酶分子化学修饰

《酶分子化学修饰》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶分子化学修饰（74页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第五章第五章 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰酶的活性中心酶的活性中心酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的酶化学修饰的原理酶化学修饰的原理酶化学修饰的设计酶化学修饰的设计酶化学修饰的应用酶化学修饰的应用第一节第一节 酶的活性中心（酶的活性中心（active siteactive site） 一、活性中心的概念一、活性中心的概念v酶的必需基团酶的必需基团( (essential group):essential group): 与酶活性有关的基团与酶活性有关的基团v酶的活性中心酶的活性中心( (active center):active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的由必需基团

2、构成的与酶催化活性有关的特定区域特定区域. . 酶酶分分子子非必需基团非必需基团必需基团必需基团活性中心活性中心必需基团必需基团活性中心外活性中心外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团非活性中心非活性中心活活性性中中心心活性中心的重要化学基团活性中心的重要化学基团 7 7种氨基酸出现的频率最高种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉丝）（兰天果拌猪肉丝） 某些功能基团某些功能基团, ,如（氨基、羧基、巯基、羟基如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。和咪唑基）

3、是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基酪氨酸和丝氨酸的羟基 与底物相与底物相结合，使底结合，使底物与酶的一物与酶的一定构象形成定构象形成复合物复合物 影响底物中某些影响底物中某些化学键的稳定，化学键的稳定，催化底物发生化催化底物发生化学反应并将其转学反应并将其转化成产物化成产物 维持酶活性中心应有空间构象所必需的基团 二、活性中心的共性二、活性中心的共性(1)(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%1-2%）。）。(2)(2)

4、活性部位是一个三维实体。活性部位是一个三维实体。(3)(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (4)(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。作用等次级键结合。Active siteThe active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and t

5、ransforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.三、研究酶活性中心的方法三、研究酶活性中心的方法 1.1.物理学方法：物理学方法： 用用X X射线衍射法直接检测底物或其射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和

6、底物）的相对位置。和底物）的相对位置。2.2.化学修饰法：化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为根据所用修饰试剂不同，分为 1)1)非专一性化学修饰非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：若某基团被修饰后： 酶活性不变酶活性不变该基团可能不是酶的必需基团该基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失酶活性降低或丧失该基团可能是酶的必需基团该基团可能是酶的必需基团但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。活性中心基团的鉴定标准活性中心基团的鉴定标准失活程度与修饰剂浓度成

7、一定比例关系。失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。SS或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。先加先加S S或竞或竞 加共价修饰剂加共价修饰剂 透析透析除去除去S S或竞或竞 活性不丧失活性不丧失 差别标记：差别标记：底物或抑制剂存在底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用活性基团不与修饰剂作用去除底物或抑制剂去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记原来被保护的基团带同位素标记 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。化学修饰化学修饰含同位素标记含同位素标记 的同样试剂的同样试剂2)2)专一性化学修饰（基团专一性修饰

8、）专一性化学修饰（基团专一性修饰） 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。氨基酸残基的侧链基团。3)3)亲和标记（位点专一性修饰）亲和标记（位点专一性修饰） 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。合成的含有活泼反应基团的底物类似物。作用机制：作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。修饰标记。化学修饰的专一性化学修饰的专一性YYYX-YYYX亲和修饰剂：亲和修饰剂： 与与S S结构相似结构相似，与活性中心的氨基酸残基，与

9、活性中心的氨基酸残基 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。残基亲和力小。具有活泼的化学基团具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。中心的基团形成稳定的共价键。3.3.蛋白质工程：蛋白质工程： 将酶相应的将酶相应的cDNAcDNA定点突变，突变定点突变，突变的的cDNAcDNA只表达一个或几个氨基酸被置只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。的氨基酸是否为活力所必需。 第二节第二节 酶化学修饰及修饰目的酶化学修饰及修饰目的 一、酶

10、化学修饰一、酶化学修饰 1. 1.限制酶大规模应用的原因：限制酶大规模应用的原因：1)1)细胞外稳定性差；细胞外稳定性差；2)2)酶活性不够高；酶活性不够高；3)3)具有抗原性。具有抗原性。 2. 2. 改变酶特性有两种主要的方法改变酶特性有两种主要的方法： 1) 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。来的天然酶的活性。 2) 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。基因而达到改造酶的目的。3. 3. 酶化学修饰的概念酶化学修饰的概念酶酶的的化学修饰（化学修饰（chemical modifica

11、tionchemical modification）：）： 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。构发生改变。酶选择性化学修饰：酶选择性化学修饰： 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。二、酶化学修饰的目的二、酶化学修饰的目的1. 1. 研究酶的结构与功能的关系。研究酶的结构与功能的关系。（5050年代末）年代末）2. 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。范围。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）提高酶的生物活性（酶活力）。）提高酶的生物活

12、性（酶活力）。2 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4 4）产生新的催化能力。）产生新的催化能力。 第三节第三节 酶化学修饰的原理酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性刚性”结构。结构。二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂

13、大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖遮盖”了酶了酶的活性部位的活性部位。三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1. 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。近酶分子。“遮盖遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。酶分子上敏感键免遭破坏。2. 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白

14、水解酶破坏的可能性。了受蛋白水解酶破坏的可能性。四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1. 1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。了共价键。 破坏了抗原决定簇破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 “ “遮盖遮盖”了抗原决定簇了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合阻碍抗原、抗体结合2. 2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成面形成“缓冲外壳缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。

15、持酶活性部位微环境相对稳定。 第四节第四节 酶化学修饰的设计酶化学修饰的设计 一、充分认识酶分子的特性一、充分认识酶分子的特性 包括酶的包括酶的 1. 1. 活性部位情况活性部位情况 2. 2. 稳定条件及反应最佳条件稳定条件及反应最佳条件 3. 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性侧链基团的化学性质及反应活泼性二、二、 修饰剂的选择修饰剂的选择 要考虑要考虑 1.1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）的分子量） 2. 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）较多的反应活性基团） 3. 3.

16、修饰剂上反应基团的活化方法与条件修饰剂上反应基团的活化方法与条件三、反应条件的选择三、反应条件的选择 要注意要注意 1. 1. 酶与修饰剂的分子比例酶与修饰剂的分子比例 2. 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、反应体系的溶剂性质、盐浓度、pHpH条件条件 3. 3. 反应温度及时间反应温度及时间第五节第五节 酶化学修饰的种类及应用酶化学修饰的种类及应用 一、酶的表面化学修饰一、酶的表面化学修饰 （一）大分子修饰（大分子结合修饰）（一）大分子修饰（大分子结合修饰） 是目前应用最广的酶分子修饰方法。是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.1.定义：定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的利用水溶性大分

17、子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。的特性与功能的方法。2. 2. 修饰剂：修饰剂： 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、右旋糖酐（）、右旋糖酐（dextrandextran）、）、肝素（肝素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（FicollFicoll）等。）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。与酶分子共价结合。3. 3. 应用：应用：如：如：PEGPEG超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD） PEG PEG溶血类蛋白质

18、（链激酶、尿激酶等）溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG PEG天门冬酰胺酶（天门冬酰胺酶（ASNaseASNase） 消除了抗原性消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期延长了酶在体内的半衰期又如：用又如：用DextranDextran修饰修饰 - -淀粉酶，淀粉酶， 淀粉酶，胰淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。提高了酶的热稳定性。（二）小分子修饰（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）（酶蛋白侧链基团修饰）定义：定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。子侧链上特定的功能基团发生化学

19、反应。侧链基团：侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰剂：侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。采用的各种小分子化合物。 20 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。根据氨基酸侧链根据氨基酸侧链R R基的极性，基的极性，2020种氨基酸可分成种氨基酸可分成4 4类类。 1. 1. 非极性非极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共8 8种）：种）：

20、丙氨酸丙氨酸(Alanine,Ala,A),(Alanine,Ala,A), 亮氨酸亮氨酸(Leucine,Leu, L),(Leucine,Leu, L), 缬氨酸缬氨酸(Valine,Val,V), (Valine,Val,V), 异亮氨酸异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸色氨酸(Tryptophan,Trp,W),(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸甲硫氨酸(Methionine,Met,M),(Methionin

21、e,Met,M), 脯氨酸脯氨酸(Proline,Pro,P)(Proline,Pro,P)2.2.无电荷的极性无电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共7 7种）：种）：丝氨酸丝氨酸(Serine,Ser,S), (Serine,Ser,S), 苏氨酸苏氨酸(Threonine,Thr,T),(Threonine,Thr,T),酪氨酸酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), (Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),(Asparagine,Asn,N),甘氨酸甘

22、氨酸(Glycine,Gly,G), (Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)(Glutamine,Gln,Q)3.3.带正电荷的极性带正电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共3 3种）：种）：赖氨酸赖氨酸(Lysine,Lys,K), (Lysine,Lys,K), 精氨酸精氨酸(Arginine,Arg,R),(Arginine,Arg,R),组氨酸组氨酸(Histidine,His,H)(Histidine,His,H)4.4.带负电荷的极性带负电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共2 2种）：种）：天冬氨酸天冬氨酸(Aspartic ac

23、id,Asp,D),(Aspartic acid,Asp,D),谷氨酸谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)(Glutamic acid,Glu,E)几种重要的修饰反应：几种重要的修饰反应：烷基化反应烷基化反应酰化反应酰化反应氧化还原反应氧化还原反应芳香环取代反应芳香环取代反应1. 1. 化学修饰反应的类型化学修饰反应的类型 1) 1) 烷基化反应烷基化反应试试剂剂特特点点：烷烷基基上上带带活活泼泼卤卤素素，导导致致酶酶分分子子的的亲亲核核基基团（如团（如NHNH2 2，-SH-SH等）发生烷基化。等）发生烷基化。可作用基团：可作用基团：氨氨基基（LysLys，ArgArg），巯巯基

24、基（CysCys），羧羧基基（AspAsp、GluGlu），甲硫基（甲硫基（MetMet），咪唑基（），咪唑基（HisHis）。）。修饰剂：修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反应 2) 2) 酰基化反应酰基化反应试剂特点：试剂特点： 含含有有 结结构构，作作用用于于侧侧链链基基团团上上的亲核基团，使之酰基化。的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：可作用基团： 氨氨基基，巯巯基基，醇醇羟羟基基（SerSer、ThrThr），酚酚羟基（羟基（TyrTyr）酰基化反应 3) 3) 氧化和还原反应氧化和还原反应试剂特点：试剂特点：具有氧化性或还

25、原性。具有氧化性或还原性。氧化剂：氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺可可被被氧氧化化的的侧侧链链基基团团：巯巯基基，甲甲硫硫基基，吲吲哚哚基基（Trp）、咪唑基，酚基等。咪唑基，酚基等。还原剂：还原剂：2巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。等。可被还原的侧链基团：可被还原的侧链基团：二硫键。二硫键。连四硫酸盐氧化巯基，连四硫酸盐氧化巯基，DTTDTT还原逆回，用于保护巯基。还原逆回，用于保护巯基。 4) 4) 芳香环取代反应芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。试剂：卤（碘）化，硝化试剂。 碘代：碘代：I2+HI 硝化：硝化：(NO2)4C+(NO2)3CH（四硝基甲烷）（四硝

26、基甲烷）2.2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1) 1) 氨基的化学修饰：氨基的化学修饰：来源：来源：Lys, Arg, His, GlnLys, Arg, His, Gln修饰反应：修饰反应：酰基化与烷基化酰基化与烷基化酰基化酰基化修饰剂修饰剂: 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）、丹磺酰氯（）、丹磺酰氯（DNSDNS）烷基化烷基化修饰剂修饰剂： 2 2，4 4二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）、碘乙酸、碘乙）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等酰胺、亚硝酸等 2) 2) 羧基的化学修饰羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。修饰羧基的反应专一性

27、较差。常用常用水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。可定量测定酶分子中羧基的数目。 + 水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺3)3)胍基的化学修饰胍基的化学修饰来源：来源：ArgArg修饰反应：修饰反应：本质上是本质上是羰基羰基对对氨基氨基酰基化酰基化。修饰剂：修饰剂： 丁二酮丁二酮 二羰基化合物二羰基化合物 1 1，2 2环己二酮环己二酮 苯乙二醛苯乙二醛4)4)巯基的化学修饰巯基的化学修饰 来源：来源：CysCys 修饰反应修饰反应: :烷基化烷基化 修饰剂：修饰剂：碘乙酸碘乙酸(IAA) (IAA) 碘乙酰胺碘乙酰胺(IAM

28、)(IAM) E-SH+R-XE-SR+HXN-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺（NEMNEM）（常用的专一修饰巯基试剂）常用的专一修饰巯基试剂）ESH5) 5) 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰还原：还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTTDTT）氧化：氧化：过甲酸过甲酸: :Performicacid 6)6)咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰 来源：来源：HisHis 修饰反应修饰反应: :酰基化与酰基化与烷基化烷基化 酰基化酰基化修饰剂修饰剂: : 常用焦碳酸二乙酯（常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonatediethyl paracarbonate）+

29、C2H5OH+CO2 烷基化烷基化修饰剂：修饰剂：碘乙酸碘乙酸+ICH2COOH+HI7 7）酚羟基的化学修饰）酚羟基的化学修饰来源：来源：TyrTyr修饰反应：修饰反应：芳香环取代反应芳香环取代反应修饰剂：修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）碘、硝化试剂（四硝基甲烷）8 8）吲哚基的化学修饰）吲哚基的化学修饰 来源：来源：TrpTrp 修饰反应：修饰反应：氧化反应氧化反应 修饰剂：修饰剂： N- N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂LysLys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、

30、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸AspAsp、GluGlu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮CysCys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTHisHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷TrpTrp吲哚基吲哚基N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂 但解释修饰效果须十分小心，因为：但解释修饰效果须十分小心，因为：

31、任何一种修饰剂不是绝对专一的。任何一种修饰剂不是绝对专一的。有些修饰剂引起蛋白质构象变化有些修饰剂引起蛋白质构象变化失活，失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。不一定是活性中心基团被共价修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。内部的必需基团，不易被修饰。（三）交联修饰（三）交联修饰（交联法）（交联法） 用双功能基团试剂用双功能基团试剂( (如戊二醛如戊二醛) )，与酶分子内不，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。（四）固定化修饰（四）固定化修饰（共价偶联法

32、）（共价偶联法） 通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适酶的最适pHpH、最适温度和稳定性发生改变。、最适温度和稳定性发生改变。二、酶分子内部修饰二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） 蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。蛋白酶或肽酶为修饰剂）。 （与前面化学修饰区别）（与前面化学修饰区别） 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况酶蛋白的肽

33、链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：中的一种：1 1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2 2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3 3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。酶活力提高。 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。称肽链有限水解。应用实例：应用实例：1 1）提高酶活力：）提高酶活力：2 2）消除抗原性：）消除抗原性：（二）氨基酸置换修饰（二）氨基酸置换修饰 将肽链上

34、的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。的方法。 通过两个途径实现：通过两个途径实现：化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。蛋白质工程：利用基因操纵技术。蛋白质工程：利用基因操纵技术。（三）金属离子置换修饰（三）金属离子置换修饰 改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。发生改变的方法。 第六章第六章 酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程一、概念

35、：一、概念： 蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。对天然蛋白质分子的设计和改造。二、蛋白质的功能基础二、蛋白质的功能基础 蛋白质的功能在很大程度上取决于蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。其空间结构。蛋白质结构测定蛋白质结构测定一级结构测定：一级结构测定：直接法：直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。直接测定多肽链的氨基酸顺序。间接法：间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导从编码蛋

36、白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。蛋白质的氨基酸顺序。三级结构测定：三级结构测定：X-X-射线晶体衍射射线晶体衍射研究处在研究处在晶体状态晶体状态下的蛋白质下的蛋白质的空间结构的空间结构核磁共振核磁共振( (NMR)NMR)光谱光谱研究处在研究处在溶液状态溶液状态的蛋白的蛋白质的结构。质的结构。 X-X-射线衍射技术：射线衍射技术： 用用于于蛋蛋白白质质及及核核酸酸三三维维结结构构的的确确定定，至至今今已已有有数数百种蛋白质的结构被确定。百种蛋白质的结构被确定。三、蛋白质工程的主要手段三、蛋白质工程的主要手段 以重组以重组DNADNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。技术为核心

37、的基因工程技术改造蛋白质。 位点特异性突变位点特异性突变基于结构生物学、信息生物学基于结构生物学、信息生物学基因突变基因突变 随机突变随机突变基于高通量筛选法基于高通量筛选法 基因内部的剪接基因内部的剪接基因剪接基因剪接 5 5或或33端的剪接端的剪接四、蛋白质工程改造的实际应用四、蛋白质工程改造的实际应用 1. 1.枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 1 1）增强抗氧化性）增强抗氧化性 2 2）改变底物特异性）改变底物特异性 2. 2.溶菌酶（溶菌酶（LysozymeLysozyme） 1) 1)抗菌范围的扩大抗菌范围的扩大 2) 2)热稳定性的提高热稳定性的提高五、酶的稳定性五、酶的稳定性 1.

38、1.酶稳定的分子原因酶稳定的分子原因 1 1）共价键：）共价键： 肽键肽键（peptide bondpeptide bond） 稳定蛋白质和酶主链的核心力量。稳定蛋白质和酶主链的核心力量。 二硫键二硫键（disulfide bonddisulfide bond） 由两个由两个CysCys的侧链的侧链-SH-SH氧化而成，是某些蛋白氧化而成，是某些蛋白质维持结构稳定性的主要因素。质维持结构稳定性的主要因素。2 2）非共价键：）非共价键：疏水相互作用疏水相互作用（hydrophobic interactionhydrophobic interaction）: : 是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力

39、。是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。氢键氢键（hydrogen bondhydrogen bond）：）： 是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要力量。的重要力量。静电相互作用静电相互作用（electrostatic interactionelectrostatic interaction）：）： 又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。面上。范德华力范德华力： 在电中性分子之间的非共价结合。分子间形

40、成的在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的范德华力越大越稳定。范德华力越大越稳定。金属离子金属离子： Ca Ca2+2+、MgMg2+2+和和ZnZn2+2+等高价阳离子与多肽链不稳定的等高价阳离子与多肽链不稳定的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。途径方法优点不足酶分子改造核酸水平蛋白质工程从根本上提高酶分子稳定性操作复杂，周期长蛋白质水平化学修饰适应所有酶，操作简单经济修饰过程破坏酶分子剂型固定化适应所有酶，稳定性高，可重复利用和连续生产载量较低，易失活交联酶晶体稳定性好，载量高，催化效率高成本高微环境改良稳定剂简单、经济工作量大反应介质适用于特殊反应体系和酶类适合的酶类还不普遍2. 稳定酶的方法稳定酶的方法思考题：