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1、哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统动物基因工程原理动物基因工程原理1哺乳动物细胞表达系统特点与优势n哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。 2哺乳动物细胞表达系统应用领域n n哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台。的生产平台。n n哺乳动物细胞表达系统在新基因的发现、蛋白质哺乳动物细胞表达系统在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。的结构和功能研究中亦
2、起了极为重要的作用。 3哺乳动物细胞表达系统研究现状n n部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。产或中试生产阶段。n n已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子凝血因子、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素人生长激素、人抗凝血素，集落刺激因子，集落刺激因子等。等。n n哺乳动物细胞表达系统
3、的表达水平从整个水平上看仍偏低，哺乳动物细胞表达系统的表达水平从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-1-30g/l030g/l08 8细胞细胞/24/24小时。其限速步骤可能是在工程细胞中重小时。其限速步骤可能是在工程细胞中重组蛋白的分泌效率较低。组蛋白的分泌效率较低。 4哺乳动物细胞表达系统一、稳定表达细胞系的筛选一、稳定表达细胞系的筛选n n构建目的基因的表达载体。构建目的基因的表达载体。n n确定受体细胞。确定受体细胞。n n确定筛选方法（抗生素的使用浓度）。确定筛选方法（抗生素的使用浓度）。n n转染后转染
4、后48h,48h,传代铺板传代铺板 (1 : 100) ,(1 : 100) ,加筛选药物。加筛选药物。n n3-4d3-4d换液换液1 1次次, ,直至存活细胞长出岛状细胞簇直至存活细胞长出岛状细胞簇, ,约约2 2周。周。n n克隆耐药细胞克隆耐药细胞, ,检测目基因的存在与表达。检测目基因的存在与表达。5哺乳动物细胞表达系统二、哺乳动物细胞表达系统二、哺乳动物细胞表达系统( (一一) )宿主细胞宿主细胞( (二二) )表达载体的构建表达载体的构建 ( (三三) )表达细胞株的基因共圹增和筛选方法表达细胞株的基因共圹增和筛选方法( (四四) )可调控的哺乳动物细胞表达系统可调控的哺乳动物细
5、胞表达系统6哺乳动物细胞表达系统高等哺乳动物受体细胞高等哺乳动物受体细胞n n高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物细胞的生长特性n n高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的条件n n高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记n n常用的高等哺乳动物受体细胞常用的高等哺乳动物受体细胞7哺乳动物细胞表达系统高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：n n锚地依赖性锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂n n血清依
6、赖性血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长：细胞必须具有生长因子才能生长n n接触抑制性接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制n n形态依赖性形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活活5050代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分
7、裂，这种状态称为无限制分裂，这种状态称为细胞系形成细胞系形成，此时的细胞成为，此时的细胞成为细胞细胞系系。8哺乳动物细胞表达系统高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的条件 以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备以下条件：备以下条件：n n细胞系特征细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，便于大：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，便于大规模培养。规模培养。n n遗传稳定性遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存。保存。n n合适的标记合适的标记：便于转化株的筛选和维持
8、。：便于转化株的筛选和维持。n n生长快且齐生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。：分裂周期短，生长均一，便于控制。n n安全性能好安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。：不合成分泌致病物质，不致癌。 9哺乳动物细胞表达系统高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 遗传标记遗传标记编码产物编码产物筛选药物筛选药物作用机理作用机理APH-APH-氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶G418G418APHAPH灭活灭活G418G418DHFRDHFR二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶氨甲喋呤氨甲喋呤DHFRDHFR变体抗氨变体抗氨甲碟呤甲碟呤HPH-HPH-潮霉素潮霉素B B磷酸转移酶磷酸转移酶潮霉素潮霉
9、素B BHPHHPH灭活潮霉素灭活潮霉素B BTK-TK-胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶氨甲喋呤氨甲喋呤TKTK合成合成TMPTMPXGPRT-XGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶转移酶霉酚酸霉酚酸XGPRTXGPRT和成和成GMPGMPADA-ADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷腺嘌呤木酮糖苷ADA-ADA-灭活灭活Xyl-AXyl-A10哺乳动物细胞表达系统宿主细胞n n常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)(CHO)细胞、小仓鼠细胞、小仓鼠肾肾(BHK)(BHK)细胞、细胞、COSCOS细胞、小鼠细胞、小鼠NS
10、ONSO胸腺瘤细胞和小鼠骨胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤髓瘤SP2/0SP2/0细胞等。细胞等。n n不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。11哺乳动物细胞表达系统常用的高等哺乳动物受体细胞常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细中国仓鼠卵巢细胞（胞（CHOCHO），其优势有
11、如下几个方面：，其优势有如下几个方面：n n遗传背景清楚，生理代谢稳定遗传背景清楚，生理代谢稳定n n与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确n n基因转移和载体表达系统完善基因转移和载体表达系统完善n n耐受剪切力，便于大规模培养耐受剪切力，便于大规模培养n n被美国被美国FDAFDA确认为安全的基因工程受体细胞确认为安全的基因工程受体细胞 12哺乳动物细胞表达系统宿主细胞n n猴肾细胞（猴肾细胞（COSCOS）是进行外源基因瞬时表达时用途最广的）是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入宿主，其重组载件易于组建，便于使用
12、，而且对插入DNADNA的量或者采用基因组的量或者采用基因组DNADNA序列的情况都没有什么限制，便序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证于通过检测表达情况来确证cDNAcDNA的阳性克隆，也利于快的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化速分析引入克隆化cDNAcDNA序列中的突变。序列中的突变。 13哺乳动物细胞表达系统宿主细胞n n近几年也陆续发现了几种新的有较大应用价值的细胞株：如近几年也陆续发现了几种新的有较大应用价值的细胞株：如来源于来源于MadIin-DarbyMadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株犬肾的高分化内皮细胞株( (MDCKMDCK) )。n nPeiP
13、ei等用该细胞株表达分泌型的等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶MMPI3MMPI3，发现，发现高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5 5l0l0，其中一个，其中一个克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5l52020，在细胞单层，在细胞单层贴壁培养情况下表达量达贴壁培养情况下表达量达10 mg/L10 mg/L。 14哺乳动物细胞表达系统对细胞株选择性地进行遗传改造对细胞株选择性地进行遗传改造n nBHK/vl6BHK/vl6细胞株是稳定细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16(HSV)VP16
14、蛋白蛋白的的BHKBHK细胞细胞，由于，由于VP16VP16的转录激活作用，载体中的的转录激活作用，载体中的HSVHSV早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。n n已用该细胞株获得了包括已用该细胞株获得了包括人组织纤溶酶原激活剂、生长因人组织纤溶酶原激活剂、生长因子子等在内的多种蛋白的高效稳定表达。等在内的多种蛋白的高效稳定表达。 15哺乳动物细胞表达系统对细胞株选择性地进行遗传改造对细胞株选择性地进行遗传改造n n基于基于腺病毒腺病毒EIAEIA蛋白蛋白可反式激活可反式激活CMVCMV启动子，启动子，CockettCockett等建等建立了稳定表达立了稳
15、定表达EIAEIA的的CHOCHO细胞株，在该细胞中重组前胶原细胞株，在该细胞中重组前胶原酶的产量与酶的产量与CHOCHO细胞相比增加了细胞相比增加了l2l2倍；该细胞在多种抗体倍；该细胞在多种抗体的表达中亦取得满意的结果。的表达中亦取得满意的结果。16哺乳动物细胞表达系统对细胞株选择性地进行遗传改造对细胞株选择性地进行遗传改造n n对细胞其它特性的遗传改造，包括对细胞其它特性的遗传改造，包括细胞生长周期细胞生长周期的调控、细胞的抗凋亡能力、细胞贴壁能力、蛋的调控、细胞的抗凋亡能力、细胞贴壁能力、蛋白糖基化的模式白糖基化的模式等方面，亦有相关报道，其实际等方面，亦有相关报道，其实际应用价值有待
16、得到更多实验数据的支持。应用价值有待得到更多实验数据的支持。 17哺乳动物细胞表达系统真核表达载体真核表达载体n n哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的动子、转录终止序列和一个有效的mRNAmRNA翻译信号。翻译信号。n n原核原核DNADNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子复制子，便，便于筛选含重组细菌的于筛选含重组细菌的抗生素抗性基因抗生素抗性基因，以及便于目的基因，以及便于目的基因插入的插入的限制性酶切位点限制性酶切位点。n n可视实验需要加入可视实验需
17、要加入标志基因标志基因、内含子、内部核糖体进入位内含子、内部核糖体进入位点点等。等。18哺乳动物细胞表达系统19哺乳动物细胞表达系统真核表达载体真核表达载体n n常用的标记基因有常用的标记基因有胸腺激酶胸腺激酶(tk)(tk)基因、二氢叶酸还原酶基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)(dhfr)基因、新霉素基因、新霉素(neo)(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)(cat)基因基因等等n ndhfrdhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当培养基中逐渐增加氨甲蝶呤培养基中逐渐增加氨甲蝶呤(MTX)(MT
18、X)的浓度时，随着细胞对的浓度时，随着细胞对MTXMTX抗性的增加。抗性的增加。dhfrdhfr基因与外源基因均明显扩增。基因与外源基因均明显扩增。n n据文献报道，在不断提高的选择压力下，据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfrdhfr及侧翼序列及侧翼序列能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。 20哺乳动物细胞表达系统真核表达载体真核表达载体-启动子启动子n n外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。是启动子和增强子的强弱以及它们
19、之间的搭配。n n启动子需包含两个识别序列：启动子需包含两个识别序列：mRNAmRNA转录起始点和转录起始点和TATATATA盒。盒。TATATATA盒位于转录起始位点上游盒位于转录起始位点上游25-30bp25-30bp处，是引导处，是引导RNARNA聚聚合酶在正确起始位点转录所必需的序列，即保证转录的精合酶在正确起始位点转录所必需的序列，即保证转录的精确起始。其他上游启动子元件常位于确起始。其他上游启动子元件常位于TATATATA盒上游盒上游100200bp100200bp之间，其功能是之间，其功能是调节转录的起始频率和提高转调节转录的起始频率和提高转录效率。录效率。21哺乳动物细胞表达系
20、统真核表达载体真核表达载体-启动子启动子n n启动子和增强子受细胞类型的限制启动子和增强子受细胞类型的限制，在不同的细，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞的类型胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞的类型选择不同的启动子和增强子以便于目的基因的高选择不同的启动子和增强子以便于目的基因的高效表达。效表达。n n目前常用的强启动子包括目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动人巨细胞病毒早期启动子子(CMV-IE)(CMV-IE)、人延伸因子人延伸因子1-1-亚基启动子亚基启动子和和RousRous肉肉瘤长末端重复序列瘤长末端重复序列；InvitrogenInvitrogen公司开发的公
21、司开发的pcDNApcDNA、pEFpEF和和pRLpRL三种系列载体即分别是以这三种启动子三种系列载体即分别是以这三种启动子驱动目的基因的表达。驱动目的基因的表达。 22哺乳动物细胞表达系统真核表达载体真核表达载体-启动子启动子n n近年来又发现了一些新的强启动子，如：近年来又发现了一些新的强启动子，如：人人leukosialinleukosialin基因启动子基因启动子和和鼠鼠3-3-磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶l l (PGKI)(PGKI)基因启动子，活性与基因启动子，活性与CMV-IECMV-IE相当。相当。n n人泛素蛋白人泛素蛋白(ubiquitin)C(ubiquitin)C基因启
22、动子基因启动子不仅具有较高不仅具有较高的活性，而且比的活性，而且比CMV-IECMV-IE、PGK1PGK1等启动子有更广等启动子有更广泛的宿主细胞范围，几乎在转基因小鼠的所有组泛的宿主细胞范围，几乎在转基因小鼠的所有组织细胞中都具有较高活性。织细胞中都具有较高活性。 23哺乳动物细胞表达系统真核表达载体真核表达载体-启动子启动子n n构建构建杂合的启动子杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。是获得新启动子的一个重要途径。n n比如由人比如由人ubiquitin Cubiquitin C启动区序列与启动区序列与CMVCMV增强子组成增强子组成的杂合启动子、由的杂合启动子、由SV40SV40
23、早期启动子和人早期启动子和人I I型型T T淋巴淋巴细胞病毒细胞病毒LTRLTR中的增强子序列中的增强子序列(R-U5(R-U5片段片段) )组成的组成的SR-SR-启动子的活性均与启动子的活性均与CMV-IECMV-IE相当；相当；n n由鸡由鸡-肌动蛋白启动子肌动蛋白启动子和和CMVCMV增强子序列增强子序列构成的构成的杂合启动子不仅活性比杂合启动子不仅活性比CMVIECMVIE高，而且具有更高，而且具有更为广谱的宿主细胞范围。为广谱的宿主细胞范围。NovagenNovagen公司的公司的pBacMampBacMam表达系统即是以该杂合启动子驱动目的基因的转录。表达系统即是以该杂合启动子驱
24、动目的基因的转录。 24哺乳动物细胞表达系统真核表达载体真核表达载体-启动子启动子n n另一类杂合启动子是由另一类杂合启动子是由活性很低的启动子与数个转录激活活性很低的启动子与数个转录激活因子结合位点串联而成因子结合位点串联而成，这些位点与转录激活因子的结合，这些位点与转录激活因子的结合受细胞外小分子药物的调控；这类启动子主要用作基因的受细胞外小分子药物的调控；这类启动子主要用作基因的诱导表达。诱导表达。n n如如InvitrogenInvitrogen公司的公司的ecdysoneecdysone（脱皮激素）诱导表达系统，（脱皮激素）诱导表达系统，其负责目的基因转录的启动子是由热休克蛋白启动子
25、核心其负责目的基因转录的启动子是由热休克蛋白启动子核心序列序列(minimal promotor)(minimal promotor)和和5 5个个E/GREE/GRE元件组成；元件组成；n nClontechClontech公司开发的公司开发的Tet-offTet-off系统中的启动子则由系统中的启动子则由CMVCMV启动启动子的核心序列和子的核心序列和7 7个个TetTet阻遏蛋白结合位点组成。阻遏蛋白结合位点组成。n n这些启动子在诱导前后活性可相差这些启动子在诱导前后活性可相差4 4个数量级。个数量级。25哺乳动物细胞表达系统真核表达载体真核表达载体-启动子启动子n n在哺乳动物细胞中
26、已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录的基因，如编码红细胞生成素的基因，如编码红细胞生成素(EPO)(EPO)、转铁蛋白、血红素加、转铁蛋白、血红素加氧酶氧酶-1-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件(CGTG (CGTG ) )，有利于在，有利于在55或或33侧翼区的侧翼区的低氧诱导作用因子低氧诱导作用因子-1(HIF-1)-1(HIF-1)和和低低氧反应增强子氧反应增强子(HRE)(HRE)结合，激活靶基因的转录，在低氧浓度结合，激活靶基因的转录，在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。下可使重组蛋白
27、大量表达。n n据报道红细胞生成素启动子在据报道红细胞生成素启动子在1%1%氧浓度比在氧浓度比在21%21%氧浓度下活氧浓度下活性增强性增强100100倍。这又是一种新的提高表达量的作用机制。倍。这又是一种新的提高表达量的作用机制。 26哺乳动物细胞表达系统真核表达载体真核表达载体-增强子增强子n n常用的增强子有常用的增强子有RousRous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人巨肉瘤病毒基因长末端重复序列和人巨细胞病毒增强子。细胞病毒增强子。n nJamesJames等利用糖皮质类固醇诱导的鼠乳房瘤病毒等利用糖皮质类固醇诱导的鼠乳房瘤病毒(MMTV)(MMTV)启启动子和鼠乳房瘤病毒长末端重复序列
28、动子和鼠乳房瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR)(MMTV-LTR)，在，在CHOCHO细胞中表达分泌的碱性磷酸酶，产量为利用常规的细胞中表达分泌的碱性磷酸酶，产量为利用常规的SV40SV40和和 CMVCMV启动子的启动子的1010倍，超过倍，超过0.4mg/ml0.4mg/ml。 27哺乳动物细胞表达系统内含子n n某些内含子有重要的基因功能调控序列某些内含子有重要的基因功能调控序列, ,目的基因以基因组目的基因以基因组形式克隆入载体能得到高表达。形式克隆入载体能得到高表达。n n为增加转录产物的稳定性为增加转录产物的稳定性, ,表达载体中一般含有天然的或人表达载体中一般含有天然的或人
29、工合成的内含子序列。工合成的内含子序列。n nmRNAmRNA前体的剪切能够促进前体的剪切能够促进mRNA mRNA 从胞核向胞质的运输。从胞核向胞质的运输。n n外显子和内含子接头外显子和内含子接头 每个外显子和内含子接头区都有一每个外显子和内含子接头区都有一段高度保守的一致序列（段高度保守的一致序列（consensus sequenceconsensus sequence），即内含子），即内含子55末端大多数是末端大多数是GTGT开始，开始，33末端大多数是末端大多数是AGAG结束，称为结束，称为GT-AGGT-AG法则，是普遍存在于真核基因中法则，是普遍存在于真核基因中RNARNA的识别
30、信号。的识别信号。28哺乳动物细胞表达系统 真核基因的真核基因的hnRNAhnRNA的加工过程需要的加工过程需要PolyAPolyA信号信号, ,在目的基因在目的基因33端加上端加上PolyA,PolyA,表达水平提高表达水平提高1010倍以上。倍以上。n nSV40SV40的早期和晚期的早期和晚期PolyA.PolyA.n n牛生长激素基因牛生长激素基因PolyA.PolyA.n n人工合成人工合成PolyA.PolyA.转录终止序列29哺乳动物细胞表达系统30哺乳动物细胞表达系统31哺乳动物细胞表达系统32哺乳动物细胞表达系统IRESn nIRES(internal Ribosome en
31、try site)IRES(internal Ribosome entry site)内部核糖体切入内部核糖体切入位点位点, ,可从一个可从一个mRNAmRNA翻译二个翻译二个ORFORF。n nIRESIRES位于小位于小RNARNA病毒病毒RNA5RNA5非编码区非编码区, , 约为约为450bp450bp。IRESIRES可与它连接的可与它连接的ORFORF同时翻译同时翻译, ,构建双顺反子和构建双顺反子和多顺反子真核表达载体。多顺反子真核表达载体。33哺乳动物细胞表达系统34哺乳动物细胞表达系统35哺乳动物细胞表达系统36哺乳动物细胞表达系统分泌表达载体37哺乳动物细胞表达系统 38哺
32、乳动物细胞表达系统39哺乳动物细胞表达系统40哺乳动物细胞表达系统41哺乳动物细胞表达系统可调控的哺乳动物细胞表达系统可调控的哺乳动物细胞表达系统42哺乳动物细胞表达系统四环素（tet）调控表达系统加入或撤除四环素和四环素衍生物来调控基因表达。加入或撤除四环素和四环素衍生物来调控基因表达。加入或撤除四环素和四环素衍生物来调控基因表达。加入或撤除四环素和四环素衍生物来调控基因表达。外源基因表达的水平与所加的外源基因表达的水平与所加的外源基因表达的水平与所加的外源基因表达的水平与所加的 Tc Tc Tc Tc 浓度在一定范围内相关浓度在一定范围内相关浓度在一定范围内相关浓度在一定范围内相关, ,
33、, , 因而可通过控制因而可通过控制因而可通过控制因而可通过控制 tet tet tet tet 的浓度来控制基因表达的水平。的浓度来控制基因表达的水平。的浓度来控制基因表达的水平。的浓度来控制基因表达的水平。应用于研究基因不同水平的表达对细胞应用于研究基因不同水平的表达对细胞应用于研究基因不同水平的表达对细胞应用于研究基因不同水平的表达对细胞, , , ,个体发育的影响个体发育的影响个体发育的影响个体发育的影响有何不同。有何不同。有何不同。有何不同。43哺乳动物细胞表达系统作用机制示意图作用机制示意图44哺乳动物细胞表达系统45哺乳动物细胞表达系统46哺乳动物细胞表达系统47哺乳动物细胞表达
34、系统48哺乳动物细胞表达系统四环素调控表达系统构成元件 四环素阻遏子（四环素阻遏子（Tet repressor protein,TetRTet repressor protein,TetR） 四环素操纵子（四环素操纵子（Tet operator DNA Sequence, TetOTet operator DNA Sequence, TetO） 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒Vp16Vp16转录活化区转录活化区(Vp16 activation domain,AD)(Vp16 activation domain,AD) 四环素调控反式激活子（四环素调控反式激活子（Tetracyeline-Contro
35、lled Tetracyeline-Controlled transactivator .tTAtransactivator .tTA）TetRTetR与与Vp16Vp16组成融合表达蛋白。组成融合表达蛋白。49哺乳动物细胞表达系统 四环素转录激活子（tetracyline transcriptional activatortetracyline transcriptional activator，tTAtTA）n ntTAtTA靶位点由四环素操纵子的几个拷贝靶位点由四环素操纵子的几个拷贝42bp42bp大小的串联序列大小的串联序列和一个来自细胞巨化病毒（和一个来自细胞巨化病毒（cytomeg
36、alovinas CMVcytomegalovinas CMV）的立即）的立即早期启动子启动序列组成一个重组启动子早期启动子启动序列组成一个重组启动子, ,构建成一个四环构建成一个四环素应答表达系统（素应答表达系统（ a tetracycline-responsive express a tetracycline-responsive express system,system,TRESTRES）。）。 50哺乳动物细胞表达系统n n四环素调控反四环素调控反四环素调控反四环素调控反式激活子式激活子式激活子式激活子tTAtTA; ;n n= =TetRTetR+ +ADADn n加加加加DOXD
37、OXtTA+DOXtTA+DOX结合结合结合结合则则则则tTAtTA不与不与不与不与TRETRE结合结合结合结合, ,外外外外源基因不表达源基因不表达源基因不表达源基因不表达. .反之反之反之反之, ,去去去去DOX, DOX, tTAtTA与与与与TRETRE结合结合结合结合, ,外源基因表达外源基因表达外源基因表达外源基因表达. .51哺乳动物细胞表达系统反式四环素转录激活子 反式四环素调控激活子反式四环素调控激活子rTetR (a “reverse” Tet rTetR (a “reverse” Tet repressor repressor rTetRrTetR) ) 含突变氨基酸位点
38、的含突变氨基酸位点的DNA DNA 结合蛋结合蛋白的白的, , 含含X95 Asn95 ,Leu101 Ser101 , Gly102 X95 Asn95 ,Leu101 Ser101 , Gly102 Asp102) Asp102) 。结合四环素后的结构可与调空序列。结合四环素后的结构可与调空序列结合。结合。52哺乳动物细胞表达系统nThe reverse Tet repressor (rTetR) was created by four amino acid changes that reverse the proteins response to Dox. As a result of
39、these changes, the rTetR domain of rtTA binds the TRE and activates transcription in the presence of Dox. 53哺乳动物细胞表达系统54哺乳动物细胞表达系统55哺乳动物细胞表达系统56哺乳动物细胞表达系统57哺乳动物细胞表达系统香豆霉素调控表达系统58哺乳动物细胞表达系统59哺乳动物细胞表达系统60哺乳动物细胞表达系统香豆霉素调控表达系统61哺乳动物细胞表达系统Rapid and Efficient Generation of Isogenic Expression Cell Lines u
40、sing Targeted Integration62哺乳动物细胞表达系统Rapid and Efficient Generation of Isogenic Expression Cell Lines using Targeted Integration63哺乳动物细胞表达系统64哺乳动物细胞表达系统三、展望( (一一) )改进表达载体，提高表达水平和产量改进表达载体，提高表达水平和产量( (二二) )利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本( (三三) )抑制细胞凋亡，延长培养周期抑制细胞凋亡，延长培养周期( (四四) )采用采用“糖基化糖基化”工程，提高产品质量工程，提高产品质量65哺乳动物细胞表达系统
