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1、动物性食品中致病微生物和寄生虫的检验检疫主要内容主要内容动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中致病菌的检验动物性食品中致病性病毒的检验动物性食品中致病性寄生虫的检验食源性疾病是世界各国面临的主要公共卫生问题之一，即便是在欧美发达国家，患食源性疾中的人群可高达30%。污染食物对人类健康构成威胁的主要因子包括化学性和生物性两大类，前者如兽药、农药和重金属，后者包括细菌、真菌及其毒素、病毒等。根据美国疾病预防与控制中心统计，在20世纪90年代由各种原因引起的食源性疾病中，细菌性占90%，化学性仅占3%。 根根据据国国家家食食源源性性疾疾病病监监测测网网部部分分资资料料的的分分析析结结果果显
2、显示示，我我国国食食源源性性疾疾病病的的高高危危食食品品依依次次为为肉肉类类、粮粮食食、海海产产品品、水水果果蔬蔬菜菜、鸡鸡蛋蛋、豆豆类类、奶奶。由由动动物物或或植植物物性性食食物物污污染染所所引引起起的的疫疫病病比比例例接接近近（约约各各占占30%30%），而而其其中中因因微微生生物物污污染染引引起起的的食食源源性性疾疾病病比比例例接接近近40%40%，远远高高于于化化学学性性食食物物中中毒毒（20%20%）。综综观观国国内内外外食食源源性性疾疾病病的的发发病病情情况况，动动物物性性食食品品中中微微生生物物污污染染是是人类食源性疾病的主要问题。人类食源性疾病的主要问题。 2014年2月19日
3、,国家食品安全风险评估中心,牵头起草的食品中致病菌限量标准，将自2014年7月1日起实施。该标准对肉制品、水产制品、粮食制品、即食果蔬制品、饮料等11大类食品分别制定了沙门氏菌等5种致病菌的限量规定，可基本满足我国食品中致病菌的控制需求，适应我国食品安全的监管需要。动物性食品易被微生物污染的原因1 食品基质 水分、丰富的营养物质2 食品的酸性3 环境条件：温度、气体、湿度动物性食品中微生物污染的可能途径主要有：动物性食品中微生物污染的可能途径主要有：食品原料本身的污染；食品原料本身的污染；动物养殖环境中的微生物对食品原料的污染；动物养殖环境中的微生物对食品原料的污染；屠宰过程中的污染；屠宰过程
4、中的污染；深加工动物食品可能受到加工车间、加工设备表面残存微深加工动物食品可能受到加工车间、加工设备表面残存微生物污染；生物污染；食品从加工出厂、贮存、运输、销售过程中可以受到相应食品从加工出厂、贮存、运输、销售过程中可以受到相应环境中微生物的污染；环境中微生物的污染；在家庭、宾馆等厨房中生熟食品的交叉污染。在家庭、宾馆等厨房中生熟食品的交叉污染。食品微生物检测所涉及的类群食品微生物检测所涉及的类群微生物非细胞生物细胞生物病毒原核生物真核生物细菌酵母菌、霉菌 微生物检测程序微生物检测程序 样品的采集样品的采集注意：注意：1 所用接触样品的用具经过所用接触样品的用具经过灭菌灭菌 2 取样要均匀、
5、特殊样品要取样要均匀、特殊样品要控制温度控制温度 3 样品采好后要贴上标签样品采好后要贴上标签（注明：样品名称、来源、（注明：样品名称、来源、数量、采样人、地点及时数量、采样人、地点及时间）间）样品的微生物检验样品的微生物检验注意：注意：1 采好的样品送检不采好的样品送检不要超过要超过3小时小时2 检完的样品的存放检完的样品的存放时间时间 3 报告的填写报告的填写 微生物对食品的污染问题是我国乃至全世微生物对食品的污染问题是我国乃至全世界食品安全中最突出的问题，我国为此数次颁界食品安全中最突出的问题，我国为此数次颁布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标
6、准要求，准要求，菌落总数和大肠菌群菌落总数和大肠菌群是食品企业出厂是食品企业出厂时必检的微生物指标。时必检的微生物指标。菌落总数菌落总数是指一定培养条件下（如需氧状况、培养基成是指一定培养条件下（如需氧状况、培养基成分、分、PH、培养温度和时间等）每克（每毫升）食品样品中所、培养温度和时间等）每克（每毫升）食品样品中所生长出来的细菌菌落总数。生长出来的细菌菌落总数。检测菌落总数，检测菌落总数，可以判定食品被细菌污染可以判定食品被细菌污染程度，反映出食品的新鲜程度和卫生状况程度，反映出食品的新鲜程度和卫生状况。如果某食品的菌落总数严重超标，说明其产如果某食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状
7、况达不到基本的卫生要求，食品品的卫生状况达不到基本的卫生要求，食品将加速腐败变质，失去食用价值。将加速腐败变质，失去食用价值。小型企业，原料控制，加工车间控制不严小型企业，原料控制，加工车间控制不严第一节第一节 动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验 菌落总数的检验程序菌落总数的检验程序25g(ml)样品+225ml生理盐水(1:10的稀释液)作几个适当倍数的稀释液(例如1:100，1:1000)选择23个适宜稀释度各取1ml分别加入灭菌培养皿中每个平皿中加适量（1520ml）营养琼脂菌落记数 注意事项：注意事项：1 操作要在无菌的状态下进行。操作要在无菌的状
8、态下进行。2 操作时间越短越好。操作时间越短越好。3 样品不同选择的稀释倍数不同。样品不同选择的稀释倍数不同。4 培养基冷却温度不宜过高或过低。培养基冷却温度不宜过高或过低。大肠菌群系指一群能发酵乳大肠菌群系指一群能发酵乳糖、需氧和兼性厌氧的革兰糖、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括肠氏阴性无芽孢杆菌，包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬杆菌属、肠杆菌属和克杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属细菌。雷伯菌属细菌。检测大肠菌群，检测大肠菌群，可以判定食品被与粪便污染有关的细菌可以判定食品被与粪便污染有关的细菌污染的程度。污染的程度。如果某食品的大肠菌群超标，则可以推测其
9、产如果某食品的大肠菌群超标，则可以推测其产品中存在着肠道致病菌污染的可能性，食用之可能导致食物品中存在着肠道致病菌污染的可能性，食用之可能导致食物中毒或罹患流行病。中毒或罹患流行病。第二节第二节 动物性食品中致病性细菌的检验动物性食品中致病性细菌的检验沙门氏菌沙门氏菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌副溶血弧菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌溶血性链球菌溶血性链球菌产单核细胞李斯特菌产单核细胞李斯特菌肉毒梭菌肉毒梭菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌空肠弯曲杆菌空肠弯曲杆菌炭疽杆菌炭疽杆菌产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌变形杆菌变形杆菌动物性食品中沙门氏菌的检验动物性食品中沙门氏菌的检验
10、一、教学目的一、教学目的1 1、掌握食品中沙门氏菌的检验原理。、掌握食品中沙门氏菌的检验原理。2 2、掌握食品中沙门氏菌的检验方法。、掌握食品中沙门氏菌的检验方法。1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位 二、实验原理二、实验原理（一）沙门氏菌属简介（一）沙
11、门氏菌属简介沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现原结构复杂，现已发现20002000多个血清型，我国已发现血清多个血清型，我国已发现血清型近型近200200个。个。沙门氏菌在水中不易繁殖，但可生存沙门氏菌在水中不易繁殖，但可生存2-32-3周，周，冰箱中可生冰箱中可生存存3-43-4个月个月，在自然环境的粪便中可存活，在自然环境的粪便中可存活1-21-2个月。沙门氏个月。沙门氏菌最适繁殖温度为菌最适繁殖温度为37
12、37，在，在2020以上即能大量繁殖，因此，以上即能大量繁殖，因此，低温储存低温储存食品是一项重要预防措施。食品是一项重要预防措施。沙门氏菌属沙门氏菌属生物学特性生物学特性形态特征：形态特征： 革革 兰兰 氏氏 阴阴 性性 ， 大大 小小 为为 1-1-3 30.4-0.9m0.4-0.9m的的两两端端钝钝圆圆的的短短杆杆菌菌，无无芽芽孢孢，一一般般无无荚荚膜膜，除除鸡鸡沙沙门门氏氏菌菌和和雏雏沙沙门门氏氏菌菌以以外外，都都有有周周身身鞭鞭毛毛，运动力强。运动力强。培养特性：培养特性：沙门氏菌沙门氏菌需氧或兼性厌氧需氧或兼性厌氧，10104242都可生长，最适生长都可生长，最适生长温度为温度为
13、3737，最适，最适pHpH为为6.86.87.87.8。营养琼脂平板上：营养琼脂平板上：35353737培养培养18-24h18-24h，其菌落大小一般，其菌落大小一般为为2 23mm3mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。血平板上：中等大小的灰白色菌落。血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：生化特性：l l绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。 沙门氏菌属沙门氏菌属致病
14、性致病性v沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，潜伏期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般12天或更长。感染剂量为1520个菌，死亡率达14%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。v污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。传播途径传播途径
15、肉的污染肉的污染肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20%25%、英国为9.9%、日本检查进口家禽的污染率为10.3%，国内肉类沙门氏菌检出率在1.1%39.5%。蛋的污染蛋的污染中国蛋及其制品沙门氏菌检出率为3.9%-43.7%，由于吃蛋引起鼠伤寒病的病例报告逐渐有增加的趋势。环境污染环境污染食品在加工、运输、出售过程中往往被沙门氏菌污染。沙门氏菌在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至2年之久。 2013年6月10日，广东东莞某工厂爆发大规模的员工食物中毒事件，100多名员工出现发冷、高热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不适症状； 13日，四川眉山市一所学校386人陆续出现发烧、腹泻、呕吐症状入院救治
16、；15日，广州经济技术开发区一家包装厂76名夜班工人纷纷出现上吐下泻和发烧症状。 实验证明，沙门氏菌中毒的原因大多是因为食前未加热处理或加热不彻底。其实，沙门氏菌属在100时立即死亡，70经5分种，65经1520分钟，60经1小时可被杀死。2011-08-05 ，美国最大的肉类加工巨头嘉吉公司3日晚召回3600万磅，即大约1.63万吨火鸡肉。这为美国史上最大规模的召回事件。目前，美国26个州已有77人感染沙门氏菌，其中一人死亡 。不过，美国多名政府官员介绍，即使确认火鸡肉受沙门氏菌污染，只要烹饪达到74摄氏度，仍可放心食用。 （二）检验（二）检验 GB/T 4789.4-20031.1.前增菌
17、前增菌: : 第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中( (缓冲蛋白胨水）缓冲蛋白胨水）增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。2.2.选择性增菌选择性增菌: : 在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。3.3.选择性平板分离选择性平板分离: : 这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏
18、菌的生长，这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。4.4.生物化学筛选生物化学筛选: : 排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。步鉴定。5.5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。 三、实验仪器和材料三、实验仪器和材料1 1冰箱：冰箱：0044。2 2恒温培养箱：恒温培养箱：363611，4242。3 3显微镜：显微镜：1010100100。4 4高压灭菌器。高压灭菌器。5 5 超净工作台。超净工作台
19、。6 6 均质器或灭菌乳钵。均质器或灭菌乳钵。7 7 架盘药物天平：架盘药物天平：0g0g500g,500g,精确度精确度0.5g0.5g。8 8 灭菌广口瓶：灭菌广口瓶：500mL500mL。9 9 灭菌锥形瓶：灭菌锥形瓶：500mL500mL、250mL250mL。10 10 灭菌吸管：灭菌吸管：10mL10mL（具（具0.1 mL0.1 mL刻度）。刻度）。11 11 天菌培养皿：天菌培养皿：90mm90mm。12 12 灭菌小试管：内径灭菌小试管：内径3mm3mm50mm50mm。13 13 灭菌毛细管。灭菌毛细管。 四、培养基和试剂四、培养基和试剂1 1缓冲蛋白胨水缓冲蛋白胨水(BP
20、)(BP)2 2氯化镁孔雀绿氯化镁孔雀绿(MM)(MM)增菌液增菌液3 3四硫酸钠煌绿四硫酸钠煌绿(TTB)(TTB)增菌液增菌液4 4亚硒酸盐胱氨酸亚硒酸盐胱氨酸(SC)(SC)增菌液增菌液5 5亚硫酸铋琼脂亚硫酸铋琼脂(BS)(BS)6 6DHLDHL琼脂琼脂7 7HEHE琼脂：按琼脂：按GB/T 4789.28GB/T 4789.2820032003中中4.214.21规定。规定。8 8TSITSI琼脂琼脂9 9蛋白胨水、靛基质试剂蛋白胨水、靛基质试剂10 10 尿素琼脂尿素琼脂(pH7.2)(pH7.2)11 11 氨基酸脱羧酶试验培养基氨基酸脱羧酶试验培养基12 12 沙门氏菌因子血
21、清：按沙门氏菌因子血清：按2626种用于初步分型；种用于初步分型；5757种用于进一步分型；种用于进一步分型；163163种用于详细分型。种用于详细分型。五、检验样品五、检验样品1 1 鲜猪肉、鲜牛肉；冻猪肉鲜猪肉、鲜牛肉；冻猪肉2 2 鲜牛奶、鲜鱼；冻鱼鲜牛奶、鲜鱼；冻鱼3 3 香肠、虾仁香肠、虾仁六、沙门氏菌检验流程六、沙门氏菌检验流程 检样检样 前增菌法前增菌法 直接增菌法直接增菌法 冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品 鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品 25g 25g BP 225mLBP 225mL 25g 25g 灭菌
22、生理盐水灭菌生理盐水25mL 25mL 制成检样均质液制成检样均质液 （36361 1） 一般一般 4 h4 h，干蛋品，干蛋品 181824 h24 h10mL10mLMM(MM(或或TTB)100mLTTB)100mL 10mL10mLSC 100mLSC 100mL 检样均质液的半量检样均质液的半量MM(MM(或或TTB)100mLTTB)100mL 检样均质液的半量检样均质液的半量SC 100mL SC 100mL 42 18 42 1824 h 24 h （36361 1） 181824 h 42 1824 h 42 1824 h 24 h （36361 1） 181824 h24
23、h BS BS DHL( DHL(或或HEHE、WSWS、SS)SS) （36361 1） 404048 h 48 h （36361 1） 181824 h 24 h 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 TSITSI（斜面、底层、产气、（斜面、底层、产气、H H2 2S S）、蛋白胨水（靛基质）、尿素（）、蛋白胨水（靛基质）、尿素（pH7.2pH7.2）、）、KCNKCN、赖氨酸、赖氨酸 H H2 2S S靛基质靛基质 H H2 2S S靛基质靛基质 H H2 2S S靛基质靛基质 非如左述的非如左述的 尿素尿素KCNKCN赖氨酸赖氨酸 尿素尿素KCNKCN赖氨酸赖氨酸 尿素尿素KCNKCN赖氨酸赖氨酸
24、/ / 各种反应结果各种反应结果 甘露醇、山梨醇甘露醇、山梨醇 ONPGONPG 沙门氏菌血清学实验沙门氏菌血清学实验 沙门氏菌血清学实验沙门氏菌血清学实验 非沙门氏菌非沙门氏菌 非沙门氏菌非沙门氏菌 报告报告 七、操作步骤七、操作步骤 1 1、前增菌和增菌、前增菌和增菌 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取均应经过前增菌。以无菌操作取25g25g（mLmL），加在装有），加在装有225mL225mL缓冲蛋白胨水的缓冲蛋白胨水的500mL500mL广口瓶内。固体食品可先广口瓶内。固体食品可先应用均质器以应用均质器以80008000 10000
25、r/min10000r/min打碎打碎1min1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于363611培养培养4h (4h (干蛋品培养干蛋品培养18h18h24h)24h)，移取，移取10mL10mL，转种于，转种于100mL100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于内，于4242培养培养18h18h 24h24h。同时，另取。同时，另取10mL10mL，转种于，转种于100mL100mL亚硒酸盐胱氨亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于酸增菌液内，于363611培养培养
26、18h18h24h24h。 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。不必经过前增菌。各取各取25g(25mL)25g(25mL)加入灭菌生理盐水加入灭菌生理盐水25mL25mL，按前法做成检样匀，按前法做成检样匀液；取液；取25mL25mL，接种于，接种于100mL100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于钠煌绿增菌液内，于4242培养培养24h24h；另取；另取25mL25mL接种于接种于100mL100mL亚亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于硒酸盐胱氨酸增菌液内，于363611培养培养18h18h24h24h
27、。 2 2、分离、分离 取增菌液取增菌液1 1环，划线接种于一个亚硫酸铋环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个琼脂平板和一个DHLDHL琼脂平板琼脂平板( (或或HEHE琼脂平板、琼脂平板、WSWS或或SSSS琼脂平板琼脂平板) )。两种增菌液可同时划线接。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于种在同一个平板上。于363611分别培养分别培养18h18h24h(DHL24h(DHL、HEHE、WSWS、SS)SS)或或40h40h48h(BS)48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落。，观察各个平板上生长的菌落。 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征沙门氏菌属各群在各种选择性琼
28、脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板选择性琼脂平板沙门氏菌沙门氏菌、沙门氏菌沙门氏菌（即亚利桑那菌）（即亚利桑那菌） BS BS琼脂琼脂产硫化氢菌落为黑色带有金属光泽，棕产硫化氢菌落为黑色带有金属光泽，棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变灰绿色的菌落，周围培养基不变黑色带有金属光泽黑色带有金属光泽 DHL DHL琼脂琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属
29、属、相同；乳相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色黑色 HE HE琼脂琼脂 WSWS琼脂琼脂蓝绿色或蓝色；多数菌株产硫化氢，菌蓝绿色或蓝色；多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色中心黑色或几乎全黑色 SS SS琼脂琼脂无色半透明，产硫化氢菌株，有的菌落无色半透明，产硫化氢菌株，有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显中心带黑色，但不如以上培养基明显乳糖迟
30、缓阳性或阴性的菌株与亚乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属属、相同；乳相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形成时与大肠色，但中心无黑色形成时与大肠埃希氏菌不能区别埃希氏菌不能区别 3 3、生化试验、生化试验 自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂、蛋白陈水糖铁琼脂、蛋白陈水( (供做靛基质试验供做靛基质试验) )、尿素琼脂、尿素琼脂(pH7.2)(pH7.2)、氰化钾氰化钾(KCN)(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各各1 1管
31、，于管，于363611培养培养18h18h24h24h，必要时可延长至，必要时可延长至48h48h，按，按生化反应初步鉴定表判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属生化反应初步鉴定表判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于的结果应属于A1A1、A2A2和和B1B1，其他，其他5 5种反应结果均可以排除。种反应结果均可以排除。 肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 斜面斜面底层底层产气产气硫化氢硫化氢可能的菌属和种可能的菌属和种/ /沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌华氏菌/ /沙
32、门氏菌沙门氏菌、弗劳地氏柠檬酸、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌杆菌、普通变形杆菌沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属普罗菲登斯菌属伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属普罗菲登斯菌属/ /大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌劳地氏柠檬酸杆菌注：阳性；阴性；注：阳性；阴性；/ / 多数阳性，少数阴性多
33、数阳性，少数阴性肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 反应序号反应序号硫化氢硫化氢（H H2 2S S）靛基质靛基质pH7.2pH7.2尿素尿素氰化钾氰化钾（KCNKCN）赖氨酸脱羧酶赖氨酸脱羧酶判定结果判定结果A1A1沙门氏菌属沙门氏菌属A2A2沙门氏菌属（少见）缓慢爱沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌德华氏菌A3A3弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌变形杆菌A4A4普通变形杆菌普通变形杆菌B1B1沙门氏菌属、大肠埃希氏沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌菌、甲型副伤寒沙门氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B2B2大肠埃希
34、氏菌大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3B3/ /克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4B4/ /摩根氏菌，普罗菲登斯菌属摩根氏菌，普罗菲登斯菌属注注1 1：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。注注2 2：KCNKCN和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。注注3 3：表示阳性；表示阴性；：表示阳性；表示阴性；/ /表示多数阳性，少数阴性。表
35、示多数阳性，少数阴性。沙门氏菌检验沙门氏菌检验几点注意几点注意冷冷冻冻样样品品解解冻冻需需在在4545以以下下，有有自自动动调调温温器器自自控控的的水水浴浴锅锅内内不不断断搅搅拌拌进进行行15min15min或在或在2-82-8，1818小时内软化。小时内软化。l为为保保证证检检验验的的准准确确性性，必必须须在在选选择择性性培培养养基基上上挑挑取取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。进进行行生生化化反反应应时时，应应以以纯纯培培养养物物进进行行试试验验，如如出出现现血血清清学学阳阳性性，而而生生化化反反应应特特征征不不符符合合时时，应应对对接接种种物物进进行
36、行纯纯化化，用用纯纯化化后后的的培培养养物物重重新新进进行行生化试验。生化试验。l测试中应同时接种阳性对照菌株。测试中应同时接种阳性对照菌株。金黄色葡萄球菌细菌学及其检验 v自然分布： 金黄色葡萄球菌分布广泛，存在于环境、空气、水、牛奶、食品、污水及人和动物等。与人关系密切，构成人体皮肤、鼻腔、咽部等处的正常细菌群，对人有致病性，是临床医学中常见的化脓性球菌之一，也是污染食品造成食物中毒的细菌之一。1 生物学性状 形形态态与与染染色色：典典型型金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌呈呈球球形形，直直径径0.51.0微微米米，较较非非致致病病性性葡葡萄萄球球菌菌略略小小，各各个个菌菌体体的的大大小小及及排
37、排列列较较整整齐齐。细细菌菌繁繁殖殖时时呈呈多多个个平平面面的的不不规规则则分分裂裂，堆堆积积成成葡葡萄萄串串状状排排列列。在在脓脓汁汁或或液液体体培培养养基基中中生生长长，常常呈呈双双球球或或短短链链排排列列，易易误误为为链链球球菌菌。金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌无无鞭鞭毛毛，故故不不能能自自由由移移动动，一一般般不不形形成成荚荚膜膜，不不产产生生芽芽孢孢。革革兰兰氏氏染染色色为为阳阳性性，衰衰老老、死死亡亡或或被被白白细细胞胞吞吞噬噬的的菌菌体体，常常转转呈呈革革兰兰氏氏阴阴性性，故故须须注意。注意。培培养养特特性性：本本菌菌为为需需氧氧或或兼兼性性厌厌氧氧，对对营营养养要要求求不不高高，
38、在在普普通通培培养养基基上上生生长长良良好好，最最适适宜宜生生长长温温度度为为37，最最适适宜宜pH为为7.4，耐耐盐盐性性强强，在在含含10-15%氯氯化化钠钠培培养养基基中中能能生生长长，利利用用这这一特性，可有利于金葡菌的检出。一特性，可有利于金葡菌的检出。在普通琼脂培养基上形成圆形、凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明的菌落。直径一般为1-2mm，密集生长的菌落较小，稀散或生长较久着， 直径可达4-5mm。在普通肉汤培养基中生长迅速，一般呈均匀混浊生长，如培养基中的糖类被分解后，产生较多的酸性物质即可发生酸性沉淀。培养时间较长，2-3日后常有菌膜形成而出现粘性沉淀在在血血琼琼脂脂平平
39、板板上上形形成成较较大大菌菌落落，有有色色素素产产生生，由由于于本本菌菌产产生生的的色色素素为为脂脂溶溶性性不不溶溶于于水水，故故色色素素只只局局限限于于菌菌落落内内，不不透透入入培培养养基基中中。该该菌菌产产生生溶溶血血毒毒素素，使使菌菌落落周周围围红红细细胞胞溶溶解解而而形形成成透透明明的的溶溶血血环环，非致病性葡萄球菌无此现象。非致病性葡萄球菌无此现象。 在在Bairdparker琼琼脂脂平平板板上上，菌菌落落呈呈圆圆形形凸凸起起，表表面面光光滑滑湿湿润润，直直径径23mm，灰灰黑黑色色至至黑黑色色，有有光光泽泽，常常有有浅浅色色的的边边缘缘，周周围围绕绕以以不不透透明明圈圈，其其外外常
40、常有有一一清清晰晰带带，菌菌落落有有黄黄油油样样粘粘稠稠感感。从从长长期期贮贮存存的的冷冷冻冻或或脱脱水水食食品品中中分分离离的的菌菌落落，其其黑黑色色常常较较典典型型菌菌落落浅浅些些，且且外外观可能较粗糙，质地较干燥。观可能较粗糙，质地较干燥。抵抵抗抗力力：葡葡萄萄球球菌菌抵抵抗抗力力较较强强，在在干干燥燥的的脓脓汁汁中中能能存存活活数数月月，有有些些菌菌株株需需加加热热803060分分钟钟才才被被杀杀死死。在在5%石石炭炭酸酸中中15分分钟死亡。钟死亡。2 致病性致病性金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌为为潜潜在在性性的的病病原原菌菌，它它所所产产生生的的多多种种胞胞外外蛋蛋白白质质对对人人和和
41、动动物物组组织织有有害害，其其中中一一类类是是各各种种酶酶类类，如如脂脂酶酶、蛋蛋白白酶酶、青青霉霉素素酶酶、凝凝固固酶酶和和耐耐热热DNA酶酶等等，另另一一类类为为毒毒素素，它它们们是是溶溶血血素素（、）、溶溶白白细细胞胞素素、肠肠毒毒素素（A、B、C、D、E、TSS）及及化脓性毒素等。化脓性毒素等。 2 致病性致病性 虽虽然然人人体体对对金金葡葡菌菌感感染染具具有有一一定定的的抵抵抗抗力力，但但当当机机体体抵抵抗抗力力下下降降或或皮皮肤肤粘粘膜膜受受损损时时易易被被感感染染，可可引引起起局局部部或或全全身身炎炎症症，侵侵入入血血流流可可引引起起败败血血症症及及脓脓毒毒血血症症。金金葡葡菌菌
42、污污染染食食品品之之后后可可能能产产生生大大量量的的肠肠毒毒素素，肠肠毒毒素素是是该该菌菌引引起起食物中毒的主要因素之一。食物中毒的主要因素之一。 金金葡葡菌菌肠肠毒毒素素具具有有极极强强的的稳稳定定性性，能能抵抵抗抗许许多多蛋蛋白白酶酶的的消消化化，只只有有在在小小于于pH2的的条条件件下下蛋蛋白白酶酶才才能能使使其其失失去去活活性性。这这一一点点可可以以解解释释，为为什什么么摄摄入入肠肠毒毒素素在在胃胃中中有有蛋蛋白白酶酶时时，仍仍然然引引起起食食物物中中毒毒，因因为为胃胃液液的的酸酸度度大大于于pH2，所所以以不不能能消消化化肠肠毒毒素素。肠肠毒毒素素还还相相当当耐耐热热，经经煮煮沸沸3
43、0分分钟钟后后仍仍不不能能完完全全破破坏坏其其毒毒性性。当当含含肠肠毒毒素素为为20/ml 的的牛牛肉肉汤汤（pH6.2），在在121 加热需要加热需要37分钟以上，才能灭活毒素。分钟以上，才能灭活毒素。 金金葡葡菌菌肠肠毒毒素素的的产产生生因因菌菌株株不不同同而而有有所所差差异异，有有资资料料显显示示，食食品品中中存存在在的的金金葡葡菌菌几几乎乎都都产产生生肠肠毒毒素素。以以往往认认为为凝凝固固酶酶阳阳性性的的金金葡葡菌菌能能产产生生肠肠毒毒素素，但但不不是是都都产产生生肠肠毒毒素素。后后有有实实验验证证实实，有有些些产产生生肠肠毒毒素素的的金金葡葡菌菌株株产产生生耐耐热热DNA酶酶却却不不
44、产产生生凝凝固固酶酶，即即一一些些凝凝固固酶酶阴阴性性菌菌株株也也产产生生肠肠毒毒素素，要要鉴鉴定定是是否否是是产产毒毒株株，需需同同时时进进行行凝凝固固酶酶和和耐耐热热DNA酶酶测测定定试试验验。而而耐耐热热DNA酶酶和和肠肠毒毒素素的的耐耐热热力力相相近近似似，由由此此可可见见耐耐热热DNA酶酶的的产产生生与与肠肠毒毒素素的的关关系系较较凝凝固固酶酶更更为为平平行行。所所以以常常用用耐耐热热DNA 酶酶试试验验代代替替肠肠毒毒素素测测定定。自自1982年年起起有有些些国国家家就就提提出出进进口口方方便便食食品品中中不不得得检检出出含含有有耐耐热热DNA酶酶的的金葡菌。金葡菌。“金球菌金球菌
45、”列为列为“极重要质量项目极重要质量项目”2011年11月，“思念”、“三全”和“湾仔码头”等国内速冻食品知名品牌相继被检出金黄色葡萄球菌超标后，使得速冻食品行业陷入“细菌门”。卫生部于2012年12月21日实施的速冻面米制品食品安全国家标准，将金黄色葡萄球菌检测由定性转向定量，规定每批产品抽检5个样品中，至多只能有1个样品每克生制品中检出的金黄色葡萄球菌含量在1000至10000个之间结核分枝杆菌分枝杆菌属分枝杆菌属Mycobacterium一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，可呈丝一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，可呈丝状或菌丝样生长。细胞壁脂质含量高（分枝菌酸），状或菌丝样生长。细
46、胞壁脂质含量高（分枝菌酸），耐酸，抗酸染色阳性。对氧和营养要求高，生长慢。耐酸，抗酸染色阳性。对氧和营养要求高，生长慢。不产生毒素和侵袭酶类，引起慢性疾病。不产生毒素和侵袭酶类，引起慢性疾病。又称又称抗酸杆菌抗酸杆菌(acid-fast bacillus)-不易着色，可抵抗盐酸酒精不易着色，可抵抗盐酸酒精的脱色作用的脱色作用分类属放线菌科，本属有分类属放线菌科，本属有80多种，可分三类：多种，可分三类： 结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。 细菌的细菌的DNA G+Cmol%为为6270 临床标本临床标本 抗酸染色抗酸染色+ L-J分离培养分
47、离培养 +7天天 +7天天 缓生菌缓生菌 速生菌速生菌 PNB + - - T2H + + - 非典型分枝杆菌非典型分枝杆菌 人型结核分枝杆菌人型结核分枝杆菌 牛型分枝杆菌牛型分枝杆菌 光反应性试验光反应性试验 光产色菌光产色菌 暗产色菌暗产色菌 不产色菌不产色菌 分枝杆菌的鉴定程序分枝杆菌的鉴定程序 结核分枝杆菌结核分枝杆菌一、分类一、分类结核分枝杆菌结核分枝杆菌（MycobacteriumMycobacteriumTuberculosisTuberculosis，TBTB）复合群：）复合群： 人结核分枝杆菌人结核分枝杆菌( (M.tM.tuberculosis)uberculosis) 牛
48、分枝杆菌牛分枝杆菌(M.bovis)(M.bovis) 非洲分枝杆菌非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌田鼠分枝杆菌二、细菌特性二、细菌特性形态染色形态染色 TBTB菌细长略弯曲，有时可见菌细长略弯曲，有时可见分枝分枝，呈单、成堆或，呈单、成堆或成束成束排列，无鞭毛、无排列，无鞭毛、无芽胞，芽胞，有荚膜有荚膜。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。TBTB菌菌革兰染色阳性革兰染色阳性。 培养特性培养特性 专性需氧菌专性需氧菌，3%3%5%5%的的CO2CO2能促
49、进生长。最适能促进生长。最适ph 6.56.8 ，最适温度为，最适温度为37，低于，低于3030难生长，难生长，营养要求高营养要求高，在，在含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长，且生长，且生长缓慢生长缓慢。 固体培养基固体培养基-典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、 乳酪色或淡黄色，乳酪色或淡黄色，形似菜花样形似菜花样形似菜花样形似菜花样。 液体培养基液体培养基-生长较快呈粗糙皱纹状菌膜生长，生长较快呈粗糙皱纹状菌膜生长，有毒株可有毒株可 呈索状生长呈索状生长（吐温干扰）（吐温干扰）。菜
50、花样菌落生化反应生化反应 生化不活泼。不发酵糖类，生化不活泼。不发酵糖类，多数菌株触酶阳性，热触酶多数菌株触酶阳性，热触酶阴性，非结核分枝杆菌正好相反。阴性，非结核分枝杆菌正好相反。结核分枝杆菌烟酸和硝酸盐试验阳性，耐噻吩结核分枝杆菌烟酸和硝酸盐试验阳性，耐噻吩2羧酸羧酸肼肼(T2H)，牛型则相反。有毒株中性红试验阳性。，牛型则相反。有毒株中性红试验阳性。变异性变异性 TB菌易发生形态、菌落、最适生长温度、毒力和耐药性的变异。如菌易发生形态、菌落、最适生长温度、毒力和耐药性的变异。如卡介苗、卡介苗、Much颗粒和多重耐药菌株出现等。颗粒和多重耐药菌株出现等。抵抗力抵抗力 TBTB菌细胞壁含大量
51、脂类，抵抗力较强菌细胞壁含大量脂类，抵抗力较强 干痰中存活干痰中存活6-86-8个月，粘附尘埃上保持传染性个月，粘附尘埃上保持传染性8-108-10天。天。 3%HCL或或4%NaOH、6%H2SO4溶液中能耐受溶液中能耐受3030分钟分钟 常以常以酸碱中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质酸碱中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质，提高检出率提高检出率 对一定浓度的孔雀绿有抵抗力。对一定浓度的孔雀绿有抵抗力。 对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。 ( (如在液体中加热如在液体中加热6030分钟，直射日光下分钟，直射日光下23小时，小时，75%酒酒精
52、内数分钟即死亡。精内数分钟即死亡。) )三、临床意义三、临床意义TBTB菌引起结核病。菌引起结核病。对人类致病的有人结核分枝杆菌、牛型结核杆菌和对人类致病的有人结核分枝杆菌、牛型结核杆菌和非洲分枝杆菌，人型结核杆菌感染引起的发病率最高。成为全球性重非洲分枝杆菌，人型结核杆菌感染引起的发病率最高。成为全球性重大公共卫生问题。大公共卫生问题。所致疾病所致疾病TBTB菌的致病作用可能是细菌在细胞内增殖引起炎症反应，以菌的致病作用可能是细菌在细胞内增殖引起炎症反应，以及诱导机体产生免疫反应性损伤有关。通过呼吸道、消化道及诱导机体产生免疫反应性损伤有关。通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多
53、种组织器官，引起相应和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官，其中以肺结核最常见。可分原发感染和继发感染。器官，其中以肺结核最常见。可分原发感染和继发感染。免疫性免疫性TBTB菌的感染率很高，发病率却较低，这表明人体感染结核杆菌的感染率很高，发病率却较低，这表明人体感染结核杆菌可获得一定的抗结核免疫力，这种免疫称为菌可获得一定的抗结核免疫力，这种免疫称为有菌免疫有菌免疫或传或传染性免疫。染性免疫。TBTB菌的免疫原菌的免疫原r rRNA和变应原结核菌素诱发机体和变应原结核菌素诱发机体产生由产生由T淋巴细胞介导细胞免疫反应。淋巴细胞介导细胞免疫反应。 致病物质致病物质1.1.脂质
54、脂质脂质占菌体干重的脂质占菌体干重的202040%40%，占胞壁干重的，占胞壁干重的60%60%。磷脂磷脂：能刺激：能刺激单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶形成干酷样坏死。单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶形成干酷样坏死。 索状因子索状因子：是分枝菌酸与海藻糖的复合物，具有破坏细胞线粒体膜，：是分枝菌酸与海藻糖的复合物，具有破坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞游走和吞噬作用，引起慢性肉牙肿。毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞游走和吞噬作用，引起慢性肉牙肿。具有该物质的具有该物质的TBTB菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状。
55、蜡质蜡质D D：是一种肽糖脂与分枝菌酸复合物，能：是一种肽糖脂与分枝菌酸复合物，能引起迟发型变态反应引起迟发型变态反应，并具有佐剂作用。并具有佐剂作用。 硫酸脑苷脂硫酸脑苷脂：TBTB菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。2.2.荚膜荚膜主要为多糖，少量脂质和蛋白质。主要为多糖，少量脂质和蛋白质。 粘附和入侵粘附和入侵分解物质提供营养分解物质提供营养防止有害物质入侵防止有害物质入侵3.3.蛋白质蛋白质TBTB菌菌体内都含有数种蛋白质，其中重要的蛋菌菌体内都含有数种蛋白质，其
56、中重要的蛋白质是白质是结核菌素结核菌素。结核茵素与蜡质。结核茵素与蜡质D结合，能引起较强结合，能引起较强的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的抗体，但无保护作用。抗体，但无保护作用。 四、微生物学检验四、微生物学检验临床标本涂片检查分离培养核酸检测抗体检测直接涂片集菌涂片处理标本或无污染标本染色液体培养基固体培养基动物试验（罗氏或米氏）抗酸.金胺O. 37， 涂片镜检仪器培养 7天生长7天生长快速生长菌慢生长菌菌种鉴定抗酸染色菌落特点鉴定试验药敏试验 标本采集标本采集感染部位不同，取不同的标本，宜用能抑制污染菌的方法感染部位不同，取不同
57、的标本，宜用能抑制污染菌的方法常见标本：常见标本：痰、尿痰、尿、胸腹水等、胸腹水等检查方法检查方法1.1.显微镜检查显微镜检查1 1）直接涂片：用萋尼氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，通常应报）直接涂片：用萋尼氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，通常应报告：告：“查到抗酸性杆菌查到抗酸性杆菌”，需进一步分离培养鉴定。，需进一步分离培养鉴定。2 2）浓缩集菌涂片：如标本中菌量少，杂菌和杂质多时，用离心沉淀法）浓缩集菌涂片：如标本中菌量少，杂菌和杂质多时，用离心沉淀法将菌浓缩聚集，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查将菌浓缩聚集，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查 分离培养分离培养 TBTB菌接种菌接种前处理前处理液
58、化和处理杂菌液化和处理杂菌 4%NaOH4%NaOH、6%H6%H2 2SO4SO4、胰酶、胰酶 15-20min15-20min培养基选择培养基选择罗氏培养基罗氏培养基 鉴别培养基鉴别培养基(PNB(PNB、T T2 2H H、NAP)NAP)仪器培养仪器培养Bacte460Bacte460、BacT/ALERT3D BacT/ALERT3D 液体培养基液体培养基 培养时间培养时间长长 一般一般6-86-8周周 鉴定鉴定1.1.染色性染色性; 2.; 2.菌落特征菌落特征; 3.; 3.生长速度生长速度; 4.; 4.色素产生色素产生; 5.; 5.生生化试验化试验 鉴别试验鉴别试验： NA
59、P(p-nitro-acetylamino-hydroxy-propiophenome)抑制试验 结核分枝杆菌 NAP- 非结核分枝杆菌 NAP+ 免疫学检测免疫学检测 1.结核菌素试验结核菌素试验：OT或或PPD 迟发型超敏反应。迟发型超敏反应。2.全血干扰素测定全血干扰素测定3. 抗体检测抗体检测检测检测PPDIgGPPDIgG辅助诊断。目前辅助诊断。目前血清抗阿拉伯糖甘露糖脂血清抗阿拉伯糖甘露糖脂IgGIgG抗体是一种新的较好的诊断结核病的抗体是一种新的较好的诊断结核病的指标。指标。核酸检测核酸检测快速诊断快速诊断PCR-RFLPPCR-RFLP、PCR-SSCPPCR-SSCP、PCR
60、-PCR-核酸探针、核酸探针、PCR-PCR-核酸测序、多重核酸测序、多重PCRPCR、双重复插入序、双重复插入序列列PCRPCR等。等。色谱分析技术色谱分析技术测分枝菌酸测分枝菌酸 药物敏感试验药物敏感试验动物接种动物接种菌株分离和检测毒力结果分析与报告结果分析与报告 涂片镜检的报告方式涂片镜检的报告方式 非典型分枝杆菌指结核分枝杆菌与麻风杆菌以外的分枝杆菌指结核分枝杆菌与麻风杆菌以外的分枝杆菌 已发现已发现17种以上可引起人类疾病，在临床上难以与结种以上可引起人类疾病，在临床上难以与结核分枝杆菌感染区别核分枝杆菌感染区别分类分类光产色菌：暗处不产色素，光照后产色素光产色菌：暗处不产色素，光
61、照后产色素暗产色菌：有光或无光均产色素暗产色菌：有光或无光均产色素不产色菌：有光或无光均不产色素不产色菌：有光或无光均不产色素迅速生长菌：普通培养基上生长迅速生长菌：普通培养基上生长 3-6天天光产色菌光产色菌 堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌暗产色菌暗产色菌 瘰痢分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌不产色菌不产色菌 鸟-胞内复合分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾分枝杆菌迅速生长菌迅速生长菌 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌第三节第三节动物性食品中致病性病毒的检验动物性食品中致病性病毒的检验口蹄疫病毒口蹄疫病毒流行性感冒病毒流行性感冒病毒禽流感病毒禽流感病毒猪瘟病毒猪瘟病毒新城疫病毒新城疫病毒马立克氏病病毒马立克氏
62、病病毒朊病毒朊病毒冠状病毒冠状病毒口蹄疫病毒检验口蹄疫病毒检验口蹄疫病毒口蹄疫病毒(Foodandmouthdiseasevirus，FMDV)是牛、猪、是牛、猪、羊等偶蹄动物口蹄疫的病原。羊等偶蹄动物口蹄疫的病原。是全球性最重要的动物健康问题之一。是全球性最重要的动物健康问题之一。1898年，德国科学家年，德国科学家Loeffler与与Frosch发现口蹄疫病畜的病料通过滤菌器后发现口蹄疫病畜的病料通过滤菌器后仍能仍能使健康动物发病。使健康动物发病。一、生物学特性一、生物学特性口蹄疫病毒属于：微口蹄疫病毒属于：微RNA病毒科病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒口蹄疫病毒属属(Ap
63、hthovirus)，属内只有口蹄疫病毒一种。二十面体对称，属内只有口蹄疫病毒一种。二十面体对称，直径直径2025nm，无囊膜，病毒基因组为单股正链，无囊膜，病毒基因组为单股正链RNA，在，在RNA芯髓外对称衣壳上有芯髓外对称衣壳上有32个壳粒。电镜下，可见病毒粒子个壳粒。电镜下，可见病毒粒子表面的颗粒状结构和一个密度较低的中心。此外尚可见有较表面的颗粒状结构和一个密度较低的中心。此外尚可见有较小的蛋白质亚单位颗粒，直径小的蛋白质亚单位颗粒，直径78nm，无感染性。病毒子在，无感染性。病毒子在宿主细胞浆内可形成晶格状排列。本病毒是动物病毒中发现宿主细胞浆内可形成晶格状排列。本病毒是动物病毒中发
64、现最早的一种。最早的一种。二、抵抗力二、抵抗力对酸敏感，病毒在对酸敏感，病毒在pH为为6.5的缓冲液中、的缓冲液中、4条件下条件下14h灭活灭活90，在，在pH5.5时时1min灭活灭活90，在，在pH5.0时每秒钟灭活时每秒钟灭活90，pH3.0时瞬间灭活，病毒在时瞬间灭活，病毒在pH7.07.5时十分稳定。病时十分稳定。病毒的感染性毒的感染性RNA在在pH4.0时较原病毒稳定。口蹄疫病毒对碱时较原病毒稳定。口蹄疫病毒对碱也很敏感。对消毒剂的抵抗力较强。病毒在低温下能长期也很敏感。对消毒剂的抵抗力较强。病毒在低温下能长期保存。病毒的灭活温度为保存。病毒的灭活温度为851min，7010min
65、，6015min，但裸露的，但裸露的RNA对热较稳定。对热较稳定。三、抗原性三、抗原性根据病毒的血清学特征，目前已知口蹄疫病毒有七个根据病毒的血清学特征，目前已知口蹄疫病毒有七个主型：主型：A、O、C、南非、南非、南非、南非、南非、南非和亚洲和亚洲型型(SAT1、SAT2、SAT3、Asia1)。各型之间没有相互免。各型之间没有相互免疫作用。疫作用。本病毒有较大的变异性，病毒在保存和流行中，常发本病毒有较大的变异性，病毒在保存和流行中，常发生血清学的变异，有时流行初期与末期毒型不一致，生血清学的变异，有时流行初期与末期毒型不一致，几乎每年都有新的亚型出现，本病毒已发现几乎每年都有新的亚型出现，
66、本病毒已发现85个以上个以上的亚型。的亚型。四、培养特性四、培养特性1组织培养组织培养利用犊牛、幼猪的肾脏或豚鼠、牛胚胎上皮组织制成细胞利用犊牛、幼猪的肾脏或豚鼠、牛胚胎上皮组织制成细胞单层来培养病毒，病毒繁殖后，使细胞发生病变。单层来培养病毒，病毒繁殖后，使细胞发生病变。2鸡胚培养鸡胚培养本病毒不易在鸡胚上生长，必须反复交替通过牛与鸡胚或本病毒不易在鸡胚上生长，必须反复交替通过牛与鸡胚或在添有牛舌上皮的鸡胚组织培养继代后，才可能适应于鸡胚或鸡胚组织在添有牛舌上皮的鸡胚组织培养继代后，才可能适应于鸡胚或鸡胚组织培养。培养。在感染了口蹄疫病毒的细胞培养液中，有大小不同的在感染了口蹄疫病毒的细胞培
67、养液中，有大小不同的4种粒子：最大的种粒子：最大的粒子为完整病毒；第二种为不含粒子为完整病毒；第二种为不含RNA的空衣壳；第三种为衣壳蛋白亚单的空衣壳；第三种为衣壳蛋白亚单位；第四种是病毒感染相关抗原。位；第四种是病毒感染相关抗原。五、致病性五、致病性在自然条件下，主要发生于偶蹄兽，其中以奶牛和黄牛最易感，其次是在自然条件下，主要发生于偶蹄兽，其中以奶牛和黄牛最易感，其次是水牛，牦牛、猪，再次为羊和骆驼等。野生偶蹄兽也能发生。从流行病水牛，牦牛、猪，再次为羊和骆驼等。野生偶蹄兽也能发生。从流行病学的观点来看，绵羊是本病的学的观点来看，绵羊是本病的“储存器储存器”，猪是，猪是“扩大器扩大器”，牛
68、是，牛是“指指示器示器”。1.传播途径传播途径:呼吸道、消化道呼吸道、消化道(被污染的饲料、饮水被污染的饲料、饮水)；创伤、皮肤、粘膜；创伤、皮肤、粘膜2.流行特点：有一定的季节性流行特点：有一定的季节性(以冬、春季节发病较多，夏季可以平息以冬、春季节发病较多，夏季可以平息),传播迅速传播迅速,一般沿交通线进行传播。一般沿交通线进行传播。六、微生物学诊断六、微生物学诊断(一一)豚鼠接种试验豚鼠接种试验选择选择500g以上的健康豚鼠以上的健康豚鼠46只，剪去后肢足掌部只，剪去后肢足掌部被毛，用湿棉花球洗净，再用被毛，用湿棉花球洗净，再用70酒精棉消毒。将足掌部皮肤或口腔粘酒精棉消毒。将足掌部皮肤
69、或口腔粘膜划破，把感染性病料涂擦于划破处。第二天如局部有水疱，即可确诊。膜划破，把感染性病料涂擦于划破处。第二天如局部有水疱，即可确诊。(二二)乳鼠接种试验乳鼠接种试验选选27日龄乳鼠日龄乳鼠5只，只，4只做检样，只做检样，1只做对照，每只只做对照，每只颈背部皮下接种颈背部皮下接种0.1ml，观察，观察1周，如有死鼠周，如有死鼠,及时取出，制备及时取出，制备1:3检样，检样，传代。如无死鼠取活鼠冻死传代，传传代。如无死鼠取活鼠冻死传代，传2-3代不死亡为阴性。代不死亡为阴性。接种乳鼠：呼吸急促，四肢和全身麻痹接种乳鼠：呼吸急促，四肢和全身麻痹禽流感病毒禽流感： 是野生鸟类和家禽感染了一种甲型流
70、感病毒，即禽流感病毒以后引起的以体温升高、打喷嚏、头部水肿、呼吸困难、产蛋率明显减少、腹泻等症状呼吸道传染病。被国际兽疫局定为甲类传染病，由称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按病原体不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。一、定 义禽流感：1878年，意大利发生鸡群大量死亡（鸡瘟的由来），1955 年证实其致病病毒为甲型流感病毒。此后，这种疾病被更 名为禽流感19831984在美国、19921995在墨西哥、19992001在 意大利均发生禽流感的爆发流行1997年香港发生了禽流感流行，150万鸡被宰杀，病毒为 H5N12003年月荷兰发生禽流感病毒H7N7流行2003年12月5日禽流感在韩
71、国爆发，疫情蔓延迅速，至今 该病毒已经在亚洲10个国家和地区出现过不同程度的流行 二、历史回顾 流 感 病 毒 属 于 正 粘 病 毒（Orthomyxovirus），大多呈球形颗粒状。正、副粘病毒的区别是以其核酸是否分节段为标准，分节段者为正粘病毒，不分节段者为副粘病毒。事实上，正粘病毒只有流行性感冒病毒一种。三、流感病毒结构： 病毒的直径为80120nm，内有一直径约为70nm 的电子致密核心，是病毒的核衣壳。流感病毒的结构主要包括内部的核心（即核衣壳）和外面的包膜（即病毒囊膜）两部分。核酸为单股负链RNA，甲、乙型流感病毒为8 个节段，丙型为7个节段，每一个节段就是一个基因， 决定流感病
72、毒的遗传特性。根据核蛋白抗原性的不同，可把感染人的流感病毒分为甲、乙、丙三型。 三、流感病毒灭活：经过56，30分钟、60，10分钟处理均 会丧失活性；加热到6570时只要2 分钟即失活对紫外线敏感，用紫外线直接照射病毒可 以依次破坏其感染力、血凝素活性和神经 氨酸酶活性在阳光直射下流感病毒4048小时即失活三、流感病毒四、流行病学(禽、人禽流感)传播途径：飞沫经呼吸道传播（与SARS冠状病毒育别） 接触传播：经口，黏膜，破损皮肤经口传播：污物口，粪口(1)(1)病毒分离病毒分离 采用级鸡胚或敏感细胞系采用级鸡胚或敏感细胞系( (如如VeroVero、MDCK)MDCK) 通常采用鼻咽拭子、含
73、漱液、气管通常采用鼻咽拭子、含漱液、气管/ /肺胞灌洗液等肺胞灌洗液等 病毒分离后需经核酸检测和病毒分离后需经核酸检测和/ /或血清检测证实或血清检测证实 病毒分离后可通过基因测序以确定所分离毒株与既病毒分离后可通过基因测序以确定所分离毒株与既 往分离毒株间的关系往分离毒株间的关系 1.病原学检测（三）实验室检查(2)(2)核酸检测核酸检测 技术：技术：RT-PCRRT-PCR、NASBANASBA等等 RT-PCRRT-PCR：目前常用技术。：目前常用技术。 目的基因：目的基因：H5(HA1H5(HA1、HA0)HA0)、NPNP、NSNS等。等。 结果判定结果判定: : 阳性：存在阳性：存
74、在AIAI病毒。病毒。 阴性：不能依据阴性结果排除阴性：不能依据阴性结果排除AIAI。3. 3.抗体检测抗体检测 抗体：抗体：抗血凝素抗血凝素(HA)(HA)抗体、抗抗体、抗H5H5特异性体、抗神经氨酸酶特异性体、抗神经氨酸酶 (NP)(NP)抗体、等抗体、等。 方法：方法：免疫荧光技术、免疫荧光技术、 ELISAELISA、血凝抑制试验（关于血凝试验、血凝抑制试验（关于血凝试验 和血凝抑制试验）。和血凝抑制试验）。 意义：意义：检测病毒特异性检测病毒特异性IgM IgM 抗体，单份血清阳性可作为早期诊抗体，单份血清阳性可作为早期诊 断依据检测。检测急性期和病后第断依据检测。检测急性期和病后第
75、3 34 4 周双份血清周双份血清( (血血 清总抗体清总抗体) )，抗体效价增长，抗体效价增长4 4 倍以上，提示近期感染倍以上，提示近期感染。4.抗原检测 采用酶、荧光或其他标记单克隆抗体染色，可检出感染细采用酶、荧光或其他标记单克隆抗体染色，可检出感染细 胞内相应的病毒抗原，作为早期特异性诊断。胞内相应的病毒抗原，作为早期特异性诊断。病原学检测需要有两个实验室平行检测，可与其他具有一定条件的实验室协同。禽流感疫情的确认要由国家禽流感参考实验室（哈尔滨兽医研究所）检测鉴定。第四节第四节 动物性食品中致病性寄生虫的检验动物性食品中致病性寄生虫的检验旋毛虫旋毛虫囊尾蚴囊尾蚴肉孢子虫肉孢子虫弓形
76、虫弓形虫棘球蚴棘球蚴 旋毛虫病肉品检验技术旋毛虫病肉品检验技术旋毛虫病是重要的人畜共患寄生虫病，它是由毛形科的旋毛形线虫成虫寄旋毛虫病是重要的人畜共患寄生虫病，它是由毛形科的旋毛形线虫成虫寄生于肠管，幼虫寄生于横纹肌所引起的。该病流行于哺乳类动物间，鸟类生于肠管，幼虫寄生于横纹肌所引起的。该病流行于哺乳类动物间，鸟类可实验感染。可实验感染。人若摄食了生的或未煮熟的含旋毛虫包囊的猪肉可感染生病，人若摄食了生的或未煮熟的含旋毛虫包囊的猪肉可感染生病，主要临床表现为胃肠道症状、发热、肌痛、水肿和血液嗜酸性粒细胞增多主要临床表现为胃肠道症状、发热、肌痛、水肿和血液嗜酸性粒细胞增多等，等，严重者可以导致
77、死亡严重者可以导致死亡，故，故肉品卫生检验中将旋毛虫列为首要项目肉品卫生检验中将旋毛虫列为首要项目。旋。旋毛虫病的肉品检验是生猪屠宰检疫中的一项重要内容，通过该项检验可以毛虫病的肉品检验是生猪屠宰检疫中的一项重要内容，通过该项检验可以检出感染旋毛虫的猪只。对于杜绝病猪肉流入肉品市场，有着重要的作用。检出感染旋毛虫的猪只。对于杜绝病猪肉流入肉品市场，有着重要的作用。一、实验目的及要求一、实验目的及要求1掌握肌肉旋毛虫压片镜检法、消化法掌握肌肉旋毛虫压片镜检法、消化法的操作方法。的操作方法。2了解酶联免疫吸附试验的方法。了解酶联免疫吸附试验的方法。3掌握旋毛虫病肉的处理方法。掌握旋毛虫病肉的处理方
78、法。二、实验器材二、实验器材（一）旋毛虫压片镜检法（一）旋毛虫压片镜检法1材料：被检肉品。材料：被检肉品。2器材：载玻片，剪刀，镊子，天平，器材：载玻片，剪刀，镊子，天平，显微镜。显微镜。3试剂：试剂：50%甘油水溶液，甘油水溶液，10%稀盐酸。稀盐酸。（二）旋毛虫集样消化法（二）旋毛虫集样消化法1材料：被检肉品。材料：被检肉品。2器材：组织捣碎机，采样盘，磁力加器材：组织捣碎机，采样盘，磁力加热搅拌器，圆盘转动式计数镜检台，集热搅拌器，圆盘转动式计数镜检台，集虫器，载玻片，表面皿，烧杯，剪刀，虫器，载玻片，表面皿，烧杯，剪刀，镊子，天平，温度计，显微镜。镊子，天平，温度计，显微镜。3试剂：试
79、剂：0.04%胃蛋白酶溶液，盐酸。胃蛋白酶溶液，盐酸。（三）旋毛虫酶联免疫吸附试验（三）旋毛虫酶联免疫吸附试验（ELISA）1材料：被检肉品。材料：被检肉品。2器材：滤纸片，玻璃瓶，剪刀，酶标测定仪，反应板，加样器。器材：滤纸片，玻璃瓶，剪刀，酶标测定仪，反应板，加样器。3试剂：试剂：（1）阳性血清，阴性血清；）阳性血清，阴性血清；（2）旋毛虫抗原；）旋毛虫抗原；（3）酶标抗体（又称酶结合物、酶标记免疫球蛋白）；）酶标抗体（又称酶结合物、酶标记免疫球蛋白）；（4）包被液：）包被液：Na2CO3 1.59g、NaN3 0.2g、NaHCO3 2.93g，用蒸馏，用蒸馏水加至水加至1000ml，调
80、整，调整pH为为9.6。放。放4冰箱中保存备用。冰箱中保存备用。（5）洗涤液：）洗涤液：NaCl 8.9g、Tween-20 0.5g、KH2PO4 0.2g、NaN3 0.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g，用蒸馏水加至，用蒸馏水加至1000ml，调，调整整pH为为7.4。（6）底物溶液（）底物溶液（OPD-H2O2）：称取邻苯二胺）：称取邻苯二胺40mg，溶解于，溶解于100ml pH5.0磷酸磷酸-柠檬酸缓冲液（柠檬酸缓冲液（0.1M柠檬酸柠檬酸24.3m1，加，加0.2M NaH2PO4 25.7ml，加水，加水50ml）中，然后加）中，然后加30过氧化氢过氧化
81、氢0.15ml，现配现用。，现配现用。（7）终止液（）终止液（2M H2SO4）：浓硫酸）：浓硫酸22.2ml，蒸馏水，蒸馏水177.8ml。三、实验方法、步骤和操作要领三、实验方法、步骤和操作要领（一）旋毛虫压片镜检法（一）旋毛虫压片镜检法1采样。采样。自胴体左右两侧横膈膜的膈肌脚，自胴体左右两侧横膈膜的膈肌脚，各采膈肌各采膈肌1块（与胴体编成相同号码），每块（与胴体编成相同号码），每块肉样不少于块肉样不少于20g，记为一份肉样，送至检，记为一份肉样，送至检验台检查。如果被检样品为部分胴体，则验台检查。如果被检样品为部分胴体，则可从肋间肌、腰肌、咬肌等处采样。可从肋间肌、腰肌、咬肌等处采样。
82、2肉眼检查。肉眼检查。撕去被检样品肌膜，将肌撕去被检样品肌膜，将肌肉拉平，在良好的光线下仔细检查表面肉拉平，在良好的光线下仔细检查表面有无可疑的旋毛虫病灶（见图有无可疑的旋毛虫病灶（见图21-2）。）。未钙化的包囊呈露滴状，半透明，细针未钙化的包囊呈露滴状，半透明，细针尖大小，较肌肉的色泽淡；随着包囊形尖大小，较肌肉的色泽淡；随着包囊形成时间的增加，色泽逐步变深而为乳白成时间的增加，色泽逐步变深而为乳白色、灰白色或黄白色。若见可疑病灶时，色、灰白色或黄白色。若见可疑病灶时，做好记录且告知总检将可疑肉尸隔离，做好记录且告知总检将可疑肉尸隔离，待压片镜检后做出处理决定待压片镜检后做出处理决定 3制
83、片。制片。取清洁载玻片取清洁载玻片1块放于检验台上，并尽量靠近检验者。用镊子夹块放于检验台上，并尽量靠近检验者。用镊子夹住肉样顺着肌纤维方向将可疑部分剪下。如果无可疑病灶的，则顺着肌纤住肉样顺着肌纤维方向将可疑部分剪下。如果无可疑病灶的，则顺着肌纤维方向在肉块的不同部位剪取维方向在肉块的不同部位剪取12个麦粒大小的肉粒（个麦粒大小的肉粒（2块肉样共剪取块肉样共剪取24个个小肉粒）。将剪下的肉粒依次均匀地附贴于载玻片上且排成两行，每行小肉粒）。将剪下的肉粒依次均匀地附贴于载玻片上且排成两行，每行6粒。然后，再取一清洁载玻片盖放在肉片的载玻片上，并用力适度捏住两粒。然后，再取一清洁载玻片盖放在肉片
84、的载玻片上，并用力适度捏住两端轻轻加压，把肉粒压成很薄的薄片，以能通过肉片标本看清下面报纸上端轻轻加压，把肉粒压成很薄的薄片，以能通过肉片标本看清下面报纸上的小字为标准。另一块膈肌按上法制作，两片压片标本为一组进行镜检的小字为标准。另一块膈肌按上法制作，两片压片标本为一组进行镜检 。4镜检。镜检。把压片标本放在低倍（把压片标本放在低倍（410）显微镜下，从压片的一端第一块肉片处显微镜下，从压片的一端第一块肉片处开始，顺肌纤维依次检查。镜检时应注开始，顺肌纤维依次检查。镜检时应注意光线的强弱及检查速度，切勿漏检。意光线的强弱及检查速度，切勿漏检。 5结果判定。结果判定。（1）没有形成包囊的幼虫，
85、在肌纤维之间呈）没有形成包囊的幼虫，在肌纤维之间呈直杆状或逐渐蜷曲状态，但有时因标本压得直杆状或逐渐蜷曲状态，但有时因标本压得太紧，可使虫体挤入压出的肌浆中。太紧，可使虫体挤入压出的肌浆中。（2）包囊形成期的旋毛虫，在淡黄色背景上，）包囊形成期的旋毛虫，在淡黄色背景上，可看到发光透明的圆形或椭圆形物。包囊的可看到发光透明的圆形或椭圆形物。包囊的内外两层主要由均质透明蛋白质和结缔组织内外两层主要由均质透明蛋白质和结缔组织组成，囊中央是蜷曲的虫体。成熟的包囊位组成，囊中央是蜷曲的虫体。成熟的包囊位于相邻肌细胞所形成的梭形肌腔内。于相邻肌细胞所形成的梭形肌腔内。（3）发生机化现象的旋毛虫。）发生机化
86、现象的旋毛虫。虫体未形成包囊以前，虫体未形成包囊以前，包围虫体的肉芽组织逐渐增厚、变大，形成纺锤形、包围虫体的肉芽组织逐渐增厚、变大，形成纺锤形、椭圆形或圆形的肉芽肿。被包围的虫体有的结构完整，椭圆形或圆形的肉芽肿。被包围的虫体有的结构完整，有的破碎甚至完全消失。虫体形成包囊后的机化，其有的破碎甚至完全消失。虫体形成包囊后的机化，其病理过程与上述相似。由于机化灶透明度较差，需用病理过程与上述相似。由于机化灶透明度较差，需用50甘油水溶液作透明处理，即在肉粒上滴加数滴甘油水溶液作透明处理，即在肉粒上滴加数滴50%甘油水溶液，数分钟后，肉片变得透明，再覆盖甘油水溶液，数分钟后，肉片变得透明，再覆盖
87、上玻片压紧观察。上玻片压紧观察。（4）钙化的旋毛虫。）钙化的旋毛虫。在包囊内可见数量不等、浓淡不均的黑色在包囊内可见数量不等、浓淡不均的黑色钙化物，包囊周围有大量结缔组织增生。由于钙化的不同发展过钙化物，包囊周围有大量结缔组织增生。由于钙化的不同发展过程，有时可能看到下列变化：程，有时可能看到下列变化：包囊内有不透明黑色钙盐颗粒沉包囊内有不透明黑色钙盐颗粒沉着；着；钙盐在包囊腔两端沉着，逐渐向包囊中间扩展；钙盐在包囊腔两端沉着，逐渐向包囊中间扩展；钙盐沉钙盐沉积于整个包囊腔，并波及虫体，尚可见到模糊不清的虫体或虫体积于整个包囊腔，并波及虫体，尚可见到模糊不清的虫体或虫体全部被钙盐沉着。此外，在
88、镜检中有时也能见到由虫体开始钙化全部被钙盐沉着。此外，在镜检中有时也能见到由虫体开始钙化逐渐扩展到包囊的钙化过程（多数是由于虫体死亡后而引起的钙逐渐扩展到包囊的钙化过程（多数是由于虫体死亡后而引起的钙化）。发现钙化旋毛虫时，可以通过脱钙处理，滴加化）。发现钙化旋毛虫时，可以通过脱钙处理，滴加10%稀盐酸稀盐酸将钙盐溶解后，可见到虫体及其痕迹，与包囊毗邻的肌纤维变性，将钙盐溶解后，可见到虫体及其痕迹，与包囊毗邻的肌纤维变性，横纹消失。横纹消失。（5）鉴别诊断。）鉴别诊断。在旋毛虫检验时，往往在旋毛虫检验时，往往会发现住肉孢子虫和发育不完全的囊尾会发现住肉孢子虫和发育不完全的囊尾蚴，虫体典型者，容
89、易辨认，如发生钙蚴，虫体典型者，容易辨认，如发生钙化，死亡或溶解现象时，则容易混淆。化，死亡或溶解现象时，则容易混淆。 （二）旋毛虫集样消化法（二）旋毛虫集样消化法1实验原理。实验原理。先用机械方法将受检肉样捣碎，使其呈颗粒或絮状，再先用机械方法将受检肉样捣碎，使其呈颗粒或絮状，再用消化酶在最适温度和最佳酸碱度条件下进行生物化学消化。本实验采用消化酶在最适温度和最佳酸碱度条件下进行生物化学消化。本实验采用快速集样消化法，即由磁棒转动带动杯中消化液旋转成旋窝，加速底用快速集样消化法，即由磁棒转动带动杯中消化液旋转成旋窝，加速底物消化分解，同时比水重的有形物质随旋窝的力量向中心移动，但未消物消化分
90、解，同时比水重的有形物质随旋窝的力量向中心移动，但未消化的巨型肌组织残质则被集虫器外周粗筛阻留，而虫体或虫体包囊等细化的巨型肌组织残质则被集虫器外周粗筛阻留，而虫体或虫体包囊等细小物体随旋窝向中心移动进入集虫器；当转动停止，集虫器中的有形物小物体随旋窝向中心移动进入集虫器；当转动停止，集虫器中的有形物质便随旋窝作用逐渐沉降于底部细筛孔漏掉，只保留虫体和包囊在筛面质便随旋窝作用逐渐沉降于底部细筛孔漏掉，只保留虫体和包囊在筛面上供镜检。上供镜检。2实验方法、步骤和操作要领。实验方法、步骤和操作要领。（1）采样。）采样。首先确定群检分组的头数，每组头数的大小可根据首先确定群检分组的头数，每组头数的大
91、小可根据各地区旋毛虫病的发生情况而定，即在旋毛虫病的低发病地区采各地区旋毛虫病的发生情况而定，即在旋毛虫病的低发病地区采取取5-10头猪为头猪为1组，而常年未检出旋毛虫的地区每组可增加到组，而常年未检出旋毛虫的地区每组可增加到30-50头或头或100头。既能因地提高检验工效，又不致使旋毛虫检验流头。既能因地提高检验工效，又不致使旋毛虫检验流于形式。如果以于形式。如果以10头猪为头猪为1组，其分组情况应按生产流水线上胴组，其分组情况应按生产流水线上胴体编号体编号1-10、11-20、21-30顺序。每头猪取横膈膜肌脚顺序。每头猪取横膈膜肌脚2g，每组每组10头样肉，共头样肉，共20g，依次放在序
92、号相同的采样盘或塑料袋内，依次放在序号相同的采样盘或塑料袋内送检。送检。（2）捣碎。）捣碎。按采样盘顺序，每次取按采样盘顺序，每次取1组组（20g），置捣碎机容器中，加入），置捣碎机容器中，加入0.04%胃蛋白酶溶液胃蛋白酶溶液100ml（按每（按每10g样肉加样肉加50ml酶溶液的比例），徐徐启动捣碎机，酶溶液的比例），徐徐启动捣碎机，转速由转速由8000rpm逐渐到逐渐到16000rpm。捣碎。捣碎约约30s至肉样成颗粒或絮状，并混悬于混至肉样成颗粒或絮状，并混悬于混浊的消化液中。浊的消化液中。（3）加热、消化、集虫。）加热、消化、集虫。取下容器将捣碎液倒入取下容器将捣碎液倒入500ml烧
93、杯中，加入烧杯中，加入2%的热盐酸溶液的热盐酸溶液100ml（与酶溶（与酶溶液等量），使温度保待在液等量），使温度保待在45左右。然后将集虫器从左右。然后将集虫器从液面上小心压入杯中，加人磁棒，将烧杯放在加热磁液面上小心压入杯中，加人磁棒，将烧杯放在加热磁力搅拌器上，启动转速节柄，消化液被搅成一旋窝。力搅拌器上，启动转速节柄，消化液被搅成一旋窝。在在45左右搅拌左右搅拌3-5min后，回转调节柄，停止搅拌，后，回转调节柄，停止搅拌，待磁棒静止后取出磁棒。取出集虫器，卸下集虫筛，待磁棒静止后取出磁棒。取出集虫器，卸下集虫筛，用适量清水将筛面物充分洗入表面皿中。用适量清水将筛面物充分洗入表面皿中。
94、（4）镜检。）镜检。将表面皿移于镜检台的圆孔将表面皿移于镜检台的圆孔上，旋转圆盘使表面皿中心底部接物镜上，旋转圆盘使表面皿中心底部接物镜头下，将表面皿前后、左右晃动数次，头下，将表面皿前后、左右晃动数次，使有形成分集中于皿底中心，用使有形成分集中于皿底中心，用40倍物倍物镜检查有无旋毛虫虫体、包囊以及虫体镜检查有无旋毛虫虫体、包囊以及虫体碎片或空包囊。碎片或空包囊。（5）查病畜胴体。）查病畜胴体。镜检发现阳性时，按圆盘转数（镜检发现阳性时，按圆盘转数（0、1、2、3顺序）乘以顺序）乘以100（每组头数（每组头数圆盘孔数）加孔号乘以圆盘孔数）加孔号乘以10（每（每组头数），即得出该组组头数），即
95、得出该组10头猪的胴体编号。计算公式：圆盘转数头猪的胴体编号。计算公式：圆盘转数100+孔号孔号10。例如：阳性组圆盘转数是。例如：阳性组圆盘转数是20，孔号数为，孔号数为3，代入，代入公式为公式为20100+310=2030，该组胴体编号即为，该组胴体编号即为2021、2022、20232030这这10个号码。将该个号码。将该10头猪的胴体全部推入修割轨头猪的胴体全部推入修割轨道待查。复查按每道待查。复查按每2头为一组消化镜检，检出阳性组，再逐头检头为一组消化镜检，检出阳性组，再逐头检测，确定病畜胴体。复查时用压片镜检法更快、更方便。测，确定病畜胴体。复查时用压片镜检法更快、更方便。（三）旋
96、毛虫酶联免疫吸附试验（三）旋毛虫酶联免疫吸附试验（ELISA）1实验原理。实验原理。ELISA是利用酶作为抗原或抗体的标记物，在固相载体是利用酶作为抗原或抗体的标记物，在固相载体上进行抗原或抗体的测定。上进行抗原或抗体的测定。ELISA的原理是：让抗原或抗体结合到固相的原理是：让抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原载体表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体，仍保留其免疫活性和酶的催化活性。在测定时，把受检标本和或抗体，仍保留其免疫活性和酶的催化活性。在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体，按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体
97、起反应，形酶标抗原或抗体，按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成抗原成抗原-抗体复合物。经清洗后在固相载体表面留下不同量的酶。加入酶抗体复合物。经清洗后在固相载体表面留下不同量的酶。加入酶反应的底物后，底物在复合物上酶的催化作用下生成有色产物，产物的反应的底物后，底物在复合物上酶的催化作用下生成有色产物，产物的量与标本中受检抗原或抗体的量直接相关。故可根据颜色反应的深浅，量与标本中受检抗原或抗体的量直接相关。故可根据颜色反应的深浅，间接推断受检抗原或抗体的存在及其含量，达到定性或定量检测的目的。间接推断受检抗原或抗体的存在及其含量，达到定性或定量检测的目的。2实验方法、步骤和操作要领
98、。实验方法、步骤和操作要领。（1）采样。）采样。用用1.03.0cm滤纸片紧贴胴体残留血液处滤纸片紧贴胴体残留血液处或血凝块（若无残血，可将滤纸片紧贴肌肉组织新鲜或血凝块（若无残血，可将滤纸片紧贴肌肉组织新鲜断面，轻轻挤压断面两侧），当滤纸片全部湿润后，断面，轻轻挤压断面两侧），当滤纸片全部湿润后，将其放入小玻璃瓶（装有含吐温将其放入小玻璃瓶（装有含吐温20的的pH7.4 PBS液液1ml）中，振摇后即为被检样品。纯肌肉时，可取蚕豆）中，振摇后即为被检样品。纯肌肉时，可取蚕豆大肌肉置于小玻璃瓶中，剪碎，加大肌肉置于小玻璃瓶中，剪碎，加2-3倍倍PBS液，振摇、液，振摇、静置，上清即为被检样品。
99、静置，上清即为被检样品。（2）抗原包被。）抗原包被。将旋毛虫抗原用包被液将旋毛虫抗原用包被液稀释成一定浓度（抗原蛋白含量稀释成一定浓度（抗原蛋白含量2mg/ml），加入反应板），加入反应板A、B、C、D列列1-10号孔内，每孔加号孔内，每孔加0.2m1；E列各孔分列各孔分别为阴、阳性血清对照，每孔加别为阴、阳性血清对照，每孔加0.2ml。每列的第每列的第11孔为空白对照（每孔加稀释孔为空白对照（每孔加稀释液液0.2ml），加毕，将反应板加盖，置湿），加毕，将反应板加盖，置湿盒内，盒内，37孵育孵育2h或或4过夜，使其达到过夜，使其达到最大反应强度。最大反应强度。（3）洗涤。）洗涤。将反应板倒空
100、，伏置于滤纸上片刻，用洗将反应板倒空，伏置于滤纸上片刻，用洗涤液加满各孔，室温下静置后倒空，并用滤纸吸干。涤液加满各孔，室温下静置后倒空，并用滤纸吸干。再加满洗液，如此重复再加满洗液，如此重复3次。次。（4）加入被检样品。）加入被检样品。将被检样品加入预定孔内，每份将被检样品加入预定孔内，每份加两孔，每孔加加两孔，每孔加0.2m1，包被液空白对照各孔加洗涤，包被液空白对照各孔加洗涤液液0.2ml。同时作阴、阳性标准血清对照，。同时作阴、阳性标准血清对照，37孵育孵育2h。（5）洗涤）洗涤3次，次，方法同上。方法同上。（6）加酶标抗体。）加酶标抗体。按照说明，用洗液稀释至最适浓度，每孔加按照说明
101、，用洗液稀释至最适浓度，每孔加0.2ml，37孵孵育育2h（适当提高反应温度及抗原、酶结合物浓度，可缩短孵育时间）。（适当提高反应温度及抗原、酶结合物浓度，可缩短孵育时间）。（7）洗涤）洗涤3次，次，方法同上。方法同上。（8）加底物。）加底物。将新鲜配制的底物溶液加入各孔，每孔将新鲜配制的底物溶液加入各孔，每孔0.2ml，37湿盒避光作湿盒避光作用用15min。（9）终止反应。）终止反应。每孔加终止液每孔加终止液50l，静置，静置5min。（10）测定）测定OD值。值。在酶标测定仪上，于在酶标测定仪上，于492nm波长，按仪器使用及制定标准波长，按仪器使用及制定标准要求调节仪器，测定各反应孔的
102、要求调节仪器，测定各反应孔的OD值，记录结果。值，记录结果。（11）结果判定。）结果判定。根据反应颜色的深浅先用肉眼判定。参考阳性及阴性对照，根据反应颜色的深浅先用肉眼判定。参考阳性及阴性对照，分别判为阳性（）、阴性（）及可疑（分别判为阳性（）、阴性（）及可疑（）。）。凡被检样品的凡被检样品的OD值高于标值高于标准阴性血清平均准阴性血清平均OD值值2倍以上，即判阳性反应。倍以上，即判阳性反应。（四）旋毛虫病阳性肉的处理（四）旋毛虫病阳性肉的处理如果发现旋毛虫，应根据号码查对肉尸、内脏和头等按照农业部、如果发现旋毛虫，应根据号码查对肉尸、内脏和头等按照农业部、卫生部、外贸部、商业部联合颁布的卫生
103、部、外贸部、商业部联合颁布的肉品卫生检验试行规程肉品卫生检验试行规程统一进行处理。统一进行处理。1宰后检验在宰后检验在24个肉片标本内，发现包囊或钙化的旋毛虫不超个肉片标本内，发现包囊或钙化的旋毛虫不超过过5个者，横纹肌和心脏高温处理后出场。超过个者，横纹肌和心脏高温处理后出场。超过5个以上者，横纹个以上者，横纹肌和心脏作工业用或销毁。肌和心脏作工业用或销毁。2上述两种情况的皮下及肌肉间脂肪可炼食用油，体腔内脂肪上述两种情况的皮下及肌肉间脂肪可炼食用油，体腔内脂肪不受限制出场。不受限制出场。3肠可供制肠衣，其它内脏不受限制出场。肠可供制肠衣，其它内脏不受限制出场。学习形式：讨论/中期作业植物性食品中病虫害和致病微生物主要检验检疫对象有哪些?植物性食品中病虫害和致病微生物检验检疫技术有哪些?发展趋势是什么? 国内外植物性食品中病虫害和致病微生物流行现状如何?怎样有效控制?
