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1、病毒学总论病毒学总论 1.病毒的基本形状与细菌比较有何不同？2.病毒的变异在病毒的致病性和实验室检测 中有何意义？3.病毒的分类在病原学诊断中有何作用？4.疑忌病毒性感染的病人标本如何采集、保 存和送检？5.病毒的快速诊断方法有哪些？第一节第一节病毒的基本特性病毒的基本特性病毒（病毒（virus）：）：最微小的、结构最简单的非细胞型微生物。最微小的、结构最简单的非细胞型微生物。特征特征1体积微小；体积微小；2非细胞结构，非细胞结构，结构简单结构简单“一包基因一包基因”而且仅一种核酸；而且仅一种核酸；3严格的胞内寄生（分子水平寄生；）严格的胞内寄生（分子水平寄生；）4以复制方式繁殖；以复制方式繁
2、殖；5抵抗力特殊；抵抗力特殊；6在医学微生物中占重要地位在医学微生物中占重要地位病毒感染占病毒感染占75%轰动效应轰动效应传染性强，传播快，流行传染性强，传播快，流行广，诊治困难，病死率高，后遗症严重广，诊治困难，病死率高，后遗症严重与肿瘤相关与肿瘤相关分子生物分子生物学研究的重要工具。学研究的重要工具。一、一、 病毒的大小、形态与组成病毒的大小、形态与组成（一）病毒的大小与形态（一）病毒的大小与形态（一）病毒的大小与形态（一）病毒的大小与形态1.1.病毒大小：以纳米表示病毒大小：以纳米表示病毒大小：以纳米表示病毒大小：以纳米表示, , 根据大小分为大、中、小三型根据大小分为大、中、小三型根据
3、大小分为大、中、小三型根据大小分为大、中、小三型大型病毒：大型病毒：大型病毒：大型病毒：200200300nm300nm如痘病毒如痘病毒如痘病毒如痘病毒中型病毒：中型病毒：中型病毒：中型病毒：8080160nm160nm又分为中小型与中大型：又分为中小型与中大型：又分为中小型与中大型：又分为中小型与中大型：中小型病毒：中小型病毒：中小型病毒：中小型病毒：8080120nm120nm如流行性感冒病毒和腺病如流行性感冒病毒和腺病如流行性感冒病毒和腺病如流行性感冒病毒和腺病毒等毒等毒等毒等中大型病毒：中大型病毒：中大型病毒：中大型病毒：120120160nm160nm如副流感病毒与疱疹病如副流感病毒
4、与疱疹病如副流感病毒与疱疹病如副流感病毒与疱疹病毒等毒等毒等毒等小型病毒：小型病毒：小型病毒：小型病毒：181830nm30nm如鼻病毒与脊髓灰质炎病毒等如鼻病毒与脊髓灰质炎病毒等如鼻病毒与脊髓灰质炎病毒等如鼻病毒与脊髓灰质炎病毒等 2.2.形态：呈多样性，大致分形态：呈多样性，大致分形态：呈多样性，大致分形态：呈多样性，大致分5 5种类型种类型种类型种类型球形、杆形（丝形）、弹性、砖形、蝌蚪状球形、杆形（丝形）、弹性、砖形、蝌蚪状球形、杆形（丝形）、弹性、砖形、蝌蚪状球形、杆形（丝形）、弹性、砖形、蝌蚪状3333. .观察及测量：电镜、滤过、超速离心、观察及测量：电镜、滤过、超速离心、观察及
5、测量：电镜、滤过、超速离心、观察及测量：电镜、滤过、超速离心、X X线衍射线衍射线衍射线衍射（二）病毒的结构与化学组成（二）病毒的结构与化学组成病毒的结构病毒的结构基本结构基本结构核衣壳（核衣壳（nucleocapsid）（病毒体）（病毒体）病毒病毒核心（核心（core）衣壳（衣壳（capsid）辅助结构辅助结构包膜（包膜（envelope）1.病毒核心（病毒核心（viralcore）是病毒的中心结构，其内充满是病毒的中心结构，其内充满DNA或或RNA一种核酸，构成病一种核酸，构成病毒的基因组。毒的基因组。2.病毒衣壳：包绕在核酸外面的蛋白质外壳病毒衣壳：包绕在核酸外面的蛋白质外壳衣壳由衣壳由
6、壳粒（壳粒（capsomere）组成组成形态亚单位形态亚单位壳粒由多肽分子组成壳粒由多肽分子组成结构亚单位结构亚单位根据壳粒排列方式不同，病毒有三种对称型根据壳粒排列方式不同，病毒有三种对称型螺旋对称螺旋对称二十面体立体对称二十面体立体对称复合对称复合对称核衣壳核衣壳病毒体病毒体基本功能单位基本功能单位感染单位感染单位3.辅助结构辅助结构某些病毒在核衣壳外包被有包膜，是病毒以出芽方式某些病毒在核衣壳外包被有包膜，是病毒以出芽方式从细胞内释放时穿过核膜、胞质膜、空泡膜等，在核衣从细胞内释放时穿过核膜、胞质膜、空泡膜等，在核衣壳外获得了宿主细胞的膜成分。壳外获得了宿主细胞的膜成分。包膜有无：裸病毒
7、（包膜有无：裸病毒（nakedvirus）包膜病毒（包膜病毒（envelopedvirus）有的包膜上有刺突有的包膜上有刺突(spike)或包膜子粒或包膜子粒包膜表面表达病毒基因编码的病毒特异抗原包膜表面表达病毒基因编码的病毒特异抗原因包膜的基质是脂类，故对脂溶剂敏感，乙醚因能因包膜的基质是脂类，故对脂溶剂敏感，乙醚因能破坏包膜而灭活病毒，故常用来鉴定病毒有无包膜。破坏包膜而灭活病毒，故常用来鉴定病毒有无包膜。核酸（核酸（DNA/RNA)蛋白质蛋白质保护核酸保护核酸结构蛋白：结构蛋白：参与感染参与感染具有抗原性具有抗原性非结构蛋白：病毒酶类（病毒复制，非结构蛋白：病毒酶类（病毒复制，抑制宿主相
8、应功能）抑制宿主相应功能）脂类和糖：脂类和糖：主要存在于包膜中主要存在于包膜中维护病毒体结构完整性维护病毒体结构完整性与宿主细胞有亲和及融合的性能与宿主细胞有亲和及融合的性能表现病毒种、型抗原性表现病毒种、型抗原性与病毒引起机体中毒症状有关与病毒引起机体中毒症状有关（一）病毒的复制周期（一）病毒的复制周期（一）病毒的复制周期（一）病毒的复制周期（replicationcyclereplicationcycle）吸附吸附吸附吸附穿入穿入穿入穿入脱壳脱壳脱壳脱壳生物合成生物合成生物合成生物合成组装成熟组装成熟组装成熟组装成熟释放释放释放释放1111. .吸附（吸附（吸附（吸附（adsorption
9、adsorption）亲嗜性亲嗜性亲嗜性亲嗜性病毒表面吸附位点病毒表面吸附位点病毒表面吸附位点病毒表面吸附位点宿主细胞表面受体宿主细胞表面受体宿主细胞表面受体宿主细胞表面受体易感性易感性易感性易感性特异性、不可逆的结合特异性、不可逆的结合特异性、不可逆的结合特异性、不可逆的结合二、病毒的增殖二、病毒的增殖2.穿入（穿入（penetration）吸附后进入细胞内吸附后进入细胞内3.脱壳（脱壳（uncoating）脱去衣壳、核酸裸露脱去衣壳、核酸裸露穿入穿入脱壳脱壳4.生物合成生物合成（biosynthesis）合成大量病毒核酸和结构蛋白合成大量病毒核酸和结构蛋白（1 1）DNA病毒病毒 早期早期
10、mRNA转录转录 早期蛋白质转译（功能蛋白）早期蛋白质转译（功能蛋白） 复制子代核酸复制子代核酸 晚期晚期mRNA转录转录 晚期蛋白质转译（结构蛋白）晚期蛋白质转译（结构蛋白）（2）RNA病毒合成: 遗传信息存在于RNA分子上n n单正链单正链( (ssRNAssRNA+ +)RNA)RNA病毒是按病毒是按“ “ssRNAssRNAproteinprotein” ”方式方式进行进行 n n单负链单负链( (ssRNAssRNA)RNA)RNA病毒（如流感病毒等）按病毒（如流感病毒等）按“ “ssRNAssRNAssRNAssRNAproteinprotein” ”方式进行方式进行 n n双链双
11、链RNARNA病毒复制：是先由双链中的负链病毒复制：是先由双链中的负链RNARNA复制出新正复制出新正链链RNARNA，再由新正链再由新正链RNARNA复制出新的负链复制出新的负链RNA,RNA,子代病毒子代病毒RNARNA全部为新合成的双链全部为新合成的双链RNARNA。正链正链RNARNA又翻译出子代病又翻译出子代病毒的结构蛋白和非结构蛋白。毒的结构蛋白和非结构蛋白。病毒病毒RNA逆转逆转录酶录酶RNA：DNA杂交中间体杂交中间体RNA酶酶H水解水解负单链负单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA整合酶整合酶整合到细胞染色体上（前病毒）整合到细胞染色体上（前病毒）转录转录子代子代RNAm
12、RNA翻译翻译结构蛋白结构蛋白子代病毒子代病毒释放释放（3）逆转录病毒（）逆转录病毒（retrovirus）非结构蛋白非结构蛋白装配装配5.组装（组装（assembly）与释放（与释放（release）（1 1）破胞释放：无包膜病毒在宿主细胞内经复制周破胞释放：无包膜病毒在宿主细胞内经复制周期可增殖数百至数千个子代病毒，致使细胞破裂而一期可增殖数百至数千个子代病毒，致使细胞破裂而一次性将病毒全部释放至细胞外。次性将病毒全部释放至细胞外。（2 2）芽生释放：包膜病毒在宿主细胞内复制时，胞）芽生释放：包膜病毒在宿主细胞内复制时，胞质膜上会出现病毒基因编码的抗原物质，这些部位也质膜上会出现病毒基因编
13、码的抗原物质，这些部位也是核衣壳出芽的位置。是核衣壳出芽的位置。（二）病毒的生长曲线（二）病毒的生长曲线一步法生一步法生长曲曲线或或单峰峰实验分析：分析： 隐蔽期：也称黑暗期，当接种病毒后数小蔽期：也称黑暗期，当接种病毒后数小时内找不到内找不到任何病毒任何病毒颗粒粒 潜伏期潜伏期( (latent period)latent period)：是病毒成熟：是病毒成熟阶段，段，为细胞胞外新的病毒第一次出外新的病毒第一次出现之前的之前的时间； 对数生数生长期期( (logarithmic period)logarithmic period)：病毒数量的：病毒数量的对数数与与时间成比例增加，成比例增加
14、，产生大量子代病毒，生大量子代病毒，释放到放到细胞外的胞外的病毒出病毒出现波峰波峰( (burst)burst)。三、病毒的遗传和变异（一）病毒的基因组（一）病毒的基因组n n病毒核酸仅含一种类型，病毒核酸仅含一种类型，病毒核酸仅含一种类型，病毒核酸仅含一种类型，DNADNA或或或或RNARNAn n形态多样性（单一线形、双股环状）形态多样性（单一线形、双股环状）形态多样性（单一线形、双股环状）形态多样性（单一线形、双股环状）n n完整性不同（完整的、分节段的）完整性不同（完整的、分节段的）完整性不同（完整的、分节段的）完整性不同（完整的、分节段的）n n还有携带反转录酶的还有携带反转录酶的还
15、有携带反转录酶的还有携带反转录酶的RNARNA病毒病毒病毒病毒n n可突变，并决定其表型可突变，并决定其表型可突变，并决定其表型可突变，并决定其表型（二）遗传物质变异的类型（二）遗传物质变异的类型1.基因突变基因突变突变株突变株指病毒基因碱基序列改变，导致表型性状改变的毒株指病毒基因碱基序列改变，导致表型性状改变的毒株条件致死性突变株条件致死性突变株（conditional-lethalmutant）温度敏感突变株温度敏感突变株（temperaturesensitivemutant,ts株株）为条件致死性突变株中应用最广泛的为条件致死性突变株中应用最广泛的缺陷型干扰突变株缺陷型干扰突变株（de
16、fectiveinhibitionmutant，DIM）宿主范围突变株宿主范围突变株（hostrangemutant,hr突变株）突变株）耐药突变株耐药突变株（drug-resistantmutant） 2. 基因重组与重配两种不同病毒感染同一细胞时，可发生基因交两种不同病毒感染同一细胞时，可发生基因交两种不同病毒感染同一细胞时，可发生基因交两种不同病毒感染同一细胞时，可发生基因交换而换而换而换而形成新性状的重组体。形成新性状的重组体。形成新性状的重组体。形成新性状的重组体。基因重组（基因重组（基因重组（基因重组（recombinationrecombination）不分节段基因组病不分节段基
17、因组病不分节段基因组病不分节段基因组病毒毒毒毒基因重配（基因重配（基因重配（基因重配（reassortmentreassortment）分节段基因组的病分节段基因组的病分节段基因组的病分节段基因组的病毒毒毒毒类型：类型：类型：类型： 活病毒之间：活病毒之间：活病毒之间：活病毒之间：N0H0+N1H1N0H1 活病毒与灭活病毒之间（交叉复活）活病毒与灭活病毒之间（交叉复活）活病毒与灭活病毒之间（交叉复活）活病毒与灭活病毒之间（交叉复活） 灭活病毒灭活病毒灭活病毒灭活病毒 之间（多重复活）之间（多重复活）之间（多重复活）之间（多重复活）活病毒与灭活病毒之间（交叉复活）活病毒与灭活病毒之间（交叉复活
18、）A3株（流行株）株（流行株）新新A3抗原抗原鸡胚中增殖不良鸡胚中增殖不良A1株（非流行株）株（非流行株）旧旧A1抗原抗原鸡胚中生长良好鸡胚中生长良好鸡胚中共同培养鸡胚中共同培养重组体（理想疫苗）重组体（理想疫苗）有有A3抗原抗原鸡胚中生长良好鸡胚中生长良好UV灭活灭活3.基因整合（基因整合（geneintegration）病毒基因组（病毒基因组（DNA病毒与逆转录病病毒与逆转录病毒）毒）与细胞细胞基因组的重组过程。与细胞细胞基因组的重组过程。整合可引起宿主细胞基因改变整合可引起宿主细胞基因改变细细胞遗胞遗传性改变传性改变细胞转化细胞转化个别可发生细胞恶化个别可发生细胞恶化肿瘤肿瘤互补互补：一
19、种病毒为另一种病毒提供本身不能合成，但又是必需的：一种病毒为另一种病毒提供本身不能合成，但又是必需的基因产物，而使其在混合感染的细胞内得以繁殖。基因产物，而使其在混合感染的细胞内得以繁殖。辅助病毒与缺陷病毒之间辅助病毒与缺陷病毒之间活病毒与死病毒之间活病毒与死病毒之间两个不同的缺陷病毒之间两个不同的缺陷病毒之间（三）病毒非遗传物质变异的类型（三）病毒非遗传物质变异的类型加强：加强：一种病毒与另一种非杀细胞病毒同时感染细胞，后者能增一种病毒与另一种非杀细胞病毒同时感染细胞，后者能增加前一种病毒复制产量的现象（极个别病毒之间）加前一种病毒复制产量的现象（极个别病毒之间）如：如：I型副流感病毒为水泡
20、性口炎病毒的加强病毒。型副流感病毒为水泡性口炎病毒的加强病毒。表型混合表型混合镶嵌包膜或衣壳镶嵌包膜或衣壳表型交换表型交换衣壳误配衣壳误配遗传物质不改变，而只有遗传物质不改变，而只有基因产物的交换，传代后基因产物的交换，传代后恢复亲代表型。恢复亲代表型。+第二节第二节病毒的分类病毒的分类一、一、一、一、 分类原则分类原则分类原则分类原则n n核酸的性质与结构核酸的性质与结构核酸的性质与结构核酸的性质与结构n n病毒大小与形态病毒大小与形态病毒大小与形态病毒大小与形态n n衣壳对称性和壳粒数目衣壳对称性和壳粒数目衣壳对称性和壳粒数目衣壳对称性和壳粒数目n n有无包膜有无包膜有无包膜有无包膜n n
21、对理化因素的敏感性对理化因素的敏感性对理化因素的敏感性对理化因素的敏感性n n抗原性抗原性抗原性抗原性n n生物学特性（繁殖方式、宿主范围、传播途径和致病性）生物学特性（繁殖方式、宿主范围、传播途径和致病性）生物学特性（繁殖方式、宿主范围、传播途径和致病性）生物学特性（繁殖方式、宿主范围、传播途径和致病性）二、病毒分类系统和命名二、病毒分类系统和命名 （一）病毒分类一般系统病毒分类系统将病毒分类为科(families)、属(genera)、种(species)等三级，或科、亚科、属、种等四级。根据病毒体的形态、基因结构和复制模式等特征将病毒分为科和亚科；在科或亚科中又根据理化特性和血清学特性等
22、分病毒属，属名后缀为virus，属下分为不同的病毒种。分类分类可将病毒分为科、亚科和属可将病毒分为科、亚科和属常用核酸类型分类常用核酸类型分类1DNAvirus(DNA病毒中有病毒中有9科科)2RNAvirus(ssRNA7科科.ssRNA7科科.dsRNA2科科)3反转录病毒反转录病毒(DNA和和RNA反转录病毒中有反转录病毒中有2科科)依传播方式和感染部位分类依传播方式和感染部位分类1虫媒病毒虫媒病毒2肠道病毒肠道病毒3呼吸道病毒呼吸道病毒4肝炎病毒肝炎病毒5性传播病毒性传播病毒（二）非寻常病毒的分类（二）非寻常病毒的分类1卫星病毒（卫星病毒（satellites）2类病毒（类病毒（vir
23、oids）3朊粒（朊粒（prion）第三节 病毒学诊断自身免疫病和肿瘤密切相关。病毒性疾病在人类疾自身免疫病和肿瘤密切相关。病毒性疾病在人类疾自身免疫病和肿瘤密切相关。病毒性疾病在人类疾自身免疫病和肿瘤密切相关。病毒性疾病在人类疾病中占有十分重要的地位。病中占有十分重要的地位。病中占有十分重要的地位。病中占有十分重要的地位。由于病毒感染的防治原则不同于细菌等其他微生物，由于病毒感染的防治原则不同于细菌等其他微生物，由于病毒感染的防治原则不同于细菌等其他微生物，由于病毒感染的防治原则不同于细菌等其他微生物，尽早判定病人感染或某传染病的流行是由病毒所致，是尽早判定病人感染或某传染病的流行是由病毒所
24、致，是尽早判定病人感染或某传染病的流行是由病毒所致，是尽早判定病人感染或某传染病的流行是由病毒所致，是医生和微生物学实验室的责任和任务。医生和微生物学实验室的责任和任务。医生和微生物学实验室的责任和任务。医生和微生物学实验室的责任和任务。病毒的分离与鉴定当然是病毒病原学诊断的金标准，病毒的分离与鉴定当然是病毒病原学诊断的金标准，病毒的分离与鉴定当然是病毒病原学诊断的金标准，病毒的分离与鉴定当然是病毒病原学诊断的金标准，但因病毒是严格细胞内寄生，病毒分离必须但因病毒是严格细胞内寄生，病毒分离必须但因病毒是严格细胞内寄生，病毒分离必须但因病毒是严格细胞内寄生，病毒分离必须有活的细胞支持，故病毒的分
25、离鉴定较困难。有活的细胞支持，故病毒的分离鉴定较困难。一、标本的采集、运送和处理一、标本的采集、运送和处理n n1.1.应在感染早期（发病应在感染早期（发病1 12 2天内）采集。天内）采集。n n2.2.必须无菌操作，对用于病毒分离培养的污染标本用必须无菌操作，对用于病毒分离培养的污染标本用高浓度抗生素处理过夜，必要时需加抗真菌药高浓度抗生素处理过夜，必要时需加抗真菌药物等物等n n3.3.及时送检，送检的组织等可放入含有抗生素的及时送检，送检的组织等可放入含有抗生素的50%50%甘油缓冲盐水或二甲基亚砜中低温冷藏。甘油缓冲盐水或二甲基亚砜中低温冷藏。n n4.4.血清学检查的标本，尤其检测
26、抗病原体的血清学检查的标本，尤其检测抗病原体的IgGIgG型抗型抗体，应分别在发病初期和恢复期采集双份血清，体，应分别在发病初期和恢复期采集双份血清，只只有当恢复期血清抗体效价比初期升高有当恢复期血清抗体效价比初期升高4 4倍或以上，倍或以上，才具有确诊意义。才具有确诊意义。分离培养鉴定分离培养鉴定( (污染标本用抗生素处理过夜污染标本用抗生素处理过夜) )快速诊断快速诊断鸡胚鸡胚红红细细胞胞凝凝集试验集试验红红细细胞胞凝凝集集抑抑制制试试验验细胞培养细胞培养CPECPE电镜检测电镜检测中和试验中和试验TCID50TCID50pfupfu测定测定MOIMOI测定测定动物接种动物接种观观 察察
27、发发 病病情况情况中和试验中和试验免免 疫疫 学学 检检测测ID50ID50测定测定LD50LD50测定测定形态学形态学电镜观察电镜观察病毒颗粒病毒颗粒（大小、（大小、形态）形态）光学显微镜光学显微镜观察观察包涵体包涵体抗原抗原检测检测ELISAELISAIFIFRIARIAWBWB核酸检测核酸检测核酸电泳核酸电泳核酸杂交核酸杂交PCRPCR基因芯片基因芯片基因测序基因测序抗体抗体检测检测ELISAELISARIARIAIFIFWBWB病毒成分检测病毒成分检测 标本采集标本采集 二、病毒的分离与鉴定二、病毒的分离与鉴定 以下情况需考虑进行病毒分离与鉴定：以下情况需考虑进行病毒分离与鉴定：以下情
28、况需考虑进行病毒分离与鉴定：以下情况需考虑进行病毒分离与鉴定：1.1.病程长且诊断困难的病人。病程长且诊断困难的病人。病程长且诊断困难的病人。病程长且诊断困难的病人。2.2.怀疑为新现病毒（怀疑为新现病毒（怀疑为新现病毒（怀疑为新现病毒（emergent virusemergent virusemergent virusemergent virus）感染或已被消灭感染或已被消灭感染或已被消灭感染或已被消灭的病毒性疾病怀疑的病毒性疾病怀疑的病毒性疾病怀疑的病毒性疾病怀疑“ “死灰复燃死灰复燃死灰复燃死灰复燃” ”。 3.3.为鉴别临床上具有相同症状的疾病。为鉴别临床上具有相同症状的疾病。为鉴别临
29、床上具有相同症状的疾病。为鉴别临床上具有相同症状的疾病。 4.4.监测所用减毒活疫苗。监测所用减毒活疫苗。监测所用减毒活疫苗。监测所用减毒活疫苗。 5.5.用于病毒生物学性状的研究或流行病学调查等。用于病毒生物学性状的研究或流行病学调查等。用于病毒生物学性状的研究或流行病学调查等。用于病毒生物学性状的研究或流行病学调查等。（一）病毒的分离培养（一）病毒的分离培养1 1细胞培养：细胞培养：原代培养细胞、原代培养细胞、原代培养细胞、原代培养细胞、 二倍体细胞株、传代细胞二倍体细胞株、传代细胞二倍体细胞株、传代细胞二倍体细胞株、传代细胞系或株系或株系或株系或株标本接种后溶细胞型感染病毒可致细胞出现细
30、胞病毒标本接种后溶细胞型感染病毒可致细胞出现细胞病毒标本接种后溶细胞型感染病毒可致细胞出现细胞病毒标本接种后溶细胞型感染病毒可致细胞出现细胞病毒效应（效应（效应（效应（CPECPE），），），），稳定感染病毒细胞并不出现明显病变，但稳定感染病毒细胞并不出现明显病变，但稳定感染病毒细胞并不出现明显病变，但稳定感染病毒细胞并不出现明显病变，但被感染的细胞膜表面会表达病毒蛋白等标志物，如血凝素、被感染的细胞膜表面会表达病毒蛋白等标志物，如血凝素、被感染的细胞膜表面会表达病毒蛋白等标志物，如血凝素、被感染的细胞膜表面会表达病毒蛋白等标志物，如血凝素、神经氨酸酶、病毒特异性抗原等。神经氨酸酶、病毒特异性
31、抗原等。神经氨酸酶、病毒特异性抗原等。神经氨酸酶、病毒特异性抗原等。2 2鸡胚培养和动物接种鸡胚培养和动物接种：流感病毒的分离培养虽可用犬肾传代细胞（流感病毒的分离培养虽可用犬肾传代细胞（流感病毒的分离培养虽可用犬肾传代细胞（流感病毒的分离培养虽可用犬肾传代细胞（MDCKMDCK）, ,但鸡胚接种仍是最常用的敏感而特异的方法。但鸡胚接种仍是最常用的敏感而特异的方法。但鸡胚接种仍是最常用的敏感而特异的方法。但鸡胚接种仍是最常用的敏感而特异的方法。动物接种是最原始的分离病毒的方法，但目前少用。动物接种是最原始的分离病毒的方法，但目前少用。动物接种是最原始的分离病毒的方法，但目前少用。动物接种是最原
32、始的分离病毒的方法，但目前少用。 （二）病毒的鉴定1病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标（1）细胞病变（ cytopathiceffect,CPEcytopathiceffect,CPE ）大多数病毒属溶细胞型感染，在敏感细胞内增殖会大多数病毒属溶细胞型感染，在敏感细胞内增殖会大多数病毒属溶细胞型感染，在敏感细胞内增殖会大多数病毒属溶细胞型感染，在敏感细胞内增殖会出现出现出现出现CPECPE。CPECPE表现为细胞内颗粒增多、圆缩、聚集、融表现为细胞内颗粒增多、圆缩、聚集、融表现为细胞内颗粒增多、圆缩、聚集、融表现为细胞内颗粒增多、圆缩、聚集、融合，有的可形成包涵体，出现细胞溶解、脱落、死亡等。合，
33、有的可形成包涵体，出现细胞溶解、脱落、死亡等。合，有的可形成包涵体，出现细胞溶解、脱落、死亡等。合，有的可形成包涵体，出现细胞溶解、脱落、死亡等。不同病毒的不同病毒的不同病毒的不同病毒的CPECPE特征不同。因此，观察病毒所致特征不同。因此，观察病毒所致特征不同。因此，观察病毒所致特征不同。因此，观察病毒所致CPECPE的特点，根据细胞类型，细胞病变种类可对标本中感的特点，根据细胞类型，细胞病变种类可对标本中感的特点，根据细胞类型，细胞病变种类可对标本中感的特点，根据细胞类型，细胞病变种类可对标本中感染的病毒进行判定。染的病毒进行判定。染的病毒进行判定。染的病毒进行判定。脊髓灰质炎病毒感染所致
34、CPEa. 未感染的vero细胞（一种非洲绿猴肾细胞系）b. 脊髓灰质炎病毒感染的vero细胞（显示细胞圆缩、分散 、 坏死、脱落）。 （2）红细胞吸附（hemadsorption）包膜上带有血凝素的病毒感染敏感细胞后，包膜上带有血凝素的病毒感染敏感细胞后，包膜上带有血凝素的病毒感染敏感细胞后，包膜上带有血凝素的病毒感染敏感细胞后， 血凝素血凝素血凝素血凝素会出现于细胞膜表面，使感染细胞能与加入的红细胞结合会出现于细胞膜表面，使感染细胞能与加入的红细胞结合会出现于细胞膜表面，使感染细胞能与加入的红细胞结合会出现于细胞膜表面，使感染细胞能与加入的红细胞结合出现红细胞吸附现象，这是检测正粘病毒和副
35、粘病毒的间出现红细胞吸附现象，这是检测正粘病毒和副粘病毒的间出现红细胞吸附现象，这是检测正粘病毒和副粘病毒的间出现红细胞吸附现象，这是检测正粘病毒和副粘病毒的间接指标接指标接指标接指标。（3）中和试验（neutralization test, NT）用抗某病毒血清先与待测病毒悬液混合，经作用一定用抗某病毒血清先与待测病毒悬液混合，经作用一定用抗某病毒血清先与待测病毒悬液混合，经作用一定用抗某病毒血清先与待测病毒悬液混合，经作用一定时间后接种敏感细胞，培养后观察时间后接种敏感细胞，培养后观察时间后接种敏感细胞，培养后观察时间后接种敏感细胞，培养后观察CPECPE或或或或 红细胞吸附现红细胞吸附现
36、红细胞吸附现红细胞吸附现是否消失，即特异性抗体是否能是否消失，即特异性抗体是否能是否消失，即特异性抗体是否能是否消失，即特异性抗体是否能 中和相应病毒的感染。中和相应病毒的感染。中和相应病毒的感染。中和相应病毒的感染。如用不同浓度的抗血清如用不同浓度的抗血清如用不同浓度的抗血清如用不同浓度的抗血清 进行中和试验，还可根据抗体的进行中和试验，还可根据抗体的进行中和试验，还可根据抗体的进行中和试验，还可根据抗体的效价对待测病毒效价对待测病毒效价对待测病毒效价对待测病毒 液进行半定量检测。液进行半定量检测。液进行半定量检测。液进行半定量检测。 （1）空斑形成试验（plaque formation）
37、（2）50%组织细胞感染量 （3）感染复数 （Multiplicity of infection, MOIMultiplicity of infection, MOI）2病毒感染性测定及病毒数量测定病毒感染性测定及病毒数量测定 三、病毒感染的快速诊断病毒的分离与鉴定是病毒诊断的金标准，病毒的分离与鉴定是病毒诊断的金标准，但临床实验室应用困难，而且费时，对临床病但临床实验室应用困难，而且费时，对临床病毒感染症的诊治帮助不大。快速诊断主要指临毒感染症的诊治帮助不大。快速诊断主要指临床标本绕过分离培养复杂而较长的过程，直接床标本绕过分离培养复杂而较长的过程，直接在电镜下观察病毒颗粒，或直接检测标本中
38、的在电镜下观察病毒颗粒，或直接检测标本中的病毒成分和病毒成分和IgM抗体等，以作出快速和早期诊抗体等，以作出快速和早期诊断。断。 （一）形态学检查1电镜和免疫电镜检查含有高浓度病毒颗粒（含有高浓度病毒颗粒（含有高浓度病毒颗粒（含有高浓度病毒颗粒（10107 7颗粒颗粒颗粒颗粒/ /mlml）的样品，可直的样品，可直的样品，可直的样品，可直接应用电镜技术观察。对含低浓度病毒的样本可用免疫电接应用电镜技术观察。对含低浓度病毒的样本可用免疫电接应用电镜技术观察。对含低浓度病毒的样本可用免疫电接应用电镜技术观察。对含低浓度病毒的样本可用免疫电镜技术，或用超速离心机将标本离心进行电镜观察，以提镜技术，或
39、用超速离心机将标本离心进行电镜观察，以提镜技术，或用超速离心机将标本离心进行电镜观察，以提镜技术，或用超速离心机将标本离心进行电镜观察，以提高检出率和特异性。电镜下不仅能观察病毒的形态学特征，高检出率和特异性。电镜下不仅能观察病毒的形态学特征，高检出率和特异性。电镜下不仅能观察病毒的形态学特征，高检出率和特异性。电镜下不仅能观察病毒的形态学特征，还可测量病毒的大小。还可测量病毒的大小。还可测量病毒的大小。还可测量病毒的大小。2光学显微镜检查病理标本或含有脱落细胞及针吸细胞的标本检测病病理标本或含有脱落细胞及针吸细胞的标本检测病病理标本或含有脱落细胞及针吸细胞的标本检测病病理标本或含有脱落细胞及
40、针吸细胞的标本检测病毒包涵体。包涵体对病毒的诊断有一定价值。观察病毒毒包涵体。包涵体对病毒的诊断有一定价值。观察病毒毒包涵体。包涵体对病毒的诊断有一定价值。观察病毒毒包涵体。包涵体对病毒的诊断有一定价值。观察病毒CPECPE。病理标本根据病理特征，再配合组化染色技术进行。病理标本根据病理特征，再配合组化染色技术进行。病理标本根据病理特征，再配合组化染色技术进行。病理标本根据病理特征，再配合组化染色技术进行诊断。诊断。诊断。诊断。 （二）病毒蛋白抗原检测1.酶联免疫技术（ELISA）2.免疫荧光标记技术（IF）3.放射免疫标记（SPRIA）这些技术操作简便、特异性强、敏感性高。尤这些技术操作简便
41、、特异性强、敏感性高。尤其使用单克隆抗体标记技术可测到其使用单克隆抗体标记技术可测到ng（10-9g）至至pg（10-12g）水平的抗原或半抗原。其中由于放射水平的抗原或半抗原。其中由于放射性核酸可引起放射性污染，已逐渐被非放射性标记性核酸可引起放射性污染，已逐渐被非放射性标记物（如地高辛等）所代替。物（如地高辛等）所代替。 （三）早期抗体检测（三）早期抗体检测1IgM型特异抗体检测检测病毒感染机体产生的特异性IgM，如孕妇羊水中查到IgM型特异抗体可早期诊断某些病毒引起的胎儿先天性感染；IgM抗体测定有助于早期诊断，但感染机体产生IgM抗体有明显个体差异。2免疫印迹试验（Westernblo
42、t,WB）某些病毒感染的诊断需持慎重认真的作法。如AIDS和成人白血病等，在初筛试验阳性后，尚需用WB法进行确认试验。 （四）检测病毒核酸1 1核酸电泳：正粘病毒属和呼肠病毒属的核酸是分节段核酸电泳：正粘病毒属和呼肠病毒属的核酸是分节段核酸电泳：正粘病毒属和呼肠病毒属的核酸是分节段核酸电泳：正粘病毒属和呼肠病毒属的核酸是分节段的，甲型流感病毒的，甲型流感病毒的，甲型流感病毒的，甲型流感病毒8 8个节段，轮状病毒个节段，轮状病毒个节段，轮状病毒个节段，轮状病毒1111个节段。从个节段。从个节段。从个节段。从标本中直接提取轮状病毒的核酸，经聚丙烯酰胺凝胶标本中直接提取轮状病毒的核酸，经聚丙烯酰胺凝
43、胶标本中直接提取轮状病毒的核酸，经聚丙烯酰胺凝胶标本中直接提取轮状病毒的核酸，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（电泳（电泳（电泳（PAGEPAGE）和银染色后在凝胶板上清楚核酸条和银染色后在凝胶板上清楚核酸条和银染色后在凝胶板上清楚核酸条和银染色后在凝胶板上清楚核酸条带，结合临床情况可进行诊断。带，结合临床情况可进行诊断。带，结合临床情况可进行诊断。带，结合临床情况可进行诊断。2 2核酸杂交：其原理是应用已知序列的核酸单链作为探核酸杂交：其原理是应用已知序列的核酸单链作为探核酸杂交：其原理是应用已知序列的核酸单链作为探核酸杂交：其原理是应用已知序列的核酸单链作为探针（针（针（针（probeprobe），）
44、，），），探针预先用放射性核素（探针预先用放射性核素（探针预先用放射性核素（探针预先用放射性核素（3232P P或或或或131131I I）或或或或生物素、地高辛苷原、辣根过氧化物酶等标记，在一生物素、地高辛苷原、辣根过氧化物酶等标记，在一生物素、地高辛苷原、辣根过氧化物酶等标记，在一生物素、地高辛苷原、辣根过氧化物酶等标记，在一定条件下按碱基互补规律与标本定条件下按碱基互补规律与标本定条件下按碱基互补规律与标本定条件下按碱基互补规律与标本（1）斑点杂交（dotblothybridization）：（2）原位杂交（insitehybridization）：（3）DNA印迹（southernblot）和RNA印迹（northernblot）杂交技术3聚合酶链反应（PCR）4基因芯片技术（genechip）5基因测序包括病毒全基因测序和特征性基因片段的测序。
