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1、实验实验 出凝血检查出凝血检查上海交通大学医学院余文红（一）血标本的采取应注意的问题 1. PT、APTT凝血实验检查均使用静脉血。采血人员应技术熟练，以防止组织损伤，外源性凝血因子进入针管。 2一般血液采集，进入容器至进行实验所用的时间越短，所分析的凝血因子被保护得越好。从输液三通管取出血的做法不可取。 3取血时病人应松驰，环境温暖，防止静脉挛缩，止血带的压力要尽可能小，取血时，拉针栓的速度要慢而均匀，使血液平稳地进入注射器，防止气泡的产生。 4一旦取样完毕，立即与抗凝剂充分混合，一般提倡使用真空采血管。 5用硅化玻璃或塑料注射器采血。考虑结果的精确性，应将试管刻度的可能误差控制在既定体积的
2、10%以内。 6.采血后标本在低温保存且在一定时间范围内。 7. 国际血液学标准化委员会（ICSH）、国际血栓与止血委员会（ICTH）推荐使用3.2g/dl（含2H2O）或0.109mol/L的枸橼酸钠作为凝血因子检查的抗凝剂。 8.抗凝剂在血标本的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度，进而影响试验结果，因此应根据患者红细胞比例（Hct）状况随时调整抗凝剂用量。（二）应用试剂应注意的问题 1.组织凝血活酶工作制剂的国际敏感指数（ISI），为了使不同敏感性的组织凝血活酶在检测PT中能得到同样的结果，必须要制定一个共同的敏感性指标。 2.凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步骤必须严格按照说明书进行。通常在
3、使用前必须充分混匀试剂，以使微粒重新均匀悬浮于液体中。 3.试剂准备过程中应该使用去离子水。 4.正常对照血浆通常将多份健康人血标本混在一起，以弥补个体误差。（三）使用实验器材应注意的问题 1. 玻璃器皿的要求：贮存和测试时应选用干净、没有划痕的试管。 2. 温度的要求：人工测定终点法要求水浴箱的温度必须保持在（371），并且周围照明设备要好，便于读取终点。 （四）实验操作应注意的问题 1. 许多试验误差都来源于技术的错误。在实验技术、试剂、温度及pH值上很微小的变化都会导致试验结果明显的变化。 2. 手工法PT或试管法CT检查时，倾斜试管动作一定要轻，角度要小，以减少血液与管壁的接触面积。
4、3. 血液凝固主要是酶催化的反应，所以实验过程中要严格控制理想的pH环境和溶液的离子强度。 4. 试验结果准确还取决于所用的反应物的量、加入顺序和不同反应物的孵育时间。 5. APTT、PT需乏血小板血浆。 6. 试验前检查血浆是否有溶血、黄疸、脂血和出现凝块。 7. 报告方式：n n以PT的秒（s）数报告。n n以患者PT（s）/正常对照（s）的比（PTR）报告。n n在口服药物治疗监控时以INR报告。n nICSH规定，不再用百分比（活动度）报告。n nAPTT以秒报告。1987年WHO提出PT值用INR（international normalized ratio国际标准化比值）作为PT
5、结果报告形式，并用以作为抗凝治疗监护的指标。 INR=病人PT（s）/正常人平均PT（s）ISIPTR=受检者PT（s）/正常对照PT（s）INR=PTRISIISI：国际敏感指数（international sensitivity index）11.9 C T、P T、APTT、R T、 F g、 T T凝 血 时 间 测 定C T目的：掌握玻璃试管法凝血时间测定的方法 原理： 离体静脉血与玻璃表面接触后，血中XII因子活化并启动内源性凝血途径，最终生成纤维蛋白而使血液凝固所需的时间。器材：n n6mm直径玻璃试管3支n n静脉采血器材n n37恒温浴箱n n秒表 步骤：3支试管各1ml血，
6、每隔0.5min倾斜，第一管计时后，立即观察第二、三管并计时，直至血液凝固。结果判断：从血液刚进入注射器至第3管凝固所需时间即为凝血时间。 n n正常参考值：412分钟n n报告方式：CT X.Xmin（玻璃试管法）注意事项：n n试管应洁净干燥，抽血应“一针见血”且血液中不含泡沫。n n温度恒定为37，倾斜试管角度应在30左右。评价：n n凝血时间曾用玻片法测定，但由于毛细血管采血，易混入组织液而使凝血时间正常，属于淘汰方法。n n延长：严重内源性凝血途径凝血因子有缺陷；血中抗凝物质增多；肝素治疗n n缩短：高凝状态（DIC早期）凝 血 酶 原 时 间 P T 原理： 在乏血小板血浆中加入组
7、织因子和钙离子（钙凝血活酶）后，血浆发生凝固的时间即为凝血酶原时间（PT）。 步骤：n n取空腹静脉血1.8ml加入含有0.2ml109mmol/L枸橼酸钠的试管中混匀备用。n n抗凝血以3000r/min离心10min分离血浆n n将试剂、正常人混合血浆、待测血浆与37预热5min。n n血浆0.1ml加入混匀的试剂0.2ml，开动秒表计时。 正常参考值：n nPT：1113秒n nPTR：10.15n nINR：0.81.5 报告方式：n nPT：X.Xs，正常人血浆X.Xsn nPTR：X.Xn nINR：X.X注意事项：n n试管应洁净干燥，抽血应“一针见血”，抗凝剂与血液比例（1：9
8、）应准确。取血后4h内完成测定。n n钙凝血活酶必须标有国际敏感指数（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。n n标本测定前应先测定正常人混合血浆，其PT值在允许范围内才能测定样本。评价： 血浆凝血酶原是一种筛选试验，是用来证实先天性或获得性纤维蛋白原、凝血酶原和凝血因子V、VII、X的缺陷或相应抑制物的存在，也用于监测口服抗凝治疗时引起的凝血酶原和因子VII、X水平的下降。实质： 对检测样本（血浆）中存在凝血激酶时的再钙化反应，这种过程包括了因子VIIa、组织因子、磷脂、钙离子对凝血酶原的活化，凝血酶裂解纤维蛋白原和纤维蛋白单体的聚集交联。活化部分凝血活酶时间测定APTT 原理： 用白陶土激
9、活XII因子、脑磷脂代替血小板磷脂，测定乏血小板血浆加入Ca2+后凝固所需时间。步骤：n n采血 空腹静脉血1.8ml+0.2ml 109mmol/L枸橼酸钠混匀。n n分离血浆 3000r/min离心10分钟分离血浆。n n溶解试剂 临用时加1ml蒸馏水，室温静置15min以上，混匀后使用。n n预温活化 0.1ml血浆+APTT试剂0.1ml混匀，37准确孵育3min（其间轻轻摇动数次）n n加钙计时 加入0.1ml 25mmol/L CaCl2混匀并立即开动秒表计时，20s后，观察混合液流动状态。 n n正常参考值：一般在33.6840.32s（不同仪器和试剂所测之参考值有差别）n n报
10、告方式： APTT：XX.Xs，正常人血浆：XX.Xs注意事项：n n采血时穿刺尽量一针见血，不要淤血和气泡，采血后立即与抗凝剂混合，尽快送往实验室。使用枸橼酸盐（抗凝）血浆 n n如果不能立即测试，应尽快分离血浆，盛血浆的容器加塞，防止PH值改变n n血浆在28下保留7天 n n钙凝血活酶必须标有国际敏感指数（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。临床意义：APTT延长：n n表明有内源性凝血途径有关因子的缺陷（血友病）和纤维蛋白原缺乏。n n 纤维活力增加，如继发性，原发性纤溶以及血循环中有纤维蛋白（原）降解产物（FDP）。n n 血循环中有抗凝物质。 APTT缩短：n n 高凝状态，如D
11、IC的高凝期，促凝物质进入血液以及凝血因子的活性增高等。评价：n nAPTT和PT同时检测是目前二期止血缺陷的主要筛选试验组合。在有临床出血症状的前提下：APTT PT 提示正常 延长 因子VII的缺陷延长 正常 因子VIII、IX、XI缺陷正常 正常 怀疑因子XIII缺陷可能延长 延长 除因子II、V、I、X缺陷 外，主要是异常抗凝物质 的增多血浆复钙时间RT 原理： 在去钙离子的抗凝血浆中，重新加入适量的钙后，血浆发生凝固。步骤：n n0.2ml 0.1mol/L草酸钠+静脉血1.8ml混匀，离心分离血浆。n n0.1ml血浆置37水浴中，+0.025mol/L CaCl2 0.1ml，立
12、即开动秒表记录时间。 正常参考值： 2.080.49分（2.183.77分钟）注意事项：n n不要溶血，否则时间缩短n nCaCl2新鲜配制n n分离血浆以1000转/分为宜，高速离心可使大量血小板下沉而导致复钙时间延长。复钙交叉时间RT 步骤：按下列比例准备5份待测血浆：加样量 1 2 3 4 5受检血浆（ml） 0.01 0.05 0.09 0.10正常血浆（ml）0.10 0.09 0.05 0.01 上述试管，置37 1min，加0.025mol/LCaCl2 0.1ml，混匀后，记录血浆凝固时间。注意事项：n n所用血浆均为富含血小板血浆，分离出血浆后需在2h内检测完毕。临床意义：n
13、 nRT最早作为内源性凝血系统相关凝血因子缺陷的筛选检查，但由于这个试验不如APTT，又容易受血小板数量和功能影响，目前只用来筛选是否存在病理性抗凝物质增多。 n n延长的复钙时间如被1/10量的正常血浆所纠正，则表示受检血浆中缺乏内源凝血因子；如不被少量正常血浆纠正，提示存在异常抗凝物质。血浆纤维蛋白原Fg 纤维蛋白原的测定方法众多，大体上分三大纤维蛋白原的测定方法众多，大体上分三大类：类：n n基于经加凝血酶后，形成纤维蛋白的方法，即基于经加凝血酶后，形成纤维蛋白的方法，即可凝固蛋白法。可凝固蛋白法。n n物理、化学测定法。物理、化学测定法。n n免疫学测定法。免疫学测定法。目的和原理 为
14、了解凝血途径最后环节的状况，排除纤维蛋白原减少、异常对凝血筛选试验的影响，了解纤溶活动度等可选择本试验。 Clauss法以凝血酶作用于受检血浆中的纤维蛋白原，使其形成纤维蛋白，血液凝固。 纤维蛋白原的量与凝固时间成负相关，检测结果与参比血浆制成的标准曲线对比可得出纤维蛋白原的含量。步骤：n n将参比血浆用血浆稀释液作原倍、将参比血浆用血浆稀释液作原倍、1 1：2 2、1 1：4 4、1 1：8 8、1 1：1616稀释稀释5 5管。管。n n取稀释血浆取稀释血浆0.20.2mlml于小试管中，置于小试管中，置3737水浴预水浴预热热2 2分钟，再加凝血酶溶液分钟，再加凝血酶溶液0.10.1ml
15、ml，记录时间。记录时间。相关分析：n n首先先清除内存。INV+AC，浓度（log或In）XD，YD输入（如不取对数，浓度直接输入XD，YD 读取值DATA输入；全部数据输入完毕，按INV+9读出相关系数r。n n待测读数INV+log或In读出相关浓度。n n如不取对数，待测读数直接INV+x读出相关浓度。n n最终浓度需根据样品稀释倍数乘积。标准曲线：t（s）2520151050 0.5 1 1.5 2 2.5C（g/L） 如血浆纤维蛋白原含量大于4 g/L时，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释倍数。低于0.8 g/L时，需将原血浆改为12或15稀释，在标准曲线上查得结果后，除以5或除以2。
16、 正常参考值： 24mg/ml临床意义：n n纤维蛋白原增高除生理情况下的应激反应、妊娠后期外，主要出现感染、灼伤、动脉粥样硬化、急性心肌梗死、多发性骨髓瘤、糖尿病、败血症等。n n纤维蛋白原减少见于DIC、原发性纤溶亢进症、重症肝炎、肝硬化和溶栓治疗时。评价： Clauss方法测定的是纤维蛋白原功能，因此需纤维蛋白原结构正常，且有一定的含量，对低（无）纤维蛋白原血症和因此后纤维蛋白原血症应改用ELISA和RIA等免疫检测手段。主要误差来源：n n血浆稀释不准。n n凝血酶活性不足或失效。凝血酶一般应在低温保存，稀释后在塑料(聚乙烯)试管中，置4可保存活性24小时。n n测定终点观察不准确，尤其是纤维蛋白原含量高时，往往很快即凝固，手工法重复性较差，不易做准。 血浆凝血酶时间TT 原理n n以标准凝血酶溶液加入受检血浆，使凝血酶裂解血浆中的纤维蛋白原，形成纤维蛋白，造成血浆凝固，此时所需时间为凝血酶时间。方法： 0.1ml血浆+0.1mlTT试剂，37水浴中观察凝固时间。正常参考值： 1618S评价：n n时间大于正常参考值3秒：DIC、肝脏病变。 n nTT时间缩短，并不代表高凝状态或DIC前期，是技术原因。如操作失误，组织液混入血标本，标本在4环境中放置过久。
