《2.1DNA重组的载体蓝背景222》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2.1DNA重组的载体蓝背景222（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2.1 2.1 DNADNA重组的载体重组的载体2 2 DNA DNA重组克隆的单元操作重组克隆的单元操作质粒（质粒（plasmidplasmid）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）与噬菌粒与噬菌粒人造染色体载体人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能（载体的功能（P12P12）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供在受体细胞中为外源基因提供在受体细胞中 扩增和表达能力扩增和表达能力注意注
2、意：上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备：上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNADNA的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 2.1.12.1.1质粒载体质粒载体2.1.1.12.1.1.1质粒的基本特征质粒的基本特征 定
3、义：定义：质粒是一类存在于原核细菌和真菌细胞中，能独立于寄主染色质粒是一类存在于原核细菌和真菌细胞中，能独立于寄主染色体而自主复制的共价、闭合、环状体而自主复制的共价、闭合、环状DNADNA分子并被稳定遗传的一类核酸分子并被稳定遗传的一类核酸分子。分子。是处于生命与非生命的分界线上。是处于生命与非生命的分界线上。是处于生命与非生命的分界线上。是处于生命与非生命的分界线上。（1 1）质粒常见于原核细菌和真菌中；）质粒常见于原核细菌和真菌中；（2 2）绝大多数的质粒是）绝大多数的质粒是DNADNA型的，绝大多型的，绝大多数的天然数的天然DNADNA质粒具有共价封闭、环状的分质粒具有共价封闭、环状的
4、分子结构，即子结构，即cccDNAcccDNA；（3 3）质粒）质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1 - 1 - 1 100 00 kbkb质粒的基本特征质粒的基本特征1.1.质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒能摆脱寄主细胞的质粒能摆脱寄主细胞的DNADNA复制系统的束缚进行自主复制；复制系统的束缚进行自主复制；质粒质粒DNADNA上含有自己的复制起始区（上含有自己的复制起始区（oriori），形成独立的复制子结构），形成独立的复制子结构根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：类型：严紧型复制控制
5、的质粒严紧型复制控制的质粒 1 - 1 - 5 5拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 3030 - - 5 50 0 拷贝拷贝 relaxed plasmidrelaxed plasmid质粒的基本特征质粒的基本特征2.2.质粒的可转移性：质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如细胞（接合作用），如F F、ColCol、RR质粒等；质粒等；非接合
6、型质粒非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。：不能在天然条件下独立地发生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1ColE1）在接合型质粒的存在在接合型质粒的存在和协助下，也能发生和协助下，也能发生DNADNA转移，这个过程由转移，这个过程由bombom和和mobmob基因决定。基因决定。质粒的基本特征质粒的基本特征3.3.质粒的不相容性：质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的细胞中，这种现象称为质粒的不相容性不相容性，不相容
7、性的质粒组成，不相容性的质粒组成不不ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101pSC101、F F、RP4 RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容相容性群相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：。以大肠杆菌的质粒为例：质粒的基本特征质粒的基本特征4.4.携带特殊的遗传标记：携带特殊的遗传标记：野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记
8、基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。2.1.1.22.1.1.2质粒的构建质粒的构建原因：原因：天然存在的野生型质粒由于天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低分子量大、拷贝数低、单一酶切位点、单一酶切位点少少遗传标记不理想遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此
9、往往需要以等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大大多是由少数几个野生型质粒构建而成的：多是由少数几个野生型质粒构建而成的：pSC101pSC1018.8 kb8.8 kb，拷贝数，拷贝数 5 5，四环素抗性标记基因，四环素抗性标记基因 TcTcrrColE1ColE16.5 kb6.5 kb，拷贝数，拷贝数 20 20 - 30- 30，大肠杆菌内毒素标记基因，大肠杆菌内毒素标记基因 E1E1RSF2124RSF2124ColE1ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗
10、性标记基因衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因 ApAprr改造的原则改造的原则（1 1）删除不必要的）删除不必要的DNADNA区域，尽量缩小质粒的相对分子质量区域，尽量缩小质粒的相对分子质量（2 2）灭活某些质粒的编码基因，应为非转移性质粒，应为松弛型质）灭活某些质粒的编码基因，应为非转移性质粒，应为松弛型质粒粒（3 3）加入易于识别的选择标记基因）加入易于识别的选择标记基因（4 4）引入具有多种限制性内切酶的单一识别位点）引入具有多种限制性内切酶的单一识别位点（5 5）根据外源基因克隆的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件）根据外源基因克隆的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件构建过程（构建过
11、程（P14P14）2.1.1.32.1.1.3质粒的分类质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因，拷贝数突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-30001000-3000，扩增基因，扩增基因低拷贝质粒低拷贝质粒 来自来自pSC101pSC101，拷贝数小于，拷贝数小于1010，表达某些毒性基因，表达某些毒性基因温敏质粒温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头（含有测序通用引物互补序列和多酶接头（
12、polylinkerpolylinker）整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制 pBR322pBR322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50 - 100
13、/ 50 - 100 / cellcell用于基因克隆用于基因克隆 pUC18 pUC18 / 19/ 19： 拷贝数拷贝数 2000 - 3000 / 2000 - 3000 / cellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18 / 19/ 19：正选择标记正选择标记 lacZ lacZ 的显色原理的显色原理pUC18pUC18/19/19PlacPlaclacZlacZMCSMCSbb-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的aa-肽段肽段a
14、a a a a ab b b b b b5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基吲哚基-bb-D-D-半乳糖半乳糖苷苷X-galX-gal重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3ZpGEM-3Z：多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注意：注意：T7T7和和SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNA编码的编码的RNARNA聚合聚合2743 bp2743 bpMCSMCSlacZlacZPPT7
15、T7orioriApAprrpGEM-3EpGEM-3EP PSP6SP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNA聚合酶，如：聚合酶，如：E.coliE.coli BL21 BL21（DE3DE3）等等2.1.1.42.1.1.4质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNADNA： 氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒质粒DNADNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法碱溶法 质粒质粒DNADNA纯度底、快速、操作简便
16、纯度底、快速、操作简便沸水浴法沸水浴法 质粒质粒DNADNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法： 用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体；的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁；加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 加加CsClCsCl和溴乙锭；和溴乙锭；超速离心过夜；超速离心过夜；在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNAcccDNA；稀释沉淀稀释沉淀cccDNAcccDNA。proteinsproteinsocDNAocDNAL-DNAL-DNAcccDNAcccDNARNAsRNAs碱溶法：碱溶法： 用含有用
17、含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体；的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁；加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 加加NaOHNaOH和和SDSSDS的混合溶液，破膜释放内含物；的混合溶液，破膜释放内含物； 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体色体DNADNA及大部分蛋白质；及大部分蛋白质； 离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚- -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNADNA；用无用无DNaseDNase的的RNaseRNase去除残余的去除残余的RNARNA。 cccDNA
18、cccDNAL-DNAL-DNAocDNAocDNAD-DNAD-DNAT-DNAT-DNA沸水浴法：沸水浴法： 用含有用含有EDTAEDTA和和Triton X-100Triton X-100的的加溶菌酶裂解细菌细胞壁；加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 沸水浴沸水浴4040秒钟；秒钟；离心，用无菌牙签挑去沉淀物；离心，用无菌牙签挑去沉淀物； 乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒DNADNA。缓冲液悬浮菌体；缓冲液悬浮菌体； 另一类载体另一类载体 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿
19、主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNADNA能被开发成为基因工程的能被开发成为基因工程的有用载体，因为：有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。2.1.3.12.1.3.1l l 噬菌体的生物学特性：
20、噬菌体的生物学特性：生物结构生物结构l l 噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体l l 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和l l-DNA-DNA组组成成 l l-DNA-DNA全长全长4850248502个核苷个核苷酸酸l l-DNA-DNA上上至少有至少有6161？个基个基因因2.1.2l双链噬菌体DNA载体l l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 生物结构生物结构5 TCCAGCGGCGGGG5 TCCAGCGGCGGGG3333CCCGCCGCTGGA 5 CCCGCCGCTGGA 5 COSCOSCOSCOScoscos头部合成基因头部合成基因尾部
21、合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNADNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l l l l - DNA- DNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染周期感染周期E.coliE.coli吸附吸附LamBLamB受体受体注入注入复制复制包装包装裂解裂解l l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染周期感染周期体内包装体内包装100100个左右的拷贝个左右的拷贝包装范围为原包装范围为原DNADNA的的75 - 105%75 - 105%即即 36 - 51
22、 36 - 51 kbkbDDAAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 溶原状态溶原状态 l l噬噬菌菌体体感感染染大大肠肠杆杆菌菌后后，除除能能裂裂解解细细胞胞外外，也也可可能能将将其其DNADNA直直接接整整合合到到宿宿主主细细胞胞的的染染色色体体DNADNA上上，并并不不产产生生子子代代噬噬菌菌体体颗颗粒粒，这这种种情情况况为为溶溶原原状状态态。整整合合主主要要由由l l-DNA-DNA上上的的cIcI和和intint两两基基因因的的产产物物所所激激活活，而而这这两两个个基基因因的的开开放放与与关关闭闭又又取取决决于于宿宿主主细细胞胞本本身身的的性性质质。人人们们可可以以根根据据
23、需需要要改改变变l l-DNA-DNA或或宿宿主主细细胞胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态。的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态。 DNA DNA重组技术一般需要重组技术一般需要l l噬菌体进入噬菌体进入溶原状态溶原状态l l-DNA-DNA重组分子的体外包装：重组分子的体外包装： l l-DNA-DNA重重组组分分子子需需在在体体外外人人工工包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体重重组颗粒，方可高效导入受体细胞。组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用用于于体体外外包包装装的的蛋蛋白白质质可可直直接接从从感感染染了了l l噬噬菌菌体体的的大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取，
24、现现已已商商品品化化。这这些些包包装装蛋蛋白白通通常常分分为为相相互互互互补补的的两两部部分分：一一部部分分缺缺少少E E组组份份，另另一一部部分分则则缺缺少少DD组组份份。包包装装时时，当当且且仅仅当当这这两两部部分分包包装装蛋蛋白白与与重重组组l l-DNA-DNA分分子子混混合合后后，包包装装才才能能有有效效进进行行，任任何何一一种种蛋蛋白白包包装装液液被被重重组组l l-DNA-DNA污污染染后后，均均不不能能被被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。2.1.2.2l2.1.2.2l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建
25、：缩短长度缩短长度 野野生生型型l l-DNA-DNA包包装装的的上上限限为为5151kbkb，本本身身长长度度为为48.548.5kbkb，只只有有当当插插入入的的外外源源DNADNA片片段段不不大大于于2.52.5kbkb时时，才才能能被被包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒。因因此此缩缩短短野野生生型型l l-DNA-DNA的的长长度度，可可以以提提高高装装载载量量。其其实实野野生生型型l l-DNA-DNA上上约约有有40-50%40-50%的的片片段段是是复复制制和和裂裂解解所非必需的。根据切除的多少，可将所非必需的。根据切除的多少，可将l l-DNA-DNA分成两大
26、类载体：分成两大类载体： 插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体取代型 （Replacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的DNA区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon 4 载体：克隆能力大，2025kb插入型 （Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如：gt10 、 gt11 克隆能力小，一般不到10kb2.1.2.3 l2.1.2.3 l-DNA-DNA载体的主要类型：载体的主要类型：2.1.2.4 l2.1.2.4 l-DNA-DNA及其重组分子的分离纯化：及其重组分
27、子的分离纯化：P22P22将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入加入l l噬菌体或重组噬菌体或重组l l噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，3737培养培养1 1小时小时 用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4 -124 -12小时。这时噬菌体颗粒小时。这时噬菌体颗粒 密度已达密度已达101013 13 -10-1014 14 / / L L，大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放l l-DNA-DNA 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀l l
28、-DNA-DNA l l-DNA-DNA作为载体的优点：作为载体的优点：l l-DNA-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l l-DNA-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 25 kbkb，远远大于质粒的装载量远远大于质粒的装载量 重组重组l l-DNA-DNA分子分子的筛选较为方便的筛选较为方便 重组重组l l-DNA-DNA分子的提取较为简便分子的提取较为简便 l l-DNA-DNA载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源DNADNA片段，但不适合表达片段，但不适合表达 外源基因外源基因2.1.3 M132.1.3
29、M13单链噬菌体单链噬菌体DNADNA载体载体2.1.3.1M132.1.3.1M13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构M13M13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状M13M13 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正链链DNADNA组成组成 M13M13 DNADNA全长全长64076407个核苷酸个核苷酸M13 DNAM13 DNA上上至少有至少有1010个基因个基因27002700个个VIIIVIIIM13M13 噬菌体噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长 IIIIIIVIVIVIIVIIXIXIM13 DNAM13 DNA“
30、+ +”链进入雄性大肠杆菌链进入雄性大肠杆菌合成合成“- -”链链产生双链产生双链M13 DNAM13 DNA（复制型（复制型DNADNA或或RF-DNARF-DNA）按环状双链按环状双链DNADNA方式复制，同时以方式复制，同时以“+ +”链链DNADNA为模板转录为模板转录包装蛋白包装蛋白 RFRF-DNA-DNA达达200200拷贝拷贝时，时，单链单链DNADNA特异结合蛋白特异结合蛋白与与“+ +”链结合而阻断合成链结合而阻断合成“- -”链链结果只能以结果只能以“- -”链为链为模板合成模板合成“+ +”链链 “+ +”链链DNADNA被包装蛋被包装蛋白包装成新的白包装成新的M13M
31、13噬菌体噬菌体挤出受体细胞挤出受体细胞宿主细胞不被溶菌。宿主细胞不被溶菌。M13M13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 感染周期感染周期2.1.3.2M13 DNA2.1.3.2M13 DNA载体的构建：载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIII野生型野生型M13RF-DNAM13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mpM13mp系列载体系列载体lacZlacZpolylinkerpolylin
32、kerM13 DNAM13 DNA载体的特点：载体的特点：使克隆的使克隆的DNADNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在这在DNADNA定向突变中非常有用定向突变中非常有用M13M13重组分子筛选简便重组分子筛选简便被被M13M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大斑的混浊度亦越大 但但M13-DNAM13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 1.5 kbkb 与动植物受体细胞相适应
33、的载体一般选择相应动植物的病与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组毒基因组DNADNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链单链DNADNA病毒病毒双链双链DNADNA病毒病毒单链单链RNARNA病毒病毒双链双链RNARNA病毒病毒 RNA RNA病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的DNADNA中间反应物，中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的这些中间体可作为载体进行常规的DNA
34、DNA重组。重组。插曲插曲2.1.42.1.4质粒与噬菌体杂合载体质粒与噬菌体杂合载体 l l-DNA-DNA载体和载体和M13-DNAM13-DNA载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为25 25 kbkb和和1.51.5 kbkb，但在很多情况下，往往需要但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源克隆更大的外源DNADNA片段，片段，考斯质粒和噬考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNADNA的装载量。的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNADNA的长度，就能的长度，就能同步增加
35、载体的装载能力。将噬菌体同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNADNA与包装有关的序列与质粒组与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNADNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组因此重组DNADNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。2.1.4.12.1.4
36、.1考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建： 考斯质粒是一类人工构建的含考斯质粒是一类人工构建的含pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcrrll fragment fragmentcoscosorioriApAprrPstIPstIBamHIBamHISalISalI有有l l-DNA -DNA cos cos 序列和序列和质粒质粒复制子的复制子的殊类型的载体，殊类型的载体，19781978年由年由CollinsCollins由 含由 含coscos序 列 的序 列 的1.8kb1.8kb的的l l片 段 和片 段 和 考斯质粒的
37、装载范围为考斯质粒的装载范围为31-4531-45kbkb。和和HohnHohn发明构建。例如，发明构建。例如，pHC79pHC79质粒质粒pBR322pBR322片段组合而成。片段组合而成。考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：能像能像l l-DNA-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（装载量大（45 45 kbkb）且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体细胞受体细胞2
38、.1.4.2 2.1.4.2 噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmidphagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子包装序列、复制子以及以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。能像能像M13-DNAM13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量装载量比常规的比常规的M13mpM13mp系列要大很多（系列要大很多（10 10 kbkb）能像质粒那样在受体细胞能像质粒
39、那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易通过克隆双链通过克隆双链DNADNA能获得同等长度的单一单链能获得同等长度的单一单链DNADNA概念：概念：2525页页重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119pUC118 / 119pUC118pUC118：pUC18pUC18 + + M13M13间隔区间隔区 IGIGpUC119pUC119：pUC19pUC19 + + M13M13间隔区间隔区 IGIG500 500 个拷贝个拷贝3200 bp3200 bpMCSMCSlacZlacZlacIlacIorioriApAprrM13-MGM
40、13-MGpUC118 / 119pUC118 / 119表示表示M13M13辅助噬菌体辅助噬菌体DNADNA重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pBluescript pBluescript 体外转录载体体外转录载体pBluescript = pUCpBluescript = pUC + + f1-f1-oriori + + P PT3T3 + + P PT7T72958 bp2958 bpMCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriApAprrf1-f1-orioripBluescriptpBluescriptPPT3T3噬菌体启动子噬菌体启动子P PT3T3和和P PT7T7强化
41、外源基因的强化外源基因的转录，提取出来的单链转录，提取出来的单链DNADNA重组分子重组分子在噬菌体在噬菌体RNARNA聚合酶的存在下，又可聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录。实现外源基因的体外转录。2.1.52.1.5人造染色体载体人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要需要克隆数百克隆数百甚至上甚至上千千kb kb 的的DNADNA片段，片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能细菌人造染色体细菌人造染色体（BACBAC）酵母人造染色体酵母人造染色体（YACYAC）满足需要。满
42、足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNADNA克隆在克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。人造染色体载体包括：那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。人造染色体载体包括：细菌人造染色体（细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BACBacterial A
43、rtificial Chromosomes BAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F F质粒的基础上质粒的基础上构建的，命名为构建的，命名为pBACspBACs，其装载量范围在，其装载量范围在50 - 30050 - 300 kbkb之间。各之间。各种类型的种类型的pBACspBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。pBACspBACs主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）结构结构构建动植物基因文库构建动植物基因文库酵母人造染色体（酵母人造染色体（Y
44、east Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）YACYAC载体一般含有下列元件：载体一般含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建：酵母人造染色体的构建：pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRP1TRP1ARS1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的酵母系统的选择标记选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的大肠杆菌的选择标记选择标记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为350-400 350-400 kbkb。酵母人造染色体的使用：酵母人造染色体的使用：pYAC4pYAC4CENCENEcoRIEcoRIURAURATELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRPTRPARSARSEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHI连接连接转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体
