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1、志比昆仑志比昆仑学竞江河学竞江河青海大学 Qinghai University 医用分子生物学医用分子生物学实验技术实验技术青海大学医学硕士研究生课程青海大学医学硕士研究生课程志比昆仑志比昆仑学竞江河学竞江河青海大学 Qinghai University 重组重组DNA技术操作步骤技术操作步骤志比昆仑志比昆仑学竞江河学竞江河青海大学 Qinghai University 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 志比昆仑志比昆仑学
2、竞江河学竞江河青海大学 Qinghai University 主要步骤主要步骤： 制备目的基因和选择相关载体制备目的基因和选择相关载体 目的基因和有关载体进行连接目的基因和有关载体进行连接 重组的重组的DNA导入受体细胞导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增、表达和其他研究重组体的扩增、表达和其他研究 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程志比昆仑志比昆仑学竞江河学竞江河青海大学 Qinghai University （三）（三）PCR扩增特定基因扩增特定基因 （四）人工合成（四）人工合成一、目的基因的获得一、目的基因的获得
3、分分 （一）从基因组文库中获得（一）从基因组文库中获得 （二）从（二）从cDNA文库中获得文库中获得组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体
4、色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAA
5、SISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。几种常用克隆载体的比较几种常用克隆载体的比较注：注：+ +表示可用；表示可用；- -表示不可用表示不可用比较内容比较内容 质质 粒粒 噬菌体噬菌体 黏性质粒黏性质粒 M13噬菌体噬菌体克隆容量克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因组基因组DNA文库文库 - + + -cDNA文库文库 + + - -亚克隆亚克隆 + - - +序列分析序列分析 + + - +E.coli表达表达 + + -
6、-二、载体的选择与准备二、载体的选择与准备选选三、三、DNADNA分子的体外连接分子的体外连接接接（一）黏性末端（一）黏性末端（二）人工接头的使用（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（三）加入同聚体尾（四）平端连接（四）平端连接（一）黏性末端（一）黏性末端（二）人工接头（二）人工接头（三）加入同聚体尾（三）加入同聚体尾待克隆待克隆DNADNA片段片段重组质粒重组质粒混合、退火混合、退火空白质粒空白质粒（四）平端连接（四）平端连接5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(
7、A)nA A(A)nA -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体535四、外源四、外源DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞转转受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式：导入方式：转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection) 外外源源基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞后后，筛筛选选
8、含含有有目的基因的阳性克隆并加以扩增。目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所所用用的的方方法法主主要要有有遗遗传传学学方方法法、免免疫疫学方法、核酸杂交法、学方法、核酸杂交法、PCR等。等。五、目的基因的筛选和鉴定五、目的基因的筛选和鉴定筛筛1. 借助载体上的遗传标志进行筛选借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选利用抗生素抗性标志筛选(2) 利用基因的插入失活利用基因的插入失活/插入表达插入表达 特性筛选特性筛选(3) 利用标志补救筛选利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选利用噬菌体的包装特性进行筛选2. 序列特异性筛选序列特异性筛选 (1) RERE酶切法酶切法
9、 (2) PCR法法 (3) 核酸杂交法核酸杂交法(4) DNA测序法测序法 （一）（一） 遗传学方法遗传学方法 1. 1. 插入灭活法插入灭活法插入失活筛选带有重组载体的克隆插入失活筛选带有重组载体的克隆 志比昆仑志比昆仑学竞江河学竞江河青海大学 Qinghai University 2. 蓝蓝-白筛选（白筛选（互补）互补） 许多载体（如许多载体（如M13系列、系列、pUC系列、系列、pGEM系列）都含系列）都含有有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端）的调控序列和氨基端145个氨个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这基酸的编码序列。这个编码区中插
10、入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的补形成具有活性的-半乳糖苷酶，使人工底物半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源入外源DNA片段，将使片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的基因灭活，不能生成有活性的-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。互补筛
11、选（蓝互补筛选（蓝- -白筛选）白筛选） 志比昆仑志比昆仑 学竞江河学竞江河青海大学 Qinghai University PCR产物的产物的T载体载体克隆和转化克隆和转化 实验目的：实验目的：实验目的：实验目的： 学习学习学习学习T T载体的特点和载体的特点和载体的特点和载体的特点和PCRPCR产物的克隆方法。产物的克隆方法。产物的克隆方法。产物的克隆方法。实验要求：实验要求：实验要求：实验要求： 掌掌掌掌握握握握利利利利用用用用T T载载载载体体体体克克克克隆隆隆隆PCRPCR产产产产物物物物的的的的方方方方法法法法；复复复复习习习习连连连连接接接接实验流程。实验流程。实验流程。实验流程。
12、技术应用：技术应用：技术应用：技术应用： 目目目目的的的的基基基基因因因因片片片片段段段段与与与与T T载载载载体体体体DNADNA连连连连接接接接，达达达达到到到到克克克克隆隆隆隆基基基基因因因因的目的。的目的。的目的。的目的。28教学运用材料：材料：目的基因片段（回收的目的基因片段（回收的PCR产物）产物）药品：药品：pEMG T-Vector (Promega公司公司)29教学运用质粒（质粒（plasmidplasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNADNA 分子。大小约为分子。大小约为 数千碱基对。常数千碱基对。常 有有1 31 3个抗药个
13、抗药 性基因，以利于性基因，以利于 筛选。筛选。30教学运用质粒载体质粒载体1.1.克隆的质粒载体克隆的质粒载体 允许外源的允许外源的DNADNA插入，储存。主要是插入，储存。主要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。2.2.基因表达的质粒载体基因表达的质粒载体 允许外源允许外源DNADNA的插入、储存和表达。的插入、储存和表达。31教学运用32教学运用实验原理实验原理普通普通Taq酶会在酶会在3末端加一个末端加一个A，这样所有这样所有PCR产产物都会在双链物都会在双链DNA的的3端均有一个单链状态的端均有一个单链状态的A；T-载体是线状载体是线状DNA片段，在片段，在DNA双链的双链的3
14、端均有端均有一个单链状态的一个单链状态的T；二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。从而达到克隆的目的。33教学运用载体结构的三大要素：载体结构的三大要素： 多克隆位点多克隆位点 选择标记（耐药性，选择标记（耐药性，LacZLacZ） 独立的复制单位独立的复制单位34教学运用pGEM-T 载体的结构载体的结构35教学运用pGEM-T Easy 载体的结构载体的结构36教学运用实验步骤实验步骤（1）目的片段的制备）目的片段的制备-胶回收法胶回收法回收回收PCR产物：产物：37教学运用(2)连接实验：连接实验： 在在0.2ml
15、 PCR管加入以下试剂：管加入以下试剂： 目的片段（目的片段（100ng/ul） 3l pGEM-T Easy（50ng/ul） 1l T4 DNA Ligase 1l 2Rapid Ligation Buffer 5l Total 10 L 备注：备注：混合均匀，瞬时离心。混合均匀，瞬时离心。 4连接连接16小时，小时，-20储存或直接用于转化。储存或直接用于转化。38教学运用说说 明明1.回回收收DNA片片段段可可以以用用沉沉淀淀法法，但但是是只只适适用用于于PCR扩扩增增产产物为单一片段，而且需要检测物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行；扩增结果后进行；2.此此种种连连接接方方法法是是根根据据普普通通Taq酶酶会会在在3末末端端加加一一个个A的的原原理理发发明明的的；注注意意不不同同的的酶酶的的性性能能不不同同，保保真真性性强强的的Taq酶酶会会自自动动切切除除末末端端的的A，所所以以，这这种种酶酶的的扩扩增增产产物物需要补加需要补加A后再连接。后再连接。3.T-载载体体的的阳阳性性克克隆隆筛筛选选同同样样可可以以使使用用“蓝蓝白白斑斑”法法，方便，快捷。方便，快捷。39教学运用
