反应（3 3）继续滴加继续滴加0.02M NaOH溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加继续滴加0.02M NaOH溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀生物化学与分子生
5、物学实验生物化学与分子生物学实验 溶液呈溶液呈蓝色蓝色n 蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应(1)(1)实验结果实验结果 酪蛋白溶液呈碱性酪蛋白溶液呈碱性 (pH5.4)(pH5.4)，使溴甲酚绿，使溴甲酚绿指示剂显蓝色指示剂显蓝色生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 H H+ + ，沉淀，沉淀 n 蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应(2)(2) 出现最大量沉淀时出现最大量沉淀时, ,说明到达了酪蛋白的等电点说明到达了酪蛋白的等电点 溶液由溶液由蓝色蓝色变成变成浅绿色浅绿色（3.83.8pHpH5.45.4）生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 继续加酸，继续加酸，HH+
6、+ 继续增大，继续增大，pHpHpIpI。酪蛋白所带。酪蛋白所带正电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解正电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶液显沉淀完全溶解时，溶液显黄色黄色(pH3.8)(pH3.8)生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 OH OH- - ，沉淀，沉淀 n 蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应(3)(3) 出现最大量沉淀时出现最大量沉淀时, ,说明到达了酪蛋白的等电点说明到达了酪蛋白的等电点 溶液由溶液由黄色黄色变成变成浅绿色浅绿色（3.83.8pHpH5.45.4）生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 继续加碱，继续加碱，OHOH- - 继续
7、增大，继续增大，pHpHpIpI。酪蛋白所带。酪蛋白所带负电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解负电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶液显沉淀完全溶解时，溶液显蓝色蓝色(pH(pH5.4)5.4)生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验结论结论 1 1：n 酪蛋白的等电点在酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4pH3.8-5.4之间之间n pH= pI pH= pI时，蛋白质溶解度最小时，蛋白质溶解度最小n 蛋白质是两性电解质蛋白质是两性电解质生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 取取7 7支支同样规格同样规格的干燥试管，精确加入各试剂的干燥试管，精确加入各试剂试管号
8、码试管号码1 12 23 34 45 56 67 7蒸馏水蒸馏水2.42.43.23.23.03.01.51.52.752.753.383.381.00M1.00M醋酸醋酸1.61.60.80.80.1M0.1M醋酸醋酸4.04.01.01.00.01M0.01M醋酸醋酸2.52.51.251.250.620.62pHpH3.53.53.83.84.14.14.74.75.35.35.65.65.95.9 酪蛋白等电点的测定酪蛋白等电点的测定注：单位均为注：单位均为mL生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 向每个试管中各加向每个试管中各加0.5%0.5%酪蛋白溶液酪蛋白溶液20滴滴
9、， 加一管，立即混匀一管加一管，立即混匀一管 静置静置3030分钟后，以分钟后，以0 0、+ +、+、+、+表示各管的混浊度，并指出哪一种表示各管的混浊度，并指出哪一种pHpH是酪蛋是酪蛋白的等电点白的等电点生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验1 12 23 34 45 56 67 7沉淀量沉淀量0 0+ +0 00 0n 酪蛋白等电点的测定酪蛋白等电点的测定1234567实验结果实验结果生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验结论结论 2 2：n 4 4号号试管沉淀量最多试管沉淀量最多n 说明说明4 4号管溶液的号管溶液的pHpH值为酪蛋白的等电点，即值为酪蛋白的等电点，即pI=4.7pI=4.7生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 什么是蛋白质的等电点？什么是蛋白质的等电点？u 在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？思考题思考题生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 实验项目实验项目 实验原理实验原理 试剂和器材试剂和器材 操作方法（主要步骤）操作方法（主要步骤） 结果分析结果分析 思考题思考题生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 实验三实验三 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾预预 习习
