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1、第五章 细菌性病害的生物防治吴云锋第一节 土传细菌病害一、主要类群 植物细菌病害是农业生产中的又一大类重要的病害，其重要性仅次于真菌病害和病毒病害。防治方法与真菌病害的防治类似。 近20年来，人们开始不断探索更加符合IPM理念的生物防治方法。土壤中存在大量习居的植物病原细菌，在适宜的条件下可以传播，侵染植物，给农业生产造成严重损失，重要的土传细菌性病害如青枯病、软腐病等。v1青枯假单胞杆菌(Pseudomonas solanacearum) 可危害44个科中的300多种植物，它引起的植物青枯病。由于土传病害用化学药物难以控制，加之化防易产生抗药性，造成环境污染，因此，土传病害的生物防治引起了国
2、内外的高度重视。 植物细菌性青枯病是由茄科植物劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性细菌病害,由土壤土传，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，在我国南方各省市均有严重发生。茄科植物劳尔氏菌菌系复杂，寄主广泛，可侵染44个科数百种植物。细细菌性枯萎病（菌性枯萎病（BacterialWiltBacterialWilt）黄瓜角斑病（黄瓜角斑病（AngularLeafSpotAngularLeafSpotFruitInfectionFruitInfection）黄瓜角斑病（黄瓜角斑病（AngularLeafSpotAngularLeafSpotleavesInfecti
3、onleavesInfection） 青枯病引起的毁灭性发病植物茎叶萎蔫下垂直至全部枯死，是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一。因此，青枯病被称为植物的“癌症”。植物青枯菌可侵染番茄、马铃薯、花生、甘薯、烟草、辣椒、茄子、生姜、草莓、香蕉以及一些贵重药材和花卉植物，数量仅次于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。至今尚没有有效的化学农药和其他防治办法。 生物防治可作为解决土传病害的一条有希望的途径。利用土壤添加剂防治植物细菌性青枯病。用植物青枯病菌无致病力产细菌素菌株防治烟草、番茄青枯病，细菌的脂多糖或细菌的胞外多糖诱导烟草、番茄抗青枯病。 青枯菌菌
4、系的组成： 青枯病菌是一个复杂的群体，有明显的生理分化，不同地区和不同寄主来源的菌株，在寄主范围、致病力、生化型、血清型等细菌学特性上差异很大，因此增加了对此病害防治研究的难度。种以下分型。有两个亚分类系统已被国际所公认。一是按不同来源菌株对不同植物种类的致病性差异，将青枯菌划分为不同的生理小种（Race）。60年代已命名4个小种：小种1号（可侵染茄科植物和其他科植物），小种2号（只侵染香蕉、大蕉和Heliconia），小种3号（只侵染马铃薯，偶尔侵染番茄和茄子），小种4号（只对姜致病力很强）。 另一个亚分类系统是根据不同菌株对三种双糖（麦芽糖、乳糖、和纤维二糖）和三种乙醇（甘露醇、山梨醇和卫
5、矛醇）氧化产酸能力的差异将青枯菌化分为4个生化变种：生化变种1（不能氧化3种双糖和3种乙醇），生化变种2（只能氧化3种双糖，不能氧化3种乙醇），生化变种3（能氧化3种双糖和3三种乙醇），生化变种4（只能氧化3种乙醇，不能氧化3种双糖）。 生理小种和生化变种的关系是这样的： 生理小种1号中包含生化变种1、3和4。生理小种2号中包含生化变种1和3。生理小种3号中包含生化变种2。生理小种4号中包含生化变种4。但是，从桑树分离的一些菌株与以往确定菌系毒力不同，其对几种代表行茄科植物的致病力很弱或不致病，而且它们具有氧化3种双糖和甘露醇的能力，因而鉴定为一种新菌系，命名为小种5号和生化变种5号。 国内现
6、在只发现小种1号和小种3号。小种1号是我国长江流域及其以南地区的优势菌系，小种3号是危害我国马铃薯的优势菌系，对我国的马铃薯生产产生重大的威胁。对大量青枯菌的检测结果表明，青枯菌存在菌细单抗特异性，但目前还不能根据这种单抗特异性对青枯菌菌系间进行实质性的亲缘关系的亚分类和分群模式。v青枯菌的致病机理： 青枯菌通常可从植物根部或茎部的伤口侵入，引起发病。也能从没有受伤的次生根的根冠部位侵入。植物生长时在次生根的根冠和主根的表皮间形成鞘，青枯菌能穿过这层鞘，侵入皮层细胞间隙生长，破坏细胞间中胶层，使细胞壁分离，变形，形成空腔，继而侵染，木质部薄壁组织使导管附近的小细胞受刺激形成侵填体，并移入侵填体
7、，侵填体破裂后继被释放进入导管，并在导管内大量繁殖和快速传播扩张，从而引起植株萎蔫死亡。 青枯菌在导管中生长时可产生大量的胞外多糖，其影响和阻碍植物体内的水分运输特别是容易对叶柄结和小叶处较小孔径导管穿孔板造成堵塞。因而引起植株枯萎;同时，青枯菌还可以分泌于细胞外多种细胞壁降解酶（如果胶酶类和纤维素酶类）其可能也在破坏导管组织。 在胞外多糖、果糖酶和纤维素酶在致病过程中的作用，青枯菌在人工培养时还能分泌一些生长调节物质如IAA，CTK和Eth等，对植物死亡方面的作用尚不清楚。克隆出了控制胞外多糖和脂多糖的基因簇eps A-D或ops-A-D，控制胞外多糖等表型转变的基因phc A。复合调节网络
8、（Complex regulatory networks,CRN）控制胞外多糖的产量，控制对某些环境或信号的反应还可控制其他致病因素。从青枯菌株K 60(小种1号,生化变种1)分离到hrp基因簇，还未能从寄主植物上找到跟hrp相对应的抗病基因。细菌性角斑病Bacterial blight (angular leaf spot) caused by Xanthomonas campestris pv. malvacearum.细菌性角斑病Bacterial blight lesions on leaf and the blackleg symptom on the leaf petiole玉米细
9、菌性茎腐病Bacterial stalk rotv2胡萝卜软腐欧氏菌（E. carotovora） 欧文氏菌属（Erwinia）的胡萝卜软腐欧氏菌（E. carotovora）俗称大白菜软腐病菌和泛菌属（Pantoea）可引起植物块根、块茎和根茎的软腐病是全世界分布的。 马铃薯和大白菜软腐病在凡有这些作物生长的地方都有发生，部分欧文氏菌属（Erwinia）细菌的一些种类常引起萎蔫症状。v3根癌土壤杆菌（A. tumefaciens） 土壤杆菌属（Agrobacterium）的根癌土壤杆菌（A. tumefaciens）又称冠瘿病菌，寄主范围广，可侵害90多科300多种双子叶植物，尤以蔷薇科植物
10、为主，引起桃、苹果、葡萄、月季的根癌病。 棒形杆菌属（Clavibacter）、劳尔氏菌属（Ralstonia）的茄科植物劳尔氏菌（R. solanacearum），其寄主范围很广，可以危害30余科，100多种植物，特别是茄科植物，能引起多种作物的青枯病。 泛生菌属的Pantoea stewartii引致玉米枯萎病等。v二、生防因子 从80年代初开始，在国内外用无致病力青枯假单胞菌菌株防治植物青枯病的生物防治研究和应用最多。 自从1978年Burr等人首先在马铃薯上报导PGPR以来, 国内外已发现包括荧光假单孢菌、芽孢杆菌、根瘤菌、沙雷氏属等20多个种属的根际微生物具有防病促生的潜能, 最多的
11、是假单胞菌属 (Pseudomonas), 其次为芽胞杆菌属 (Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、欧氏菌属 (Eriwinia)、黄杆菌属 (Flavobacterium)、巴斯德氏菌属 (Pasteuria)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属 (Enterobacter)等。 1. 假单胞杆菌 荧光假单胞杆菌（P. fluorescens）是一类常见的根际革蓝氏阴性细菌。定殖能力好和抗生素的产生是其发挥防病效果关键因素，这类细菌中的许多菌株已经作为植物病害的生防菌, 在世界范围内得到广泛的研究和应用。 荧光假单胞杆菌（P. fluorescens）等革蓝氏阴
12、性生防菌，产生抗生素等生防相关性状受到几个全局调控系统的调节，其中主要包括GacS/GacA双因子调控系统（two-component regulatory system），转录的因子和N乙酰高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactone）低分子信号介导的群体密度调控系统（quorum sensing）。2. 芽孢杆菌 芽孢杆菌（Bacillus spp.）因其易培养、易保存、有效期长等特性，较之其它生防菌更受到商家和生产上广泛的应用。用芽孢杆菌B130制成的泥炭制剂对生姜青枯病在小区试验中取得了100%的防病效果，增产34.87%48.15%。 用芽孢杆菌（Bacillus
13、 spp. ）B33和B36菌株防治香蕉、茄子和番茄青枯病，分别取得了温室试验50%、61%和95%，田间试验50%、49%和36%的防效，同时植株鲜重和生物产值也得到提高。3链霉菌 将链霉菌属的灰白链霉菌(S.canescens)、柠檬荧光链霉菌(S.citrecofluorescens)和极美链霉菌(S.pulcher)分别制成种衣剂处理番茄种子，可在4263天内控制P.solanacearum造成的青枯病。图链霉菌菌株粗提物对白菜软腐病的抑制作用图用浇混平板测定链霉菌菌株对白菜软腐病菌的拮抗作用4菌根真菌 菌根真菌由于一部分在根外，一部分在根内，而占有独特的生态位置。它们从寄主得到养分供
14、应，这一优势使它在与根系更紧密的联系中，获得更大的更有功能的总生物量，并以此增加对植物的作用。 泡囊丛枝状菌(VAM)感染的番茄根围菌根提取物可抑制P.solanacearum。菌根减弱了番茄细菌性青枯病的严重程度，VAM的作用机制可能是建立了一种机械屏障，阻止病原细菌进入寄主组织。5基因工程生防菌 采用转座子Tn5诱变P.solanacearum，获得了世界首例植物青枯菌胞外蛋白输出缺失突变体(简称eep突变体)。该突变体在缺失了多种胞外蛋白外输功能后，也失去了对寄主的致病力。eep突变体接种到植物体内后，在局部范围内有一定的定殖能力。温室和田间小区生防试验中，该突变体在30天以内有一定防治
15、效果。6转基因植物工程 植物抗细菌病害的基因工程目前总体上尚处于基因分离阶段。用Ti质粒作载体转入烟草，由此克服细菌素基因易于丢失的缺陷(因其多为核外基因控制)，并使转化烟株获得对多种病原细菌的抗性。将可抑制P.solanacearum的抗菌肽（cecropin B）转入烟草植株，并成功地得到了mRNA水平上的表达。但是植株体内可检测的cecropin B蛋白水平和对青枯病的抗性并未提高，很可能是由于cecropin B被植物内生蛋白酶降解的原因。 美国路易斯安那州立大学Jaynes等(1993)将cecropin B的类似物shival的基因转入烟草植株，发现此植株的子代在接种了强毒性P.s
16、olanacearum后能够比对照推迟显症，降低发病程度和死亡率。将cecropin B和shival基因成功地转入马铃薯叶碟和薯块，转基因植株对中国P.solanacearum优势小种3的野生型或强毒株表现出抗性。 1992年在国际上首先报道了该病菌hrp基因产物harpin，现在进行该基因的调控和作为生物制剂的应用研究。 放射土壤杆菌（Agrobacterium. radiobacter）K84菌株产生抗生素-土壤杆菌素A84，该菌株也是第一个商业化最成功的产品, 目前美国上市的荧光假单孢菌类PGPR生物制剂就有8种以上，并成功应用于农业生产实践的生防因子。 已用于防治多种园艺作物的根癌病
17、，防治由经济重要的植物病原菌冠瘿土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）引起的多种寄主植物的冠瘿病，而碱性土壤有利于诱导荧光假单胞菌的抑病性。细菌易于生长，可以进行种子处理或灌土，具有广谱拮抗性，商品化生产有广阔的前景。 革蓝氏阳性细菌中芽孢杆菌（Bacillus spp.）在自然界中分布广泛，极易分离培养，易于繁殖，产孢时货架期较长，而且是非病原性的。其内生孢子耐热、耐干旱，所以较其它拮抗菌具有明显的生态优势。芽孢杆菌(Bacillus)的几个菌株已经商品化，使用发酵技术生产，批量生产工艺较简单，成本也较低，施用简便可算得上一种较理想的生防微生物。 如种子农药处理，pH
18、值等土壤因子，栽培品种，长期储存等有很高的耐性，液剂和粉剂均可贮存几个月。而其它的生防因子，如假单胞菌（Pseudomonas）不适于大规模生产，稳定性差是一个限制因子。v三、生防机制 土传细菌病害生物防治的主要机制：v营养和生态位的竞争；v产生植物生长促进物质；v多种抗菌代谢物；v嗜铁素和细胞壁降解酶；v诱导系统抗性。 细菌生防因子菌生防因子可通过多种作用机制减少病害的发生。包括产生抗生素、毒素和溶菌酶，直接寄生病菌菌丝或繁殖体，竞争营养和空间；促进植物生长及诱导植物抗性的机制。1. 1. 细菌素菌素 无致病力的青枯假单胞菌（ABPS）防治青枯病的机制是由于产生了细菌素。说明细菌素在生防中起
19、着重要作用。 细菌素菌素是由细菌的某些菌系所产生的对该种细菌的另外一些菌株或关系较近的细菌有杀伤作用的含蛋白的抗菌物质。 细菌素菌素的分子量为19000 Dalton，该细菌素具有蛋白质性质，含16种氨基酸。多为核外基因控制。细菌素的作用范围有限,一般是对相应细菌起作用,不会对农业生态系统其他有益微生物产生不利的影响。 生防菌生防菌P.fluorescens BC8P.fluorescens BC8菌株菌株能产生一种具螺旋结构的棒状颗粒形细菌素，由外壳和内核两部分组成，称为FluocinBC8。青枯菌产生的细菌素特异性较强。 利用利用细菌素菌素防治土传病害的例子很多。利用产细菌素无致病力的青枯
20、假单胞菌可以防治烟草青枯病 。ABPS 菌株MAT 和noE - 104 对细菌素敏感的毒性菌株防治效果明显高于不敏感菌,说明细菌素在生防中起重要作用。从noE - 104中提纯出生物活性的细菌素,分子量为9 0009 000 Dalton ,该细菌素具有蛋白质的性质,含有16 种氨基酸。 水稻的菊欧文氏菌( Erwinia chrysanthemi ) 产生小分子性质细菌素，用来防治小麦纹枯病、番茄早疫病、水稻白叶枯病、辣椒疫霉病等多种病害都有不同的防治效果,其中,对小麦纹枯病的田间防效达60 %以上。2. 2. 其它抗菌物其它抗菌物质 抗菌物质有2-2-酮基葡糖酸基葡糖酸，表现抗生作用。另
21、外，有些产生胞外多糖胞外多糖、吲哚衍生物衍生物等。 洋葱假单胞杆菌(P.cepacia)B5菌株产生2-酮基葡糖酸，是一种抗青枯菌的物质，将少量该物质加入含P.solanacearum的土壤悬浮液中可杀死病原菌。颖壳假单胞菌（P.glumae）对番茄青枯病除抗生素的拮抗作用外，胞外多糖也有一定的控制作用。 吲哚衍生物衍生物，尤其是3-吲哚丙酸(3-indolepro-pionicacid)和3-吲哚丙烯酸(3-indoleacrylicacid)可选择性地抑制P.solanacearum。3. 3. 噬菌体噬菌体 用含噬菌体的无毒青枯菌株M4S对烟草进行预处理，可有效降低青枯病的发病程度;用噬
22、菌体和M4S菌株共同进行处理则效果更佳。4. 4. 定殖位点的定殖位点的竞争争 一个好的生防菌株在寄主根围小生境中能否占据有利位点而定殖，也是取得理想防效的关键。 nOE-104能在番茄植株根部定殖， 并对致病菌LE-101在根部的增殖有抑制作用。用P.fluorescens BC8菌株可在15天内保护90%的幼苗不受青枯病菌侵染。因为K84菌系主要是阻止和干扰病原物致病而不是杀菌和治疗。菜豆菌核病菌菜豆菌核病菌S.rolfsii尖孢镰刀菌F. oxysporum假单胞菌P.agglomeransIC1270Assayonantagonismonplate腐霉菌丝核菌4. 4. 诱导抗性抗性
23、用细菌的无毒变异株作为诱导物成功地诱导出了植物抗病性。用青枯菌无致病力菌株A-P7和A82对花生做茎部毛细管滴注接种，可诱导茎部产生抗病性，抗病性可维持10天以上，且具有一定传导性。 用无致病力P.solanacearum菌株Str-10接种番茄，可诱导植株产生一种细菌生长抑制物番茄素(tomatine)。非致病的青枯菌接种烟草能诱导产生凝集素。受到根结线虫(Meloidogyne spp.)危害后可使植物组织发生变化，更易受到青枯菌侵染，从而提高发病速度和严重程度 总之，不同的菌株生防机制不同，同一菌株亦可能有几种防治机制同时起作用。所以在实际应用中须对症下药，辩证施治，方能达到防病治病的效
24、果。四、防治方法（一）植物细菌性青枯病1. 1. 芽芽孢杆菌的利用杆菌的利用 已有很多成功应用的PGPR产品。最早成功地应用和商业化的产品由Gustafson公司生产。 PGPR是枯草芽孢杆菌A13 (Bacillus subtilis A13) ,是由Broalbent等分离得到的A13能抑制植物病原菌和促进许多种植物的生长, 用A13处理种子, 可以提高胡萝卜产量 48% , 燕麦产量33 %和花生产量37%, A13的作用似乎是通过抑制病原菌和刺激植物生长来促进植物生长发育的。 v 1988年在美国注册商品名分别为Quantum 、Kodiak 和Epic ,主要用在花生上, 所用菌株枯
25、草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）A13、GB03、GB07。1990年美国Auburn大学的科研人员进一步将A13应用在棉花和豌豆上并实现了商品化, 应用面积大约有 4.0106 hm2 。v 用芽孢杆菌（Bucillus spp.）系列防治白菜软腐病、水稻白叶枯病。 芽孢杆菌B130制成的泥炭制剂对生姜青枯病取得了100%的防效, 增产34.87%48.15%。印度的Anuratha和Gnanamanickam用芽孢杆菌（Bacillus spp.）B33和B36菌株防治香蕉、茄子和番茄青枯病, 分别取得了温室试验50 %、61 %和 95% , 田间试验50 %、49%和3
26、 6%的防效, 同时植株鲜重和生物产值也得到提高。从烟草、番茄、胡萝卜、芒果、柑橘等作物根和根部土壤中分离并筛选到对青枯菌具有较强抑菌作用的芽孢杆菌。 通过网室盆栽试验和病地小区试验，拮抗细菌对烟草青枯病具有一定的防治作用。刘琼光等将从芒果根际土壤中分离得到的拮抗细菌Bacillus spp.对烟草青枯病的防效高, 而且防效较为稳定, 植株生长更好, 到烟草采收后期, 防效仍高达80%。3个菌株在对番茄青枯病具有防病作用的同时, 还可以提高种子的发芽率。分离自丝瓜土壤的枯草芽孢杆菌TG26浸根处理防治烟草青枯病, 苗期防效可达100 % , 田间试验防效为 79.6% , 并有明显的增产效应。
27、v2. 无致病力青枯菌的应用 用ABPSM4S菌株及其噬菌体, 日本的Hara和Ono用ABPSOM2菌株, 朝鲜的Yi用ABPSY61-1菌株, 用 3个ABPS菌株防治烟草青枯病, 均取得温室或小区试验的良好防效, 但后期防效降低, 大田试验尚未取得成功。 用自发突变ABPS菌株Tm3对番茄青枯病的防治试验, 该菌株同样存在防效不稳定的问题,防病机理是细菌素的抗生作用和诱导寄主抗病性。 用ABPS菌株MA-7和nOE-104防治番茄青枯病，均取得温室或小区试验的良好防效，但后期防效降低，主要原因是由于ABPS菌株在大田土壤中不能大量繁殖，缺乏与其它微生物的竞争力所致。从土壤中分离到的革兰氏
28、阳性细菌如芽孢杆菌和链霉菌菌株往往很少能够在植物的根区定殖并形成一个庞大的群体，而Pseudomonas属细菌常能在植物根围土壤中大量增殖，许多菌株对植物有抑制病害、促进生长的作用。 早期藤井薄(1974)试用噬菌体防治番茄青枯病未能获得成功。v3. 假单胞菌的利用 利用拮抗的假单胞菌（Pseudomonas spp.）在温室防治番茄、烟草、花生青枯病,防效较好。日本的Wakimoto用颖壳假单胞菌 (P. glumae)的一个无致病力菌株防治番茄青枯病, 防效较好。用荧光假单胞菌 (P. fluorescens) JF1菌株对花生种子浸泡诱导接种, 菌液对土壤中青枯菌的侵染具有明显抑制作用。
29、 用颖壳假单胞菌(P.glumae)的一个无致病力菌株防治番茄青枯病，不仅由于该菌株能产生抗菌物质，还由于它能优先占领定殖位点，或引起寄主组织的诱导抗性。S. rolsfiiF. melonis IC1270P. aphanidermatumR. solaniControlIC1270BiocontrolofS.rolfsiionbeansBiocontrolofF. melonisonmelonBiocontrolofP. aphanidermatumoncucumberv4. 链霉菌的利用 将 3个链霉菌菌株: 灰白链霉菌 (S. canescens)、柠檬荧光链霉菌 (S. citrec
30、ofluorenscens)和极美链霉菌 (S. pulcher) 分别制成种衣剂处理番茄种子, 可在 4263内控制茄科植物劳尔氏菌（R. solanacearum）引起的青枯病。 用放线菌899和65防治花生青枯病有一定的效果。至今，用于青枯病生物防治的因子主要是无致病力的青枯假单胞菌和其它有益微生物。 用S. lavendulae能产生一种糖甙类抗生素, 多年的室内和田间试验表明该菌对大白菜软腐病、水稻白叶枯病以及马铃薯青枯病等细菌性病害具有很好的防治效果。（二）根癌病的生物防治 根癌病是果树、林木和花卉上一种重要的根部病害，由根癌土壤杆菌（A. tumefaciens）侵染引起，寄主范
31、围多达93科331属,643种植物。 我国北方以葡萄发病较严重，南方以桃树发病较普遍。病树树势弱，生长迟缓，寿命缩短，产量减少。影响苗木质量及果品的产量和品质。 根据表型上的明显不同，通常根癌土壤杆菌（A. tumefaciens）可分为3个生物型（biotypes）或生化变种(biovars)。属于生物型的菌株通常寄主范围很宽，并产生酮基糖；属于生物型的菌株主要产生毛根症状（A. rhizogenes），携带Ri质粒；而属于生物型的菌株通常寄主范围仅限于葡萄，偏爱酒石酸，而不是葡萄糖作碳源，并产生多聚半乳糖醛酸酶。 放射土壤杆菌（A. radiobacter）是一种与根癌土壤杆菌（A. tu
32、mefaciens）亲缘关系相近的土传细菌，不侵染植物。菌株K84产生的选择性抗生素土壤杆菌素K84 (Agrocin-84)，是冠瘿碱农杆糖酯A（opine agrocinopine A）的类似物，农杆糖酯A和胭脂碱是由根癌土壤杆菌Ti质粒编码，在瘿瘤中产生，作为病原细菌的营养物质。土壤杆菌素K84与农杆糖酯A结构相似，所以经由同一转运系统被根癌土壤杆菌吸收，但是一旦进入细菌细胞，土壤杆菌素K84则抑制DNA的复制和细菌细胞的生长。v 放射土壤杆菌K84已经成为一项较成功的生防措施。自1973年以来，已经在澳大利亚、美国制成细菌剂商品出售，并引入到其它国家用于李属（Prunus）、苹果属（M
33、alus）、柳属（Salix）、葡萄属（Vitis）、山楂属（Crataegus）、山核桃属（Carya）、蔷薇属（Rosa）、梨属（Pyrus）、茼蒿属（Chrysanthemum）和悬钩子属（Rubus）等多种植物上防治根癌病。 也可用草炭吸附后用作粉剂，K84是一种生物保护剂，必须在病菌侵入前使用，才能获得良好效果。用于拌种、浸根，或者两者并用，均能使桃树等核果类的根癌防效率分别达到78%，95%和99%，但直接施于土壤则效果不佳，而且必须是在病原物侵染之前处理，因为K84菌系主要是阻止和干扰病原物致病而不是杀菌和治疗。一般施用的有效菌量为1091010CFU/ml。不同根癌土壤杆菌菌株
34、对土壤杆菌素K84的反应不同。核果类果树根癌病的菌株对它是敏感的，所以用K84防治桃根癌病有效，而对防治葡萄根癌病则无效，因为两者属于不同的生物型。 放射土壤杆菌HLB-2和MI15能抑制葡萄根癌病菌的生长和致瘤。王慧敏（2000）等研究成功的抗根癌菌剂已经获准农药登记和工业化生产，对多种果树根癌病防治取得了显著效果。使用方法包括浸种、浸根和浸插条等，细菌悬浮液的浓度约为106CFU。 用草生欧氏杆菌（Erwinia herbicola）防治梨火疫病（E.amylovra）；第二节 存在的问题与改进方法一、存在问题 植物细菌病害的生物防治已经取得了一定的成就，但从整体上看，利用生防菌防治植物病
35、害还存在不少问题。 为提高生防菌的防治效果，尚需要在许多方面进行改进。尽管公众对应用微生物生防因子防治土传病害的兴趣越来越浓厚，但是，仍然存在许多问题： 1. 微生物生防因子的根部定植能力差 2. 拮抗活性不强，抗菌谱较窄， 3. 易受温、湿度、化学农药和周围其它微生物等环境因素的影响. 导致了生物防治的效果不稳定，从而影响了微生物制剂的商品化及其应用，目前只有少数商品化的细菌制剂，而且市场份额很低。二、改进方法v1. 不同的生防因子组合使用 多数植物病害生物防治是采用单一的生防因子，较窄的抗菌谱，是导致其在田间防效不稳定的原因之一。但是通过具有不同的抗菌谱、不同的生防机制及不同定植方式的各种
36、生防菌株的组合，可以实现这一目标。前提是在不同的拮抗菌之间没有交互抑制，这也是抑菌土的抗病机制之一。所以不同的生防菌株的兼容性是能否混合使用及其成功与否的关键。v肠杆菌属的Enterobacter cloacae和假单胞菌（Pseudomonas spp.）当与钩木霉（Trichoderma hamatus）组合使用时，对防治立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的猝倒病的效率明显高于钩木霉（T. hamatus）单独使用的效果。v 几种生防真菌和细菌生防因子，包括木霉（Trichoderma）, 粘帚霉（Gliocladium）, 假单胞菌（Pseudomonas）, 芽孢杆
37、菌（Bacillus）, 土壤杆菌（Agrobacterium）, 肠杆菌（Enterobacter）和沙雷氏菌（Serratia），尽管单一生防因子，如木霉等也可以有效防治多种植物病原物，通过协同作用可以提高防治效果。所以不同的生防因子的组合，可能因每个组分定植不同的植物，适应不同的环境或具有不同的功能和作用机制，是提供长期有效的生物防治所必需的。v(2) 与其它措施协调组合应用 生物防治只是IPM策略的一个组成部分，IPM的目标是通过协调运用多种措施来管理有害生物和环境，使有害生物造成的危害控制在经济允许水平之下，最大限度地减少对人类和环境的为害。 生防因子与低剂量的化学农药组合使用被认为
38、是成功防治作物病害的IPM措施，菌药结合既可降低用药量，又可以稳定生物防治的效果，是值得深入探索的新领域。如在田间哈茨木霉（T. harzianum） 与低剂量的溴甲烷混合使用，通过明显的协同作用有效抑制了茄丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的胡萝卜种苗立枯病，与推荐的高剂量浓度溴甲烷具有相似的效果。 另外生防因子与土壤日晒（solarization）消毒处理相结合是利用自然条件，综合治理作物病害的又一条有效途径。 v(3) 遗传改良已有的生防菌株，并开发新的超级工程生防菌 Mandels（1971）等首先利用遗传诱变因子获得了比野生型产生更多纤维素酶的绿色木霉（T. viri
39、de）菌株，增强了生防能力和对某些杀菌剂的耐药性。 Howell(1982) 获得的绿色粘帚霉（Gliocladium virens）突变株在产生抗生素glioviren能力上与野生菌株不同。Papavizas（1985）和他的同事利用紫外诱变，从哈茨木霉（T. harzianum）和绿色木霉（T. viride）中获得对苯来特等苯丙咪唑类杀菌剂具高度耐药性（50 g/ml）的遗传突变株。 其中几个生物型与野生菌株在土壤中的生存能力及土壤中腐生的茄丝核菌（R. solani）抑制能力上有差异，而其它几个生物型在抑制豌豆终极腐霉（Pythium ultimum）, 棉花立枯病菌（R. solan
40、i）, 菜豆菌核病菌（Sclerotium rolfsii）和洋葱白腐小菌核菌（S. cepivorum）等土传病原真菌上，则表现出比野生菌株更强的生防能力。 Amad和 Baker（1987）通过暴露哈茨木霉（T. harzianum）分生孢子于N-甲基, N-硝基亚硝基胍，也获得对耐苯来特的遗传突变株，而且其产生纤维素酶和利用纤维素为唯一碳源的能力优于野生菌株。 应用现代遗传工程原理，通过原生质体融合和基因工程技术，研究开发遗传修饰的工程微生物（GMM, genetically modified microorganisms）菌株是一条有效的途径。 遗传工程的优势是将孤立的基因引入其他生防
41、真菌或细菌菌株，创造出高效、稳定和持久的单一工程生防菌株，能防治多种植物病害。以及通过整合各种已知生防菌株中不同的生防相关基因，并持续或过量表达，以提高其竞争力、生防效率和稳定性，从而筛选抗菌谱广，根际竞争能力强以及具有更高抗菌活性和植物生长促进能力的超级工程生防菌株。 例如，转ACC (氨基环丙烷羧酸)解氨酶基因的荧光假单胞菌P. fluorescens CHAO菌株，通过分解乙烯的前体ACC，生防和促生能力都明显增强。 Ossana 和Mischke（1990）利用粗糙脉孢（Neurospora crassa）的-微管蛋白tubulin基因（编码对杀菌剂的抗性），成功转化了对苯来特非常敏感
42、的绿色粘帚霉（G. virens）野生菌株G1-21，转化子获得了对杀菌剂苯来特的抗性。 耐苯来特的绿色木霉（T. viride）生物型T-1-R9，已申请了美国农业部的专利，能有效防治尖镰孢菌菊花专化型（Fusarium oxysporum f. sp. chrysanthemi）和丝核菌（Rhizoctonia）引起的菊花病害，与杀菌剂苯来特同样有效。但是可能因为抗菌谱较窄，没有注册商品化。 通过对细胞壁降解酶基因改良木霉菌株，可使其生防能力明显增强。例如粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的几丁质酶基因被引入哈茨木霉（T. harzianum）的基因组，在组成型真核启动
43、子的控制下，来自细菌的几丁质酶基因在哈茨木霉中得到高水平的表达； 将哈茨木霉（T. harzianum） 42-kDa的内切几丁质酶基因在里氏木霉纤维素酶强启动子的控制下，表达活性增加10倍，生防能力明显增强。此外通过蛋白酶和纤维素酶的过量表达也改善了木霉菌的生防活性，减少了棉花种苗立枯病(R. solani)和根腐病（Pythium）的发生率。 v（4）应用技术的改进 作为既能防病又能增产的PGPR生物制剂产业化前景广阔。产业化品种主要有两种：活体制剂和PGPR代谢产物制剂, 前者即应用PGPR活菌体, 直接进行植物病害的防治, 其生防机制包括拮抗作用、交叉保护作用和诱导抗性作用。 从生态学
44、观点看, 活菌应用还有利于改善土壤和植物体的微生态环境。目前, 国内外的活体PGPR生物制剂主要有粉剂和颗粒剂两种产业化品种。 PGPR代谢产物制剂即应用PGPR菌在深层发酵过程中的代谢产物, 应用时直接针对植物病原菌或针对病原菌的代谢产物如抗菌素、细菌素、溶菌酶等等,其作用主要为抑菌或杀菌。 生产针对寄主植物的代谢产物, 主要称为激发子, 其主要作用是激发寄主植物产生防卫反应, 微生物来源的激发子近年来已发现的有寡糖类、寡聚糖类、肽类、小分子蛋白、脂肪类和糖蛋白类等。因此, 代谢产物制剂, 可以制成抗菌素类产品, 也可研制成激发子类产品, 或两者兼而有之的复合型产品。这些产品都可以利用基因重
45、组、高表达技术和先进的生物工程下游技术, 以提高产品产量和质量。 PGPR微胶囊生物技术应用 微胶囊技术就是用特殊的方法将固体、液体或气体物质包埋封存在一种微型胶囊内而成为固体微粒产品, 在需要时再将被包埋的内容物释放出来的技术。 PGPR活菌制剂应用的一个大障碍是菌剂的稳定性和商品货架期短的问题, 芽孢杆菌由于有抗逆性非常强的芽孢, 能较好地克服这一障碍。如果其它类型的细菌或放线菌如能利用微胶囊生物技术, 选择适合的材料和结构, 将不仅在PGPR菌种稳定性上发挥作用, 而且可望形成新的应用模式和开发出性能卓越的产品来。 总之，从目前的研究看，无论是土传的真菌病害，还是土传的细菌病害的生物防治
46、都显示了十分诱人的应用前景。达到抵抗或抑制有害微生物, 有效保护作物的目的而又有利于环境友好, 实在是一举多得。植物病害生物防治产品的研究和产业化, 是今后国内外绿色植物栽培可持续发展利用的热点, 也是今后一段时期内农业生物技术发展的重要领域和方向之一。 第三节 食用菌细菌性病害 食用菌细菌性病害包括：细菌性斑点病、软腐病、干腐病等，其中细菌性斑点病是造成世界上栽培蘑菇经济损失的重要病害。 细菌性斑点病是一种假单胞杆菌引起的双孢蘑菇的常见病害，在高温高湿条件下极易发病。这种病原菌在成熟子实体菌盖和菌柄的表面造成轻微内陷的褐色病斑，此病使英国蘑菇产量损失510，并有10降级。在防治中除使用杀菌剂
47、外，近几年已筛选分离出与病原体亲缘关系最近的拮抗菌荧光假单孢杆菌。 M98和AM20是较好的拮抗菌，可以使蘑菇细菌性斑点病的拮抗率在50以上。拮抗菌必须施于第一潮菇出现之前，因为一旦病原菌在蘑菇中定殖，防治效果就很小。拮抗菌一次施用的最佳施用时间是在覆土时，即与病原菌同时施用，但在栽培过程中施用拮抗菌3次，则防治更为成功。 臭味假单胞杆菌可抑制斑点病症状的发生，臭味假单胞杆菌是有益菌，有促进双孢蘑菇子实体产生的作用。可在商业室内栽培试用，使覆土中拮抗菌的数量大大超过病原菌。 采用土霉素防治细菌斑点病效果显著，蘑菇子实体大批出土时，用120粒土霉素(含量25万单位粒，剂量025克粒)加水100千
48、克喷施，每天1次，连喷两次，当子实体零星生长时，再用15粒土霉素加水50千克，每隔两天喷1次，连喷两次，另外结合通风合理喷水调节湿度，其效果更佳。Thesoilrepresentsafavorablehabitatformicroorganisms.Usuallybetweenoneandtenmillionmicroorganismsarepresentpergramofsoil-withbacteriaandfungibeingthemostprevalent.However,theavailabilityofnutrientsisoftenlimitingformicrobialgrow
49、thinsoilandmostsoilmicroorganismsmaynotbephysiologicallyactiveinthesoilatagiventime.SoilscorrespondtothesurfacelayeroftheEarthscrust(lithosphere).Theyconsistofmineralparticlesandoforganicmatterderivedfromtheremainsofplants,animals,andmicroorganisms.Mineralandorganicparticlesareintimatelymixedinsoil,
50、formingvarioustypesofsoilaggregates,andarefoundinassociationwithair(i.e.thesoilatmosphere)andanaqueousphase(i.e.thesoilsolution)intheporesexistingbetweenparticlesand/oraggregates.Themicrobialcommunityofthesoilecosystem.Plantdiseasescausedbysoilborneplantpathogenshavebeenshowntobeinhibitedbysoils.Soi
51、lsuppressivenessmaybeconstitutive,aninherentpropertyofthesoilregardlessofitscroppinghistory,oradaptive,wherebysoilsuppressionisonlyachievedafteraspecificculturalpractice-suchasmonocroppinghasbeenadopted.SoilsuppressivenessofFusariumwiltofmelonsandofGaeumannomyces graminisvar.tritici(Ggt)-take-allofw
52、heatareexamplesofconstitutiveandadaptivesoilsuppression,respectively.Severalmicroorganismscanbeinvolvedinsoilsuppressionofasingledisease.StudiesofwhysomesoilscannaturallysuppressplantdiseaseswhileotherscannothaveprovidedthebasisofmostresearchonBCAs.Microorganismsconstitutelessthan0.5%(w/w)ofthesoilm
53、ass,howevertheyhaveamajorimpactonsoilpropertiesandprocesses.Thisfactstimulatedinteresttosoilmicrobes,including1.Identificationoforganismspresentandelucidationoftheirrelationshipwithothermembersofthesoilcommunitybasicecologicalstudies2.Assessmentoftheactivityofmicrobesparticipatinginprocessesofagricu
54、ltureimportance,suchasnitrogenfixation,nitrogenmineralization(NO2nitrite;NO3nitrate),orpesticidedecomposition3.Selectionoforganismscapableofproducingeconomicallyimportantproducts(e.g.antibiotics)3.Soilmicroorganismscanincreasetheamountofnutrientspresentinthesoil.Forinstance,nitrogen-fixingbacteriaca
55、ntransformnitrogengaspresentinthesoilatmosphereintosolublenitrogenouscompoundsthatplantrootscanutilizeforgrowth.5.Thesemicroorganisms,whichimprovethefertilitystatusofthesoilandcontributetoplantgrowth,havebeentermedbiofertilizersandarereceivingincreasedattentionforuseasmicrobialinoculantsinagricultur
56、e.6.Contributionofrhizospheremicrobialcommunitiestodevelopmentofastablesoilstructureconductivetoplantcommunitydevelopment(e.g.improvedsoilaggregation)vIn contrast to these beneficial soil microorganisms, other soil microorganisms are pathogenic to plants and may cause considerable damage to crops. v
57、Large numbers of pathogenic microorganisms are routinely found in the soil and many of them can infect the plant through the roots. vHowever, certain native microorganisms present in the soil are antagonistic to these pathogens and can prevent the infection of crop plants. Antagonism against plant p
58、athogens usually involves competition for nutrients and/or production of inhibitory compounds such as secondary metabolites (antimicrobial metabolites and antibiotics) and extracellular enzymes. Other soil microorganisms produce compounds that stimulate the natural defence mechanisms of the plant an
59、d improve its resistance to pathogens. Collectively, these soil microorganisms have been termed biopesticides and represent an emerging and important alternative (i.e. biological control) to the use of chemical pesticides for the protection of crops against certain pathogens and pests.directly,throu
60、ghintroductionofspecificmicrobialantagonistsintothesoilorplantmaterial, orindirectly,bychangingtheconditionsprevailingintheplantsenvironment,andthusthemicrobiologicalequilibriumofitsecosystem.Insomecases,acombinationofindirectanddirectapproachesleadstothebestbiocontrolresultsBiologicalcontrolofplant
61、diseasescanbeachieved:PGPRFree-livingrootandsoilbacteriahavebeenstudiedbymanyauthorsaspossibleinoculantsforenhancingcropproductivity.Itwasfoundthatselectrhizospherebacteriacouldcolonizeplantrootsinthepresenceofanindigenoussoilmicrophlora.Suchbacteriawhichexhibitrootcolonizationhavebeentermed“rhizoba
62、cteria”.Rhizobacteriawithbeneficialeffectsonhostplanhavebeentermed“plantgrowthpromotingrhizobacteria”(PGPR).Thisdefinitiondoesnotrequirethatbiologicalcontrolbeinvolvedinthestimulationofplantgrowth.Fluorescentpseudomonadsarethelargestandpotentiallymostpromisinggroupofplantgrowth-promotingrhizobacteri
63、ainvolvedinthebiocontrolofplantdisease.Otherplant-growthpromotingrhizobacteriaincludeAeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Enterobacter, Serratia, and Rhizobium. SoilPhenotypeCotplotsAllisolatesStrain23AE. coliTree41biotypes,80%similarityFivedominatingbiotypes,43%ofthestrain
64、sDNATorsvik et al., 1990E. coliCalf thymusSoilTorsvik et al., 1990Torsvik et al., 1990Group specific:a a Proteobacteria (19-35)C. testeroni, sulfate reducers, many others (645-680)Universal Domain-Bacteria 1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010111112121313141415151616171718181919202021212222232324242525262
65、6272728282929303031313232333334343535363637373838393940404141424243434444454546464747484849495050# # helix-loop numberhelix-loop numberBacteria ArcheaEukaria16S rRNA molecules DNA extraction (purified from humic acids): a DNA mixture originating from “all” the organisms present in the sampleDenatura
66、tionPrimers annealing with targeted sequencesAmplification cyclesRestriction siteCloning step:PCR product is a mix of molecules “reflecting”the original DNAClone sequencingPhylogenetic analysisIIIIIIIVVMaking rDNA LibrariesNodeSistertaxaOutgroupBootstrappingSupportthebranchingpattern(%)Maximumlikeho
67、odanalysis500boostrapreplicationsGCCTTCCCACTTCGTTTALabeledprobeDAPISTAININGDAPI+FLUOSSTAININGSna23a-Cy5Sna8b-FLUOST3-TRIC10m mmWholecellhybridizationRuymietal.,1994Pace,1996Fungi and bacteriaCulturable and unculturableABCDEDNA extraction (purified from humic acids): a DNA mixture originating from “a
68、ll” the organisms present in the sampleDenaturationPrimers annealing with targeted sequencesAmplification cyclesRestriction siteCloning step:PCR product is a mix of molecules “reflecting”the original DNAClone sequencingPhylogenetic analysisIIIIIIIVVMaking rDNA LibrariesFORWARD PRIMER- UNIVERSALREVER
69、SE PRIMER-BACTERIALRED: Stop codons in three framesLIGHT BLUE: SacI restriction siteM=A/C; Y=C/TLabrenzetal.,2000Labrenzetal.,20001ppm0.1ppmOrganisms that feed upon living biomass.Parasitism and predationPredatory bacteria:Bdellovibrio and like organismsDiseasesParasitic wasp laying eggson hornwromNematodes can make up to of all animal species in soil
