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1、LOGO真核真核细胞胞稳定定转染染筛选标记及原理及原理 小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者） 滕达 曾欣宜 席杰 赖惠英 邓宇星 外源基因表达的三个概念外源基因表达的三个概念 转染转染转染转染 通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中 。分类分类 转导转导 通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞。 转化 通过生化或者物理方法将目的基因导入原核细胞中 。常用的真核表达系统常用的真核表达系统v酵母表达系统v丝状真菌表达系统v昆虫表达系统v哺乳动物表达系统转转 染染 方方 法法 理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等特点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率
2、最高、细胞毒性很低，但准备程序复杂，对细胞类型有很强的选择性很难普及。非病毒介导的转染技术中，以阳离子非脂性物质为主的混合物配方转染效率最高。该类转染具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，且不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质体介导的转染方法更方便。转染后的表达转染后的表达1.瞬时表达 质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核，进行转录输出mRNA进行蛋白质合成。几天内大部分的质粒都会被降解或传代而稀释。一周以后几乎检测不到。转染的质粒不整合到染色体上，出现短暂的（24-96h）高水平表达，依赖于质粒纯度、浓 度和转染效率。2.稳稳定表达定表达 转染的质粒DNA整合到染色体上可以持续存在，转
3、染的细胞可以长期表达。 整合的概率比较小，要获得稳定转染的细胞株需要筛选标记共同转染，通过选择压力维持表达稳定。需要长时间的抗性选择培养。酵母表达系统常用的选择性标记酵母表达系统常用的选择性标记v营养缺陷性酵母 trp1-，ura3-，his3-，leu2-， lys2-。v显性选择标记，用于野生型酵母菌的转染。G418筛选。哺乳动物细胞哺乳动物细胞遗传遗传性性标记标记胸苷激酶基因（tk）选择系统二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶基因（HGPRT）选择系统新霉素抗性基因（neo）选择系统氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统潮霉素抗性选择系统细胞内细胞内DNA的合成途径
4、的合成途径细细胞的胞的DNA合成有主要途径和旁路途径两种方式合成有主要途径和旁路途径两种方式1.主要途径就是利用谷氨主要途径就是利用谷氨酰酰胺或胺或单单磷酸磷酸脲脲甘酸在二甘酸在二氢氢叶酸叶酸还还原原酶酶的催化下合成的催化下合成DNA2.旁路途径旁路途径则则是利用次黄是利用次黄嘌嘌呤或胸腺呤或胸腺嘧啶嘧啶在次在次嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌呤磷酸核糖呤磷酸核糖转转移移酶酶(HGPRT)或胸腺或胸腺嘧啶嘧啶激激酶酶（TK）的催化下）的催化下补补救合成救合成DNA。胸苷激胸苷激酶酶基因基因选择选择系统系统v遗传标记：遗传标记：TKv编码产物：编码产物：胸苷激胸苷激酶酶v筛选药物：筛选药物：HAT选择选择法法H
5、：次黄：次黄嘌嘌呤；呤；补补救合成核苷酸的原料救合成核苷酸的原料A：氨基喋呤；抑制四：氨基喋呤；抑制四氢氢叶酸合成叶酸合成T：胸苷；：胸苷；补补救合成救合成dTTP的原料的原料v作用机理：作用机理：TK是核苷酸是核苷酸补补救合成途径的一个关救合成途径的一个关键键酶酶二二氢氢叶酸叶酸还还原原酶酶（DHFR）基因）基因选择选择系系统统v遗传标记：遗传标记：DHFR：真核：真核细细胞生物合成核苷酸的关胞生物合成核苷酸的关键键酶酶，功能是催化二，功能是催化二氢氢叶酸叶酸还还原成四原成四氢氢叶酸叶酸v编码产物：编码产物：二二氢氢叶酸叶酸还还原原酶酶（DHFR）v筛选药物：筛选药物：叶酸叶酸类类似物似物氨
6、基喋呤或氨甲喋呤氨基喋呤或氨甲喋呤v作用机理：作用机理：dhfr缺陷型缺陷型细细胞胞因不能合成核酸而死因不能合成核酸而死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且在亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。黄黄嘌嘌呤呤-鸟鸟嘌嘌呤呤磷酸核糖磷酸核糖转转移移酶酶（XGPRT）基因）基因选择系统选择系统v遗传标记：遗传标记：XGPRTv编码产物：编码产物：黄黄嘌嘌呤呤-鸟鸟嘌嘌呤呤磷酸核糖磷酸核糖转转移移酶酶v筛选药物：筛选药物：霉酚酸霉酚酸v作用机理：作用机理：XGPRT合成合成GMP。 哺乳哺乳动动物物细细胞无胞无XGPRT酶酶
7、，不能利用黄，不能利用黄嘌嘌呤形成黄呤形成黄嘌嘌呤呤磷酸（磷酸（XMP），但有），但有鸟鸟嘌嘌呤磷酸核糖呤磷酸核糖转转移移酶酶（HGPRT），），可催化黄可催化黄嘌嘌呤形成次黄呤形成次黄嘌嘌呤磷酸（呤磷酸（IMP）。哺乳）。哺乳动动物物细细胞可胞可通通过过IMP生成生成GMP。当用。当用IMP脱脱氢氢酶酶抑制抑制剂剂霉酚酸，抑制了霉酚酸，抑制了GMP的合成，使的合成，使细细胞失去合成胞失去合成DNA能力而死亡。能力而死亡。 将含将含XGPRT基因的重基因的重组组体体导导入真核入真核细细胞后，能表达胞后，能表达XGPRT酶酶，可在含有黄，可在含有黄嘌嘌呤的培养基中通呤的培养基中通过过XMP中中间
8、间体体补补救救合成合成GMP，使，使DNA合成正常合成正常进进行行。加入霉酚酸后，阳性克隆加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性细细胞胞则则受霉酚酸的抑制受霉酚酸的抑制而死亡，以此来而死亡，以此来筛选筛选阳性阳性细细胞。胞。新霉素抗性基因新霉素抗性基因选择选择系系统统v遗传标记：APHv编码产物物：氨基糖苷磷酸：氨基糖苷磷酸转移移酶v筛选药物物：新霉素，：新霉素，即即G418一种氨基糖苷一种氨基糖苷类类抗生素，抗生素，影响影响80S核糖体功能核蛋白核糖体功能核蛋白质质的合成的合成v作用机理作用机理：新霉素抗性基因新霉素抗性基因编码编码3磷酸磷酸转
9、转移移酶酶降解降解G418。适用于所有的真核适用于所有的真核细细胞胞氯氯霉素乙霉素乙酰转酰转移移酶酶（CAT）基因）基因选择选择系系统统v遗传标记遗传标记：CAT，大大肠肠杆菌杆菌Tn9转转座子座子编码编码的催化的催化氯氯霉素霉素 乙乙酰酰化反化反应应的蛋白的蛋白质质v编码产物编码产物：氯氯霉素乙霉素乙酰转酰转移移酶酶v筛选药物筛选药物：氯霉素：氯霉素v作用机理作用机理：真核真核细细胞缺乏胞缺乏CAT，将，将CAT作作为报为报告基因告基因与目与目的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中选择阳性细胞。选择阳性细胞。常用于瞬常用于瞬时时表达研究表达研究。潮霉素抗性选择系统潮霉素抗性选择系统v遗传标记遗传标记：HPHv编码产物编码产物：潮霉素：潮霉素B磷酸转移酶磷酸转移酶v筛选药物筛选药物：潮霉素：潮霉素Bv作用机理作用机理：HPH灭活潮霉素灭活潮霉素BLOGO
