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1、实验八实验八 荧光分光光度法荧光分光光度法测定诺氟沙星片的含量测定诺氟沙星片的含量 仪器名称仪器名称荧光分光光度计荧光分光光度计国别厂家：日本岛津公司国别厂家：日本岛津公司 仪器型号：仪器型号：RF-5301PC一一 概述概述 什么是荧光呢？当紫外光照射到某些物质的时候，什么是荧光呢？当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光光，而，而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。第一次发现荧光现象这种光线称为荧光。第一次发现荧光现象的是的是1616世纪世纪西班
2、牙的内科医生和植物学家西班牙的内科医生和植物学家N.MonardesN.Monardes, ,提出到在提出到在含有一种称为含有一种称为“Lignum Lignum NephriticumNephriticum”的木头切片的的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。 直到直到18521852年年StokesStokes在考察奎宁和叶绿素的在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长些，才判明这种现象是入射光的波长稍长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长这些物质在吸收光能后重新
3、发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念。到从而导入了荧光是光发射的概念。到1919世世纪末人们已经知道了包括荧光素、曙红、纪末人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等多环芳烃等600600种以上的荧光物质。种以上的荧光物质。 2020世纪以来，荧光现象被研究得更多了，世纪以来，荧光现象被研究得更多了，发现了共振荧光、增感荧光，能够进行荧光产发现了共振荧光、增感荧光，能够进行荧光产率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接测定率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接测定等等。等等。 荧光分析方法的发展，与仪器应用是分不荧光分析方法
4、的发展，与仪器应用是分不开的。开的。1919世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到的，直到19281928年，才由年，才由JetteJette 和和WestWest提出了第提出了第一台光电荧光计。一台光电荧光计。19481948年由年由StuderStuder推出了第一推出了第一台自动光谱校正装置，到台自动光谱校正装置，到19521952年才出现商品化年才出现商品化的校正光谱仪器。的校正光谱仪器。 近几十年来，在其它学科迅速发展的影响近几十年来，在其它学科迅速发展的影响下，随着激光、微处理机和电子学的新成就等下，随着激光、微处理机和电子学的新成就等一些新的科学
5、技术的引入，大大推动了荧光分一些新的科学技术的引入，大大推动了荧光分析方法在理论方面的进展，并且相应地加速了析方法在理论方面的进展，并且相应地加速了各式各样新型荧光分析仪器的问世，使荧光分各式各样新型荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围很宽，包括工业、农业、提高，方法的应用范围很宽，包括工业、农业、医药卫生、环境保护、公安情报和科学研究等医药卫生、环境保护、公安情报和科学研究等各个领域中。如今，荧光分析法已发展为一种各个领域
6、中。如今，荧光分析法已发展为一种重要且有效的光谱化学分析手段。重要且有效的光谱化学分析手段。工作工作原理原理荧光分光光度计基本结构和原理图荧光分光光度计基本结构和原理图 由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发光后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大
7、器放大输至记录仪，激发光生的光电流经过放大器放大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，轮所控制，当测绘荧光发射光谱时， 将激发光单色器的光栅，固定在最适当的将激发光单色器的光栅，固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱（所记录的光谱即发射光谱（emission emission spectrumspectrum）, ,简称荧光光谱。简称荧光光谱。 当测绘
8、荧光激发光谱时，将荧光单色当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱的光谱即激发光谱(excitation (excitation spectrumspectrum）。）。 下图为诺氟沙星的激发光谱下图为诺氟沙星的激发光谱(A)和发射光谱和发射光谱(B) 当进行样品溶液的定量分析时，将激当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所选择的激发光波长处，发光单色器固定在所选
9、择的激发光波长处，将荧光单色器固定至所选择的荧光波长处，将荧光单色器固定至所选择的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。度。一、实验目的一、实验目的1 1、掌握荧光光度法的基本原理；、掌握荧光光度法的基本原理；2 2、了解荧光分光光度计的基本操作。、了解荧光分光光度计的基本操作。二、实验原理二、实验原理 按照受激方法的不同，分子发光可分按照受激方法的不同，分子发光可分为不同类型。如果分子因吸收外来辐射的为不同类型。如果分子因吸收外来辐射的光子能量而被激发，所产生的发光现象称光子能量而被激发，所产生的发光现象称为光致发光；如果分子的激发能量是由反
10、为光致发光；如果分子的激发能量是由反应的化学能或由生物体释放出的能量所提应的化学能或由生物体释放出的能量所提供，其发光现象分别称为化学发光和生物供，其发光现象分别称为化学发光和生物发光。发光。 通俗地讲，当紫外光或可见光照射某些物通俗地讲，当紫外光或可见光照射某些物质时，这些物质会发射出各种颜色和不同质时，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的波长更长的可见光，而当紫外光停强度的波长更长的可见光，而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。按分子激发态的类型这种光线称为荧光。按分子激发态的类型来划分时，由第一电子激发单重态的产生来划分时，
11、由第一电子激发单重态的产生的辐射跃迁而伴随的发光现象称为荧光，的辐射跃迁而伴随的发光现象称为荧光，而由最低的电子激发三重态所产生的辐射而由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁，其发光现象称为磷光，如图所示。跃迁，其发光现象称为磷光，如图所示。 荧光是物质在吸光之后发射出的波长荧光是物质在吸光之后发射出的波长较长的辐射，因此，溶液的荧光强度较长的辐射，因此，溶液的荧光强度(F)(F)与该溶液的吸光程度及溶液中荧光物质的与该溶液的吸光程度及溶液中荧光物质的荧光量子产率有关。荧光定量分析基于下荧光量子产率有关。荧光定量分析基于下式公式：式公式： F=2.303IF=2.303IO ObC=bC=kC
12、kC式中式中:F:F为荧光强度为荧光强度, I, Io o为入射光强度，为入射光强度，为物质的荧光量子产率，为物质的荧光量子产率，为摩尔吸光系为摩尔吸光系数，数，b b为光程，为光程，C C为荧光物质的浓度。以为荧光物质的浓度。以F-F-C C或或logF-logClogF-logC作图，即得标准曲线。样品作图，即得标准曲线。样品测其测其F F值后，根据标准曲线查得相应浓度，值后，根据标准曲线查得相应浓度，即可计算出含量。即可计算出含量。三、试剂三、试剂1.1.诺氟沙星标准溶液的配制诺氟沙星标准溶液的配制2.2.各种不同各种不同pHpH缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制 四、实验步骤四、实验步骤1
13、1、扫描诺氟沙星的激发光谱和发射光谱、扫描诺氟沙星的激发光谱和发射光谱2 2、酸度对诺氟沙星荧光强度影响、酸度对诺氟沙星荧光强度影响的测定的测定3 3、诺氟沙星标准曲线的测定、诺氟沙星标准曲线的测定4 4、诺氟沙星药片的测定、诺氟沙星药片的测定五、数据处理五、数据处理 1.1.以以F F值对值对pHpH作图，绘制出作图，绘制出pHpH影响曲线；影响曲线；2.2.以以F F值对值对gg值作图，绘制出标准曲线；值作图，绘制出标准曲线；3.3.计算出药片中诺氟沙星含量。计算出药片中诺氟沙星含量。 六、思考题六、思考题1 1、荧光强度测量与吸光度测量有何不同、荧光强度测量与吸光度测量有何不同？为什么？为什么？2 2、物质的荧光强度与哪些因素有关？、物质的荧光强度与哪些因素有关？
