第十三章细胞衰老与凋亡1

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1、第十三章第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡与细胞衰老细胞衰老细胞衰老（cellular aging ） 细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）第一节第一节 细胞衰老细胞衰老细胞衰老又称为老化，细胞衰老又称为老化，通常指生物发育成熟后，在正常情况下通常指生物发育成熟后，在正常情况下随着年龄的增加，机能和结构发生退行性变化，从而趋向死亡随着年龄的增加，机能和结构发生退行性变化，从而趋向死亡的不可逆现象。的不可逆现象。 q 细胞衰老的特征细胞衰老的特征q 细胞衰老的分子机理细胞衰老的分子机理一、细胞衰老的特征一、细胞衰老的特征（一）形态变化（一）形态变化二、细胞衰老的分子机理二、细胞衰

2、老的分子机理（一）差错学派（一）差错学派差错学派认为细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环差错学派认为细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环境的损伤作用后，因缺乏完善的修复，使境的损伤作用后，因缺乏完善的修复，使“差错差错”积累，积累，导致细胞衰老。导致细胞衰老。 代谢废物积累学说：代谢废物积累学说：脂褐质的积累脂褐质的积累 大分子交联学说：大分子交联学说：DNADNA交联和胶原交联交联和胶原交联 自由基学说自由基学说 体细胞突变学说：体细胞突变学说：突变积累和功能基因的丧失突变积累和功能基因的丧失 DNA DNA损伤修复学说损伤修复学说（二）遗传学派（二）遗传学派遗传学派认为衰老是遗传决定的自然演进

3、过程，一切细胞均遗传学派认为衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命。有内在的预定程序决定其寿命。1.细胞有限分裂学说：细胞有限分裂学说：Hayflick界限界限2.重复基因失活学说：延迟衰老重复基因失活学说：延迟衰老3.衰老基因学说：衰老基因衰老基因学说：衰老基因v1、细胞有限分裂学说“Hayflick”极限，即细胞最大分裂次数。L.Hayflick(1961)报道，人的成纤维细胞在体外培养时增殖次数是有限的（6070代）。细胞增殖次数与端粒DNA长度有关。v2、重复基因失活学说：如哺乳动物rRNA基因数随年龄而减少。遗传论学派遗传论学派l3、衰老基因学说、衰老基因

4、学说l子女的寿命与双亲的寿命有关；l各种动物都有相当恒定的平均寿命和最高寿命；成人早衰症：平均39岁时出现衰老，47岁生命结束；婴幼儿早衰症：1岁时出现明显的衰老，1218岁生命结束，早衰症患者体内解旋酶发生突变 。Caenrhabditis elegans的平均寿命仅3.5天，该虫age-1单基因突变，可提高平均寿命65%，提高最大寿命110%。Hutchinson-Gilford syndrome 第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v 细胞凋亡的概念及生物学意义细胞凋亡的概念及生物学意义v 细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征v 细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法一、细胞凋亡的概念及生物学意义一、细

5、胞凋亡的概念及生物学意义 概念：是由一系列基因控制并受复杂信号调节的细胞自然概念：是由一系列基因控制并受复杂信号调节的细胞自然 死亡的现象。死亡的现象。 生物学意义：生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进 行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都 起着非常关键的作用。起着非常关键的作用。二、细胞凋亡的特征二、细胞凋亡的特征q 细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡的形态学特征q 细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的生化特征细胞凋亡和坏死的区别：细胞凋亡和坏死的区别：（一）细胞凋亡的形态学特征一）细胞凋亡

6、的形态学特征 凋亡的起始：细胞器、染色质等开始变化凋亡的起始：细胞器、染色质等开始变化 凋亡小体的形成：质膜包裹染色质和细胞器凋亡小体的形成：质膜包裹染色质和细胞器 凋亡小体的消化：被吞噬细胞消化凋亡小体的消化：被吞噬细胞消化胸腺细胞胸腺细胞胸腺细胞胸腺细胞正常正常凋亡胸腺细胞胸腺细胞胸腺细胞胸腺细胞正常正常凋亡l细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是一种基因指导的细胞自我消亡方式。lPCD和细胞凋亡的区别在以下方面：PCD是功能性概念，凋亡是形态学概念。PCD的最终结果是细胞凋亡，但细胞凋亡并非都是程序化的。PCD存在于胚胎发育过程中。（三）、细胞程序性死亡l

7、线虫Caenorhabditis elegans是研究个体发育和细胞程序性死亡的理想材料（生命周期短，细胞数量少）。l线虫神经系统由302个细胞组成。这些细胞来自于407个前体细胞。也就是说105个细胞发生了程序性死亡。l控制线虫细胞凋亡的基因主要有3个Ced-3、Ced-4和Ced-9Ced-3和Ced-4的作用是诱发凋亡；Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。1 ced基因 在一种无脊椎动物线虫中发现的一组基因，共14个，其中ced-3,ced-4,ced-9研究的较为清楚。Ced-3编码530个氨基酸，其中有100个氨基酸为丝氨酸富含区。2 ICE基因 是哺乳动物中克隆出的ced-

8、3的同源基因，为白细胞介素1转化酶（inter-leukin-1 converting enzyme）。是一种底物特异性半胱氨酸蛋白酶（cystein aspartic acic specific protease,caspase家族)，这个家族的共同点是特异的断开天冬氨酸后的肽键.3 bcl-2 从人的滤泡性B细胞淋巴瘤中分离出的与ced-9同源的抑制细胞凋亡的一组基因，位于人第9号染色体上。4 rpr基因 从果蝇中分离出的诱导细胞凋亡的基因，有65个氨基酸组成。5 c-myc基因 是一多功能的原癌基因，存在于核仁中，可抑制凋亡。6 p53基因 肿瘤抑制基因，促进细胞凋亡可能是肿瘤生长抑制的

9、主要原因。另外Fas/APO-1,ras,TNF,TGF-1,RP-2,RP-8,PD-1都是已报道的与细胞凋亡有关的基因。目前发现的调控细胞凋亡的相关基因三、细胞凋亡的分子调控机理细胞凋亡的分子调控机理线虫(C.elegans)是研究细胞凋亡的理想材料，可以直接观察不同发育时期某些细胞群的定期死亡，现以发现10几种与细胞凋亡有关的基因。研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。（）Ced3哺乳 类 同 源 物 是 ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Caspase1Caspase家族与凋亡Bcl

10、-2家族、线粒体与细胞凋亡（）线虫细胞凋亡的研究 线虫（C. elegans)是研究细胞凋亡的理想材料，提供了一个良好的模型。它虫体透明，易于观察。早期研究发现虫体在不同发育时期某些细胞定期死亡。在整个发育过程中，有131个细胞陆续进入死亡程序，决定这些细胞进入死亡程序的是一系列凋亡基因。现已从中分离出10余个凋亡基因。正常细胞 走向死亡细胞 死细胞 降解细胞起动死亡程序执行死亡程序被吞噬处理Ced-2Ces-1cgl-1Ced-9ced-3 4Ced-125ced-567ced-810nec-1其中研究的较清楚的是ced-9(抑制细胞凋亡）、ced-3,ced-4(促进细胞凋亡）（）线虫细胞

11、凋亡的过程可划分为四个阶段：1 命令阶段（execution） 这一阶段决定细胞凋亡与否，通过基因ced-3和ced-4的指令可以执行细胞凋亡，使细胞有程序有步骤的凋亡，而ced-9基因则能阻止这一凋亡过程的执行。2 细胞凋亡阶段（death） 已经接受凋亡指令的细胞，在这一阶段将受ced-3和ced-4基因的调控而停止生长，选择凋亡途径。3 细胞吞噬阶段（engulfment） 这一阶段细胞处于被临近细胞吞噬的状态。控制这一过程的基因有两组：即ced-1,ced-6,ced-7,ced-8基因组和ced-2,ced-10基因组。4 分解阶段（degradation） 凋亡细胞被吞噬后很快分解

12、，这一阶段起作用的基因是nec-1.(）Caspase家族与凋亡Caspase家族 在哺乳类找到的一组与ced-3基因同源的基因，构成一个家族，即Caspase家族。 Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为 Cysteine aspartic acic specific protease， 即CaspaseCaspase活化胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径Caspase活化 Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活则需在两个亚基的连接区的天冬氨酸位点进行切割（裂解活化），结果产生了由两个亚基组成的异二聚体，此即具有

13、活性的酶。胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径凋亡信号通路 当细胞接受凋亡信号分子后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡Caspases活化后，作用底物： 裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体； 裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder; 裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、 脱落，便于细胞吞噬； 导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡Bcl

14、-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3，这三个区域是调节凋亡所必需的结构。Bcl-2、线粒体与细胞凋亡Bcl-2、线粒体与细胞凋亡当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另 一方面使bcl-2裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成 复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apo

15、ptosis protease activating factor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活 化Procaspase9，最后引起细胞凋亡a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜) c 凋亡细胞(透射电镜) (扫描电镜) 20022002年年1010月月7 7日英国人悉尼日英国人悉尼 布雷诺尔、美国人罗伯特布雷诺尔、美国人罗伯特 霍维霍维茨和英国人约翰茨和英国人约翰 苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。Sydney BrennerH. Robert HorvitzJohn

16、 E. Sulston （二）细胞凋亡的生物化学特征（二）细胞凋亡的生物化学特征 细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180200bp特征性的DNA ladders 凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG（tissue Transglutaminase）积累并达到较高水平细胞色素细胞色素c诱导的凋亡细胞诱导的凋亡细胞DNA电泳图电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker （ 自赵允、翟中和）三、细胞凋亡的检测方法三、细胞凋亡的检测方法形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带

17、TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析 根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA 产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细 胞，同时又能观察细胞的周期状态。l与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基都参于对细胞凋亡的凋控。其中研究较多的有bcl-2c-myc、p53、Ice、Fas/APO-1等。l1、myclc-myc对增殖和凋亡的调节是一样的。当生长因子存在，bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。（一）细胞凋亡相关基因（一）细胞凋亡相关基因l2、bcl-2l细胞凋亡抑制基因，名称来源于B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-

18、celllymphoma/Leukemia-2，bcl-2)。lbcl-2能够编码bcl-2（26KD）和bcl-2（22KD）两种蛋白质，是膜的整合蛋白，主要存在于线粒体外膜、核膜及部分内质网中。lbcl-2的功能相当于线虫中的ced9。l3、fas lfas又称作APO-1，属TNF受体和NGF受体家族。l1993年人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。lfas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白。lFas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。l4、ICE蛋白酶家族lICE蛋白酶参与Fas诱导的细胞凋亡，与线虫细胞凋亡基因ced-3同源。lICE又称为Caspa

19、se，能选择性降解蛋白质。lced-4在哺乳动物中的同源体为Apaf-1 (apoptoticproteaseactivatingfactor-1)，能激活Caspase3，这一过程需要细胞色素c(Apaf-2)和Apaf-3的参与。（二）、（二）、Fas诱导的细胞凋亡诱导的细胞凋亡lFas与配体（如TNF）结合发生三聚化 ， 使 胞 内 的 DD区 （ Deathdomain）与接头蛋白FADD的DD区结合。lFADDN端 通 过 DED区 （ deatheffector domain）与Caspase-8前体蛋白和CAP3结合，激活Caspase-8。lCaspase-8自剪切活化，激活Caspase-3，Caspase-7lCaspase-3激活Caspase-6。lCaspase可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。lCaspase还可降解CAD的调节蛋白，释放出CAD，CAD进入细胞核降解DNA。CAD为caspase-activatedDnase，存在于胞质中。l线粒体在CD95诱导的凋亡中的作用：lCaspase引 起 线 粒 体 PT（ Permeabilitytransition）孔打开，导致线粒体的跨膜电位下降；l细胞色素C被释放到胞质中、激活Caspase-9，后者再激活Caspase-3。lBcl-2，Bcl-xl均作用于线粒体。