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1、第九章 DNA的结构与功能 第一节 DNA和氢键 How are they formed? a hydrogen bond is formed when a charged part of a molecule having polar covalent bonds forms an electrostatic (charge, as in positive attracted to negative) interaction with a substance of opposite charge. Molecules that have nonpolar covalent bonds don
2、ot form hydrogen bonds. DNADNA中的氢键中的氢键 由于氢键的存在，DNA形成双链配对。蛋白质分子可与组成DNA的核苷酸中暴露出来的原子进行特异的相互作用，识别特异的核苷酸序列并与之结合，而不破坏双链DNA分子的碱基对。通过这种相互作用，调控蛋白质可以对特异的基因表达进行调控。其他分子与DNA也发生类似的相互作用。 在DNA的复制和转录过程中，一个氢键断裂而另一个氢键生成的现象大量存在。DNA变性方式有多种，其中二类是：温度升高，氢键中的电子吸收能量，发生了跃迁，原有的氢键被破坏；盐浓度降低，意味着溶液内电子数目减少，盐有能力来夺取DNA 氢键内的电子，造成DNA内的
3、氢键断裂。 拓扑异构酶松弛或插入超螺旋的过程，就是DNA 中氢键被破坏、电子波函数被改写的过程。 一些错误的氢键具有相当的键能，可以得到保留。这些保留下来的错误以及修复过程中发生的错误，是基因突变产生的原因之一。 利用氢键理论对一些具体问题利用氢键理论对一些具体问题的解释的解释 卵中的DNA只有处于特定位置，才有足够的空间与其他调控组分发生氢键的破坏和生成，容纳发生跃迁的电子；否则，DNA中的某些信息就会不正常表达，使卵不能正常发育。 电子空间分布决定理论电子空间分布决定理论 电子在空间分布的不同状态，决定了DNA的解链复制和转录等过程的产生，以及这些过程的高精确性。第二节 与DNA相关的单分
4、子操作技术单分子操作技术单分子操作技术是指应用一定的实验仪器和方法,对单个分子进行的操作,它包括原子力显微镜(Atomic Force Microscopy , AFM)技术、光镊(Optical tweezers)技术、单分子光谱(single molecule spectroscopy, SMS)技术等。 应用单分子操作技术,可研究核酸的各种性质。可通过施加一定的外部机械限制(力和/或扭矩)，去测量分子的长度、力、角度、扭矩随时间的变化。实验一般在溶液中进行,通过测量在生物化学过程中产生的力，以及研究作为外加机械负荷而发生的相应反应等,可得到核酸的折叠动力学和弹性性质等相关信息。原子力显微
5、镜技术原子力显微镜技术AFM系统主要由以下几部分组成：（1）带针尖的力敏感元件；（2）力敏感元件运动检测装置；（3）监控力敏感元件运动的反馈回路；（4）扫描系统（一般使用压电陶瓷），其作用是使样品进行扫描运动；（5）图象采集及显示；（6）图象处理系统。其中关键的是前两部分。AFM的工作原理 如图1所示。将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端有一微小的针尖，针尖与样品表面轻轻接触。使针尖在样品的表面上扫描，由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的排斥力（10-810-6N），如果控制这种力在扫描过程中保持恒定，则微悬臂将在垂直于样品表面的方向上起伏运动，利用隧道电流检测法或光学检测方法
6、，测定微悬臂对应于扫描各点的位置变化，从而可以获得样品表面形貌的信息。几种细胞的AFM图象 光镊技术光镊技术 光镊即单光束梯度力光阱，是由一束高度汇聚的激光形成的三维势阱，利用光的力学效应，可以捕获进而操控微小粒子（亚微米到数十微米大小）。由于它使用无形的光束来实现对微粒非机械接触的捕获，不会产生机械损伤，又由于光镊的所有机械部件离捕获对象的距离都远大于捕获对象的尺度，是“遥控”的操作，因而几乎不影响粒子的周围环境。加之生物微粒对光穿透性等特点，光镊技术特别适用于活体生物微粒。 系统将激光技术，数字技术与显微成像系统结合，用激光作用微观物体，并将其捕获，变化过程通过显微成像系统再经CCD图像采
7、集系统输入电脑。由电脑对微观过程进行后期处理。 激光光镊对酵母菌细胞的捕获和操作激光光镊对酵母菌细胞的捕获和操作 单分子光谱技术单分子光谱技术 单分子光谱技术是将荧光基团标记在生物大分子上,标记在生物大分子上的荧光基团发生各种特性变化,通过光谱分析等,就能够得到有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度以及在化学和静电环境下活性改变的信息。 单分子操作技术在核酸研究中单分子操作技术在核酸研究中的应用的应用 单分子操作技术已经越来越多地应用到核酸研究当中,并且取得了重要的进展。这些研究包括:DNA 的解链与修饰、DNA 凝聚、蛋白质-DNA 相互作用、复制和转录等。 单分
8、子酶学单分子酶学 与DNA、蛋白质-DNA 相互作用有关的酶学过程也能利用单分子操作技术进行研究,如用一个解链的实验装置来研究DNA-蛋白质的相互作用,酶结合到双链DNA 上可以短暂地阻止DNA 双链开口叉(the opening fork) 移动。一旦开口叉移动到结合蛋白的位置,力将会增加直到积聚到足够的弹性能量移去蛋白。因此,蛋白诱导的序列依赖的力信号峰的出现就给出了酶结合到DNA 上的位置,而峰值就提供了蛋白质-DNA 复合物稳定性的相关信息。单分子操作技术的进步单分子操作技术的进步 进一步改进单分子操作的实验技术,特别是精确度、分子体系控制程度、表面连接方法等。另外,探索与其它实验技术
9、的联合应用，如联合使用微流体技术、光镊技术、单分子荧光技术。 分子梳分子梳 (molecular combing) 一般采用溶液或表面方法对DNA 分子的群体行为进行研究,但得到的是统计规律。要了解水溶液中DNA 单分子的行为，需特殊的研究手段。 在端乙烯基硅烷化的基底表面,DNA 可以被移动的气-液界面均匀拉直。把这一现象称为“分子梳”。 DNA DNA 单分子的行为单分子的行为 大多数的DNA 是线形分子,拉直后可以显著提高分辨率。如T4 DNA 在溶液中形成的线团直径约为3.5m ,拉直后可以到55 甚至80m。现有的拉直方法有:原子力显微镜微悬臂法、光钳/ 阱法、磁钳/ 阱法、旋转法、
10、液流法、吹气法等。 原子力显微镜微悬臂法、光阱法、磁阱法和旋转法需要在DNA 的一端或两端修饰并固定,需要复杂的仪器,而且只能对一个DNA 分子进行操纵。 分子梳原理分子梳原理 DNA 末端与基底表面的特异性结合是“分子梳”技术的关键。 在不同基底表面,DNA 末端和表面的特异性结合机理是不同的。 为了提高DNA 末端与基底结合的特异性,还可以在DNA 末端修饰半抗原(如地高辛) ,在基底表面修饰相应的抗体。 最初的“分子梳”是将数微升DNA 溶液滴在基底上,再盖上盖玻片,在表面张力作用下,会产生弯月形“气-液”界面,随着溶液的挥发,弯月面缓慢移动,将DNA 分子拉直。这被称为“滴液分子梳”。
11、“动态分子梳”是将基底浸入DNA 溶液中,再用机械装置以恒定的速度将基底从溶液中拉出,从而拉直DNA。 分子梳的应用分子梳的应用 大多数DNA 分子是直径为2 nm 的线形分子,可以作为测序的模板，可以作为构建纳米材料的模板，可以获得限制性基因物理图谱。有关基因的光学图谱也可以通过采用“分子梳”技术得到。 第四节 二维DNA晶体与DNA自组装分子自组装分子自组装分子的自组装不仅降低了合成所需要的能量,而且加大了识别的准确性,从而保证了自组装的重现度和精确度。自组装可以分为两大类: (1) 分子自发地聚集成特殊的聚集态,例如膜、小泡、胶束、液晶和固体；(2) 通过设计结合位点，使分子排列聚集成复
12、杂的结构。 生物纳米技术的主要目的，是寻找一种合理、简便的方法来构筑新的功能材料,例如具有独特几何形状的纳米器件及其衍生物,尤其是那些具有周期排列的物质。自组装具有宏观结构的纳米材料需要满足三个要求:(1) 可知的基元间的分子相互作用。(2) 可以预知的产物结构。(3) 基元结构具有刚性。基于基于DNA DNA 的纳米结构自组装的纳米结构自组装 基于DNA 的自组装可以分为三种类型:以DNA 为模板的纳米结构自组装、DNA 指导的纳米结构自组装、以DNA 为框架材料的纳米结构自组装。 DNA 指导的DNA - 蛋白质复合的自组装 四臂分枝DNA 及其自组装 DNA 技术的进一步应用 由三臂分枝
13、DNA 和DX DNA 形成的几何体和周期性框架结构 构成构成DNA DNA 晶体的刚性分子晶体的刚性分子 DNA DNA 分子瓦分子瓦将由多条DNA 寡核苷酸链通过碱基互补配对组成的具有一定刚性的DNA 分子单元称为DNA 分子瓦(DNA tile), 它是构成DNA 晶体的建筑模块 。DNA DNA 分子瓦自组装成的二维分子瓦自组装成的二维DNADNA晶体晶体 DNA 纳米技术的最大优点是: (1) 能够程序化设计合成精确到纳米级的宏观物质；(2) 实现了在纳米范围内精确控制材料的结构；(3) 反应原理简单,结果可靠。DNA 纳米技术的一个重要载体就是二维DNA 晶体, 以其为模板，能够将
14、具有光、电、磁等性质的分子和纳米粒子精确地自组装构成分子(纳米)线路和器件。 由分子瓦自组装成的二维由分子瓦自组装成的二维DNA DNA 晶体晶体 因为DNA 双螺旋的结构是已知的, 因此通过设计分子瓦中碱基的个数就能人工控制分子瓦的大小。DX 分子瓦约2 nm 4 nm13 nm 或2 nm 4 nm 16 nm 大小, 通过粘性末端相互匹配自组装成为二维DNA 晶体(2 m 8m, 高度12 nm)。 二维二维DNA DNA 晶体技术前景晶体技术前景 Winfree 提出设计合适的二维DNA 晶体可以用来进行DNA 计算；可以作为基底来组装其他超分子或纳米粒子,形成特殊的纳米结构或超分子器
15、件；通过某些特定的设计可以使二维的DNA 晶体扩展成三维的结构, 从而作为其他超分子客体的主体。二维DNA 晶体自组装技术在分子功能和纳米材料的控制合成上具有其独特性:首先,构成DNA 晶体的整个序列是可编程的；其次,能够将分散的具有不同光、电、磁等性质的分子和纳米粒子单元按照Watson-Crick 的碱基配对原则, 直接从溶液中精确自组装, 构成分子(纳米)线路和器件, 用来进行逻辑运算、二进制数的存储和制造DNA 纳米机器等。第五节 与DNA发生作用的各类小分子DNA与其靶向分子相互作用的模式与其靶向分子相互作用的模式虽然DNA 靶向化合物的数量非常之大, 但与DNA 的结合模式,归纳起
16、来大致可分为非共价结合、共价结合和剪切作用三类。（一）非共价结合 (1) 静电结合（表面结合）,即与DNA中的原子间形成吸引(2) 嵌插结合,即插入DNA双链之间,与DNA中的碱基等基团相互作用(3) 沟槽结合。即进入DNA的大小沟中与某些基团作用。（二）共价结合例如duocarmycin 及其衍生物,只能在DNA 小沟中对A T 富集区识别,分子中活泼的环丙烷与小沟内特定碱基序列中A 的N 3 共价结合后,导致在该位点脱去嘌呤。 （三）剪切作用研究了（，二甲基）乙胺，萘硫酰亚胺和（，二甲基）乙胺，萘酰亚胺对小牛胸腺的嵌入结合反应，并求取了嵌入常数。它们可以把质粒的超螺旋剪切为开环。在紫外光作
17、用下，这种能力会得到不同程度的提高。不同的不同的DNA DNA 靶向化合物靶向化合物 金属配合物金属配合物 （一）金属卟啉 （二）顺铂（三）其它过渡金属配合物 DNA DNA 靶向抗生素靶向抗生素 （一）多肽及蛋白质类抗生素 （二）蒽环抗生素 （三）烯二炔抗生素类 （四） 乙撑亚胺型抗生素 第六节 DNA作为遗传信息载体之外的作用 DNADNA的生物催化功能的生物催化功能 不少结构特殊的DNA 分子具有多种生物催化功能。 这些DNA 分子被称为脱氧核酶或酶性DNA 。DRz DRz 的筛选的筛选一般认为DRz 的筛选途径有两种,一种是利用天然的DNA 分子在体外筛选出具有酶活性的DNA 分子,
18、另一种是通过人工合成并在体外筛选出具有酶活性的小片段DNA 分子。 但是第一种途径,在筛选的过程中具有一定的不准确性,通常不被采用,而第二种途径的筛选过程无以上缺点,而且研究较多,是一种被普遍承认的筛选途径 体外选择技术筛选具有裂解活性的DNA 分子 DRz DRz 的分类及性质的分类及性质 具有水解酶活性的具有水解酶活性的DRzDRz 具有具有N - N - 糖基化酶活性的糖基化酶活性的DRzDRz 具有转移酶活性的具有转移酶活性的DRzDRz 具有合成酶活性的具有合成酶活性的DRzDRz具有氧化酶活性的具有氧化酶活性的DRzDRz 具有激酶活性的具有激酶活性的DRzDRz 可催化卟啉的金属
19、离子化的活性可催化卟啉的金属离子化的活性 DRz DRz 的应用的应用在疾病治疗上的应用在疾病治疗上的应用使用33 - mer 的脱氧寡核苷酸,设计了80 条针对HPV16 的E6/ E7 转录物的DRz 以及60条针对大鼠c - myc 基因的DRz。其他方面的应用其他方面的应用 DRz 最近还被用于DZYNA - PCR(DRz 荧光定量PCR) 中,以对核酸进行定量检测。用DRz 建立了一种新的寻找靶基因上有效位点的选择系统；用DRz 对核酸进行突变分析；将荧光标记的DRz 作为同源基因探针对基因进行分析。 DNADNA的免疫激活作用的免疫激活作用 特定的DNA 序列能产生对免疫系统非常
20、广泛的影响 某些细菌的基因组DNA(bDNA) 有可能通过其自身的结构特点直接触发机体的免疫防御机制。 锁核酸锁核酸 天然的寡核苷酸的生物稳定性差,易被核酶降解,在实际应用上有很大的缺陷。因此,必须对其结构进行修饰。 锁核酸(locked nucleic acid ,LNA) 是一种新颖的核苷酸衍生物 LNA 有很多优点:(1) 和DNA、RNA 互补的双链有很强的热稳定性(Tm = + 3+ 8 )；(2) 具有抗3脱氧核苷酸酶降解的稳定性；(3) LNA-DNA 杂交物能激活RNase H；(4) 水溶性好,自由穿入细胞膜,易被机体吸收；(5) 体内无毒性作用；(6) 高效的自动寡聚化作用
21、,合成方法相对简单等。可见,LNA 具有强大的反义活性,是一种理想的反义物质,有很美好的应用前景。 LNA 和DNA 的结构 DNAzyme 与LNAzyme 二级结构 第七节 DNA计算机 DNA计算机的运算能力 四个变量32SAT的可能取值和序列 DNA 链 DNA 序列 wxyz 取值S0 CAACCCAA 0000S1 TCTCAGAG 0001S2 GAAGGCAT 0010S3 AGGAATGC 0011S4 ATCGAGCT 0100S5 TTGGACCA 0101S6 ACCATTGG 0110S7 GTTGGGTT 0111S8 CCAAGTTG 1000S9 CAGTTGA
22、C 1001S10 TGGTTTGG 1010S11 GATCCGAT 1011S12 ATATCGCG 1100S13 GGTTCAAC 1101S14 AACCTGGT 1110S15 ACTGGTCA 1111DNA在金表面的组装和运算过程 DNA DNA 计算机各功能单元的制作计算机各功能单元的制作 （一）DNA 在固相表面上的组装 （二）标记(mark) 过程 （三）降解(destroy) 过程 （四）去标记(unmark) 过程 （五）读出 (readout)过程第八节 DNA降解 古DNA反映了在大的时间跨度下DNA的降解过程。 古DNA研究的成功与否,很大程度上依赖于所选组织样
23、品的保存状况、提取方法、扩增引物设计和防止污染的技术措施。 骨骼组织结构及其分解骨骼组织结构及其分解 在埋藏环境中,骨骼组织主要发生三种形式的分解:胶原质水解、骨矿物质分解及微生物的分解作用。 DNADNA的降解的降解 经计算可知,古DNA在0保存12万5000年, 10保存1万7500年,而在20下仅保存2500年。 从化学降解来说,温度降低20,生物大分子的分解速率降低1025倍,因此低温环境对古DNA的保存最为有利。 影响影响DNADNA降解的因素及结果降解的因素及结果 影响DNA降解的因素及结果：1.温度：低温(0以下最好)可降低水解反应、氧化反应的速率,阻碍微生物的生长,有利于古DNA的保存。2.湿度：游离水份是水解反应及氧化反应的必要条件,湿度较低且恒定的条件利于古DNA的保存。3.酸碱性：强酸或强碱性条件均导致DNA降解或骨骼组织的破坏,中性或弱碱性环境有利于古DNA的保存。4.微生物：微生物及其代谢活动可完全破坏DNA,干燥、低温环境可抑制微生物活性,有利于古DNA保存。5.UV辐射或放射性：同位素UV辐射只破坏样品表面DNA,但可激活氧离子,加速DNA氧化过程代谢气体的形成及软组织破坏,可加速微生物的破坏作用
