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1、第八章第八章 血清学反应血清学反应 第一节血清学反应概述第一节血清学反应概述 抗原与相应抗相遇可发生特异性结合，并在外抗原与相应抗相遇可发生特异性结合，并在外界条件的作用下出现某种反应，如凝集或沉淀，界条件的作用下出现某种反应，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或藉此可用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或抗原）。因抗体主要存在于血清中，又称为抗原）。因抗体主要存在于血清中，又称为血清血清学反应学反应（serological reaction)serological reaction) 一、免疫血清学技术的类型一、免疫血清学技术的类型 按抗原抗体反应性质不同，可分为凝按抗原抗
2、体反应性质不同，可分为凝集性反应、标记抗体技术、有补体参与的集性反应、标记抗体技术、有补体参与的反应、中和反应以及电免疫反应、免疫转反应、中和反应以及电免疫反应、免疫转印、蛋白质芯片等技术。印、蛋白质芯片等技术。1 凝集试验凝集试验 直接凝集试验、间接凝直接凝集试验、间接凝 集试集试验、乳胶凝集试验验、乳胶凝集试验2 沉淀试验沉淀试验 环状沉淀试验、絮状沉淀试验、环状沉淀试验、絮状沉淀试验、琼脂扩散试验、免疫电泳琼脂扩散试验、免疫电泳3 补体参与的试验补体参与的试验 补体结合试验补体结合试验4 标记抗体技术标记抗体技术荧光抗体技术、酶标抗体技术、放射免疫测定、荧光抗体技术、酶标抗体技术、放射免
3、疫测定、化学发光标记技术、免疫电镜技术、免疫胶体化学发光标记技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术金技术5 中和试验中和试验 病毒中和试验病毒中和试验6 电免疫反应电免疫反应 免疫传感器技术免疫传感器技术7 免疫芯片技术免疫芯片技术 蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术二、血清学反应的特点二、血清学反应的特点 1、抗原抗体结合的特异性与交叉性、抗原抗体结合的特异性与交叉性 血清学反应具有高度的特异性，如猪瘟病毒的抗血清学反应具有高度的特异性，如猪瘟病毒的抗体只与猪瘟病毒结合。体只与猪瘟病毒结合。 同一抗原分子可具有多种不同的抗原表位，若两同一抗原分子可具有多种不同的抗原表位，若两种不同的抗原具有一个或多个
4、相同（相似）的抗原表种不同的抗原具有一个或多个相同（相似）的抗原表位，在与相应抗体反应时可出现交叉反应（位，在与相应抗体反应时可出现交叉反应（cross cross reacionreacion) ) 2、抗原抗体结合的可逆性、抗原抗体结合的可逆性 抗原与抗体的结合为弱能量的共价结合，抗原与抗体的结合为弱能量的共价结合，其结合力取决于抗体的抗原结合位点与抗原表其结合力取决于抗体的抗原结合位点与抗原表位之间形成的共价键的数量、性质和距离，由位之间形成的共价键的数量、性质和距离，由此可分为高亲和力、中亲和力和低亲和力抗体。此可分为高亲和力、中亲和力和低亲和力抗体。抗原抗体结合是分子表面的结合，该过
5、程受物抗原抗体结合是分子表面的结合，该过程受物理、化学和热力学的法则所制约，结合温度在理、化学和热力学的法则所制约，结合温度在040，pH在在49。如温度超过。如温度超过60或或pH在在3以以下，则可解离。下，则可解离。 等价带表示抗原与抗体比例最合适，形成等价带表示抗原与抗体比例最合适，形成大而多的结合物，此时在反应体系中测不出或大而多的结合物，此时在反应体系中测不出或有极少游离的抗原或抗体；抗体过剩带（前带）有极少游离的抗原或抗体；抗体过剩带（前带）和抗原过剩带（后带）皆表示抗原与抗体的比和抗原过剩带（后带）皆表示抗原与抗体的比例不合适，所形成的结合物少且小，在反应体例不合适，所形成的结合
6、物少且小，在反应体系中存在着较多的游离抗原或抗体系中存在着较多的游离抗原或抗体 3、抗原抗体结合的比例性与结合物的可见性、抗原抗体结合的比例性与结合物的可见性4、抗原抗体反应的阶段性、抗原抗体反应的阶段性第一阶段是抗原抗体的特异结合，此阶段仅需几第一阶段是抗原抗体的特异结合，此阶段仅需几秒到几分钟，尚无可见反应秒到几分钟，尚无可见反应第二阶段为可见反应阶段，需数分钟、数小时乃第二阶段为可见反应阶段，需数分钟、数小时乃至数日，受各种因素影响至数日，受各种因素影响 三、抗原抗体反应的主要影响因素三、抗原抗体反应的主要影响因素1、抗原和抗体浓度、比例抗原和抗体浓度、比例、抗原和抗体浓度、比例抗原和抗
7、体浓度、比例对抗原抗体反应影响最大、是决定性因素，如前所对抗原抗体反应影响最大、是决定性因素，如前所述。述。2、电解质、电解质3、温度、温度4 4、酸碱度、酸碱度 四四 血清学技术的应用血清学技术的应用一、动物疫病诊断一、动物疫病诊断二、动植物体内生理活性物质研究二、动植物体内生理活性物质研究三、物种及微生物鉴定三、物种及微生物鉴定四、生物制品研究四、生物制品研究五、动物疫病致病机理研究五、动物疫病致病机理研究六、分子生物学研究六、分子生物学研究第二节第二节 凝集反应凝集反应 （agglutination） (动画演示动画演示)凝集试验是指颗粒性抗原（细菌、细胞等）凝集试验是指颗粒性抗原（细菌
8、、细胞等）与相应的抗体，或可溶性抗原（亦可用抗体）与相应的抗体，或可溶性抗原（亦可用抗体）吸附于与免疫无关的载体，形成致敏颗粒（免吸附于与免疫无关的载体，形成致敏颗粒（免疫微球）与相应的抗体（或抗原），在有合适疫微球）与相应的抗体（或抗原），在有合适的电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块的电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块 。一、一、直接凝集试验直接凝集试验(direct agglutination test) 颗粒性抗原与相应抗体直接结合，并出现凝颗粒性抗原与相应抗体直接结合，并出现凝集现象的试验，称直接凝集试验。按操作方法，集现象的试验，称直接凝集试验。按操作方法，分为玻片法和试管法两种
9、。分为玻片法和试管法两种。1 玻片法玻片法 为一种定性试验。是将含有已知抗体的诊断为一种定性试验。是将含有已知抗体的诊断血清（适当稀释）与待检菌悬液各一滴在玻片上混血清（适当稀释）与待检菌悬液各一滴在玻片上混合，数分钟后，出现颗粒状凝集。方便快速，用于合，数分钟后，出现颗粒状凝集。方便快速，用于细菌的鉴定或分型。细菌的鉴定或分型。直接凝集反应直接凝集反应颗粒性抗原凝集素2 试管法试管法 为一种半定量试验。用以检测待检血清中为一种半定量试验。用以检测待检血清中是否存在相应抗体和测定该抗体的效价。可作是否存在相应抗体和测定该抗体的效价。可作为临床诊断或流行病学调查。操作时将待检血为临床诊断或流行病
10、学调查。操作时将待检血清进行倍比稀释，然后加入等量抗原，清进行倍比稀释，然后加入等量抗原，37水浴数小时，观察凝集程度。水浴数小时，观察凝集程度。二二 间接凝集试验间接凝集试验 （indirct agglutination） 可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒表面，然后与相无关的、一定大小的不溶性颗粒表面，然后与相无关的、一定大小的不溶性颗粒表面，然后与相无关的、一定大小的不溶性颗粒表面，然后与相应的抗体（或抗原）作用，在有电解质存在的适应的抗体（或
11、抗原）作用，在有电解质存在的适应的抗体（或抗原）作用，在有电解质存在的适应的抗体（或抗原）作用，在有电解质存在的适宜条件下，出现特异性的凝集反应。宜条件下，出现特异性的凝集反应。宜条件下，出现特异性的凝集反应。宜条件下，出现特异性的凝集反应。 常用的载体有红细胞、乳胶、炭粉、离子交常用的载体有红细胞、乳胶、炭粉、离子交常用的载体有红细胞、乳胶、炭粉、离子交常用的载体有红细胞、乳胶、炭粉、离子交换树脂等。可溶性抗原为细菌的裂解物或浸出液、换树脂等。可溶性抗原为细菌的裂解物或浸出液、换树脂等。可溶性抗原为细菌的裂解物或浸出液、换树脂等。可溶性抗原为细菌的裂解物或浸出液、病毒、寄生虫分泌物或裂解物、
12、各种蛋白等。病毒、寄生虫分泌物或裂解物、各种蛋白等。病毒、寄生虫分泌物或裂解物、各种蛋白等。病毒、寄生虫分泌物或裂解物、各种蛋白等。1 间接血凝试验间接血凝试验 (indirect hemagglutination test) 亦亦称为被动血凝试验，是将可溶性抗原致敏于称为被动血凝试验，是将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体。红细胞表面，用以检测相应抗体。 如用抗体致敏于红细胞表面，用以检测相应如用抗体致敏于红细胞表面，用以检测相应抗原，称反向间接血凝试验（抗原，称反向间接血凝试验（reverse passive hemagglutination test).正向间接凝集反应正向间接
13、凝集反应可溶性抗原载体颗粒反向间接凝集反应反向间接凝集反应抗体可溶性抗原载体颗粒2 2 乳胶凝集试验乳胶凝集试验乳胶凝集试验乳胶凝集试验 （Latex agglutination Latex agglutination test)test) 3 3 协同凝集试验（协同凝集试验（co-agglutination testco-agglutination test） 覆盖有特异性抗体的金黄色葡萄球菌与相覆盖有特异性抗体的金黄色葡萄球菌与相应的抗原结合时，可产生凝集反应，称协同应的抗原结合时，可产生凝集反应，称协同凝集试验凝集试验. .因金黄色葡萄球菌表面有因金黄色葡萄球菌表面有SPASPA，能能与
14、多种动物的与多种动物的IgGIgG结合。结合。 第三节第三节 沉淀反应沉淀反应(precipitation test) 沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在合适电解沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在合适电解质存在下，出现肉眼可见的白色沉淀。参与反应的质存在下，出现肉眼可见的白色沉淀。参与反应的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素抗原称沉淀原，抗体称沉淀素 。 可溶性抗原分子量小，单位体积内所含的量多，可溶性抗原分子量小，单位体积内所含的量多，在做定量实验时，常稀释抗原，否则易出现前带现在做定量实验时，常稀释抗原，否则易出现前带现象。象。1 环状沉淀试验（环状沉淀试验（ring precipitation
15、test) 是最简单的沉淀试验，目前仍使用。在是最简单的沉淀试验，目前仍使用。在一支小口径试管内，先加入已知抗体，然后一支小口径试管内，先加入已知抗体，然后小心沿管壁加入待检抗原叠加于抗体表面。小心沿管壁加入待检抗原叠加于抗体表面。数分钟后，液面交界处出现白色环状沉淀。数分钟后，液面交界处出现白色环状沉淀。如如Ascoli试验试验2 琼脂扩散试验（琼脂扩散试验（n n 琼脂是一种含有硫酸基的多糖，高温可琼脂是一种含有硫酸基的多糖，高温可琼脂是一种含有硫酸基的多糖，高温可琼脂是一种含有硫酸基的多糖，高温可溶解于水，冷却后形成凝胶。其呈多孔结构，溶解于水，冷却后形成凝胶。其呈多孔结构，溶解于水，冷
16、却后形成凝胶。其呈多孔结构，溶解于水，冷却后形成凝胶。其呈多孔结构，内充满水分，内充满水分，内充满水分，内充满水分，1%1%琼脂凝胶的孔径有琼脂凝胶的孔径有琼脂凝胶的孔径有琼脂凝胶的孔径有8585nmnm。因此可允许抗原抗体在里面自由扩散。因此可允许抗原抗体在里面自由扩散。因此可允许抗原抗体在里面自由扩散。因此可允许抗原抗体在里面自由扩散。（1 1）双向双扩散）双向双扩散）双向双扩散）双向双扩散（double diffusion in two dimension)double diffusion in two dimension) 又称双扩散。是在又称双扩散。是在又称双扩散。是在又称双扩散。是
17、在1%1%的琼脂凝胶板上浇的琼脂凝胶板上浇的琼脂凝胶板上浇的琼脂凝胶板上浇注注注注23 23 mmmm的凝胶板，在上面打梅花孔或长的凝胶板，在上面打梅花孔或长的凝胶板，在上面打梅花孔或长的凝胶板，在上面打梅花孔或长方形槽，在相邻孔内加抗原或抗体，在饱和方形槽，在相邻孔内加抗原或抗体，在饱和方形槽，在相邻孔内加抗原或抗体，在饱和方形槽，在相邻孔内加抗原或抗体，在饱和湿度下扩散湿度下扩散湿度下扩散湿度下扩散2424小时，观察沉淀带。小时，观察沉淀带。小时，观察沉淀带。小时，观察沉淀带。（2 2） 双向单扩散双向单扩散双向单扩散双向单扩散 （simple diffusion in two dimen
18、sion)simple diffusion in two dimension)又称辐射扩散又称辐射扩散又称辐射扩散又称辐射扩散（3 3） 单向单扩散单向单扩散单向单扩散单向单扩散（4 4） 单向双扩散单向双扩散单向双扩散单向双扩散 第四节第四节 免疫电泳技术免疫电泳技术 是凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫是凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫是凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫是凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫检测技术。检测技术。检测技术。检测技术。 抗原抗体在凝胶中扩散的同时，加入电泳抗原抗体在凝胶中扩散的同时，加入电泳抗原抗体在凝胶中扩散的同时，加入电泳抗原抗体在凝胶中扩散的同时，加入电泳的电场作用，使抗体或抗原的扩散移动速度的电场作用，使抗体或抗原的扩散移动速度的电场作用，使抗体或抗原的扩散移动速度的电场作用，使抗体或抗原的扩散移动速度加快，缩短了实验时间。加快，缩短了实验时间。加快，缩短了实验时间。加快，缩短了实验时间。n n1 免疫电泳免疫电泳n n2 对流免疫电泳对流免疫电泳n n3 火箭免疫电泳火箭免疫电泳
