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1、第五章第五章 分子发光分析分子发光分析molecular luminescence analysis目前，该分析方法广泛应用于目前，该分析方法广泛应用于生命物质（生命物质（DNADNA、蛋白质、糖类）蛋白质、糖类）的检测，的检测，病毒、细胞病毒、细胞等活性物质的分等活性物质的分析，析，超痕量元素超痕量元素分析等！分析等！DNADNA排序排序SARSAR病毒、禽流感病毒的检测病毒、禽流感病毒的检测单分子检测单分子检测目目 录录第一节第一节 概概 述述第二节第二节 分子荧光分析法分子荧光分析法第三节第三节 分子磷光分析法分子磷光分析法第四节第四节 化学发光分析法化学发光分析法第一节第一节 概概 述
2、述一、分子发光的定义一、分子发光的定义 基态分子基态分子受到能量激发，吸收了一定能量后，跃迁至受到能量激发，吸收了一定能量后，跃迁至激发态激发态，激发态分子在很短时间内以激发态分子在很短时间内以辐射跃迁（发光）形式辐射跃迁（发光）形式释放能量释放能量并返回基态，便产生了分子发光。并返回基态，便产生了分子发光。外部能量光辐射基态激发态外部能量光辐射基态激发态根据激发方式不同，分子发光可分为根据激发方式不同，分子发光可分为光致发光光致发光、热致发光热致发光、场致发光场致发光和和化学发光化学发光等。等。其中，其中，光致发光光致发光根据激发态不同可分为根据激发态不同可分为荧光荧光和和磷光磷光两种。两种
3、。第一节第一节 概概 述述第二节第二节 分子荧光分析法分子荧光分析法 Molecular Fluorescence Analysis掌握要点：掌握要点：1.分子荧光分析法的定义、发展和特点；分子荧光分析法的定义、发展和特点；2.分子荧光的产生，荧光光谱及相关知识；分子荧光的产生，荧光光谱及相关知识；3.如何用分子荧光分析法进行定量测定；如何用分子荧光分析法进行定量测定；4.荧光分析仪器；荧光分析仪器；5.荧光分析法的应用。荧光分析法的应用。某些物质被某些物质被紫外光紫外光照射激发到单重激发态后，在回到基态照射激发到单重激发态后，在回到基态的过程中发射出比原激发的过程中发射出比原激发波长更长波长
4、更长的荧光，通过测量荧光强度进的荧光，通过测量荧光强度进行定量分析的方法。行定量分析的方法。 一一. .分子荧光分析法的定义分子荧光分析法的定义紫外光紫外光荧光荧光基态基态单重激发态单重激发态二二. .分子荧光分析法的特点分子荧光分析法的特点1.灵敏度较紫外可见分析法高灵敏度较紫外可见分析法高24个数量级；个数量级；2.选择性较好；选择性较好；3.主要用于定量分析；主要用于定量分析；4.能发射荧光的物质较少，应用不如紫外可见广泛。能发射荧光的物质较少，应用不如紫外可见广泛。其高灵敏度和许多生命物质都具有荧光性质，所以该方法在药物、其高灵敏度和许多生命物质都具有荧光性质，所以该方法在药物、临床、
5、环境、食品的微量和痕量分析以及生命科学研究上具有重临床、环境、食品的微量和痕量分析以及生命科学研究上具有重要意义。要意义。三三. .分子荧光分析法的发展分子荧光分析法的发展 第一次记录荧光现象的是第一次记录荧光现象的是1616世纪西班牙的内科医生和植物学世纪西班牙的内科医生和植物学家家N.MonardesN.Monardes，15751575年他提到在含有一种称为年他提到在含有一种称为“LignumNephriticumLignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱可爱的天蓝色的天蓝色。 在在1717世纪，世纪，BoyleBoyle（1
6、626162616911691）和）和NewtonNewton（1624162417271727）等著）等著名科学家再次观察到名科学家再次观察到荧光现象荧光现象。 18521852年，年，StokesStokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其察到其荧光的波长荧光的波长比比入射光的波长入射光的波长稍为稍为长些长些，才判明这种现象是这，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他还由发荧光的矿物他还由发荧光的矿物“萤石萤石”推演而提出推演而提出“荧光荧光”这一术语这一术语. 入射光入射光荧光
7、荧光StokesStokes还对还对荧光强度荧光强度与与浓度浓度之间的关系进行了研究，描述之间的关系进行了研究，描述了在高浓度时以及外来物质存在时的荧光猝灭现象。此外，他了在高浓度时以及外来物质存在时的荧光猝灭现象。此外，他还是第一个（还是第一个（18641864年）提出应用荧光作为分析手段的人。年）提出应用荧光作为分析手段的人。 18671867年，年，GoppelsrGoppelsr进行了历史上首次的荧光分析工作，应用进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝铝桑色素配合物的荧光进行桑色素配合物的荧光进行铝铝的测定。的测定。 18801880年，年，LiebemanLiebeman提出了最早的
8、关于提出了最早的关于荧光荧光与与化学结构化学结构关系的关系的经验法则。经验法则。 到到1919世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等烃等600600种以上的荧光化合物。种以上的荧光化合物。 19 19世纪以前，荧光的观察是靠世纪以前，荧光的观察是靠肉眼肉眼进行的，直到进行的，直到19281928年，年，才由才由JetteJette和和WestWest提出了第一台提出了第一台光电荧光计光电荧光计。早期的光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，的灵敏度是有限的，19391939年年ZworykinZworykin和和RajchmanR
9、ajchman发明发明光电倍增光电倍增管管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。是一个非常重要的阶段。19431943年年DuttonDutton和和BaileyBailey提出了一种提出了一种荧荧光光谱的手工校正步骤光光谱的手工校正步骤，19481948年由年由StuderStuder推出了第一台推出了第一台自动光自动光谱校正装置谱校正装置，到，到19521952年才出现商品化的年才出现商品化的校正光谱仪器校正光谱仪器。 荧光分析方法的发展，与仪器的发展是分不开的。荧光分析方法的发展，与仪器的发展是分
10、不开的。目前，荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动目前，荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药卫生、方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药卫生、环境保护、公安情报和科学研究等各个领域中。环境保护、公安情报和科学研究等各个领域中。 四四. .分子荧光的原理分子荧光的原理分子轨道的多重态分子轨道的多重态如果分子中的电子自旋方向相反的，此时如果分子中的电子自旋方向相反的，此时 S=0，M=l，这种态被称为，这种态被称为单单重态或重态或 S
11、 态态。一般分子的基态是。一般分子的基态是单重态单重态S0，若被激发时自旋方向没有改变，若被激发时自旋方向没有改变，则得到则得到激发单重态激发单重态S1、S2；如果被激发的电子在激发时自旋方向发生了改变，；如果被激发的电子在激发时自旋方向发生了改变，呈呈()或或()，则，则 S=1，M=3，此种态被成为，此种态被成为三重态或三重态或 T 态态。 分子多重态分子多重态 M 定义为定义为M=2S+1 图中按能量的高低，将单重态与三重态分别以图中按能量的高低，将单重态与三重态分别以 S0、S1、S2和和 T1、T2表示之。应该指出，表示之。应该指出，三重态的能量总是低于相应的单重态的。三重态的能量总
12、是低于相应的单重态的。 电子跃迁态图解电子跃迁态图解 电子的跃迁需受电子的跃迁需受“选择律选择律”的限制的限制 ，S0T1 禁阻跃迁（几率很小）。禁阻跃迁（几率很小）。荧光的产生荧光的产生人们16世纪就发现荧光现象，但真正懂得解释这一现象的时候，时间已经过了300多年了首先，人们懂得在分子的角度上解释。首先，人们懂得在分子的角度上解释。对紫外光或可对紫外光或可见光产生选择见光产生选择性的吸收。性的吸收。电子跃迁电子跃迁到激发态到激发态.具有不饱和具有不饱和键的基态分键的基态分子子.电子跃迁到激发态后，不稳定，要跃迁回基态，在这过程中能量需要被释放，电子跃迁到激发态后，不稳定，要跃迁回基态，在这
13、过程中能量需要被释放，通过发光的形式和其他形式，我们称为辐射跃迁和非辐射跃迁。通过发光的形式和其他形式，我们称为辐射跃迁和非辐射跃迁。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫电子跃迁类型电子跃迁类型 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛预振动弛预无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途
14、径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级基态；非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫：同一同一电子能级电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换内转换：同：同多重度电子能级多重度电子能级中中,等能级间等能级间的无辐射能级交换。的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态通过内转换和
15、振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。的最低振动能级。 外转换外转换：激发分子激发分子与与溶剂或其他分子之间溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间跨越系间跨越：不同多重态不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电子由：电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振
16、动能级基态（基态（ 多为多为 S1 S0跃迁跃迁），），发射波长为发射波长为 2的荧光；的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ； 磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态（基态（ T1 S0跃迁跃迁）； 电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁） S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-4100 s 。 光
17、照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。波长跟激发态基态能量差有关，强度与发生跃迁分子多少有关。波长跟激发态基态能量差有关，强度与发生跃迁分子多少有关。荧光和磷光光谱荧光和磷光光谱五五. .激发光谱与荧光激发光谱与荧光( (磷光磷光) )光谱光谱 荧荧光光( (磷磷光光) )：光光致致发发光光，照照射射光光波波长长如如何何选选择？择？1.1.荧光荧光( (磷光磷光) )的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固固定定测测量量波波长长( (选选最最大大发发射射波波长长),),化化合合物物发发射射的的荧荧光光( (磷磷光光) )强强度度与与照照射射光光波波长长的的关关系系曲曲线线 （图中曲线（
18、图中曲线I I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；分子最多，荧光强度最大；2.2.荧光光谱荧光光谱( (或磷光光谱或磷光光谱) ) 固定激发光波长固定激发光波长( (选最大激发波选最大激发波长长), ), 化合物化合物发射的荧光发射的荧光( (或磷光强或磷光强度度) )与与发射光波长发射光波长关系曲线关系曲线( (图中曲图中曲线线II或或III) )。丁省的激发光谱和荧光发射光谱丁省的激发光谱和荧光发射光谱波长（nm）五五. .荧光效率和影响因素荧光效率和影响因素 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1
19、）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（荧光量子产率（ ）：）： 荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速速率率常常数数有有关关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；如外转换过程速度快，不出现荧光发射；2.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）跃跃迁迁类类型型： * 的的荧荧光光效效率率高高，系系间间跨跨越越过过程程的的速速率率常数小，有利于荧光的产生；常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）
20、刚刚性性平平面面结结构构：可可降降低低分分子子振振动动，减减少少与与溶溶剂剂的的相相互互作作用用，故故具具有有很很强强的的荧荧光光。如如荧荧光光素素和和酚酚酞酞有有相相似似结结构构，荧荧光光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应取代基效应：芳环：芳环上有供电基，使荧光增上有供电基，使荧光增强。强。3.3.影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 影响荧光强度的外部因素：影响荧光强度的外部因素：1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除除一一般般溶溶剂剂效效应应外外，溶溶剂剂的的极极性性、氢氢键键、配配位位键键的的形形成成都将使化合物的荧光发生变化；都将使化合物的荧光发生变化
21、；2.2.温度的影响温度的影响 荧荧光光强强度度对对温温度度变变化化敏敏感感，温温度度增增加加，外外转转换换去去活活的的几几率增加率增加；3. 溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；4.4.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自自吸吸现现象象：化化合合物物的的荧荧光光发发射射光光谱谱的的短短波波长长端端与与其其吸吸收收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重
22、铬酸钾；的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；5.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭；碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。氧的熄灭作用等。一、定量依据一、定量依据荧光量子产率（荧光量子产率（ ）：）：其中，其中，IfIf为荧光强度，为荧光强度，IaIa为被吸收的激发光强度。为被吸收的激发光强度。I I0 0为入射光强度，为入射光强度，I I为为透射光强度。透射光强度。IfIaIfI0-I因为A=lgI0I则I=I010-AIf= ( (I0-I)= )= I I0 0(1-10(1-10-A-A)= )= I I0 02.3A- - -2.3A- - - (-2.3A)22!(-2.3A)33!当被测
23、物浓度很小时，当被测物浓度很小时，A0.05A0.05， I If f= = 2.32.3 I I0 0A A 2.32.3 I I0 0k kbCbC五五. .荧光定量分析法荧光定量分析法If= 2.3 I0kbCKC标准曲线法测定标准曲线法测定 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由五五个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、第第一一单色器、单色器、样品池、第二单色器、检测器样品池、第二单色器、检测器。 特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：基本流程如图：光光源源：氙氙灯灯和和高高压压汞汞灯灯，染染料料激激光光器器(
24、(可可见见与与紫紫外外区区) )单单色色器器：选选择择激激发发光光波波长长的的第第一一单单色色器器和和选选择择发发射射光光( (测测量量) )波波长长的的第第二二单单色色器；器；检测器：检测器：光电倍增管光电倍增管。二、仪器流程二、仪器流程三、荧光法的应用三、荧光法的应用1.单组分单组分物质的物质的直接测定直接测定和和间接测定间接测定（1 1）无机离子）无机离子如如MgMg、AlAl、CaCa等，本身不发射荧光，但与有机试剂可等，本身不发射荧光，但与有机试剂可形成荧光配合物进行定量测定；形成荧光配合物进行定量测定；（2 2）有机化合物）有机化合物本身发射荧光的，如罗丹明本身发射荧光的，如罗丹明
25、B B、荧光素等可直接测定；、荧光素等可直接测定；不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质进行测定；进行测定；（3 3）生命物质）生命物质大部分的酶、蛋白质、维生素等可发射荧光。大部分的酶、蛋白质、维生素等可发射荧光。待 测 物试 剂激发光波长nm荧光波长nm测定范围c /（g/ml） 丙三醇糠醛蒽苯基水杨酸1-萘酚四氧嘧啶维生素A氨基酸蛋白质肾上腺素胍基丁胺玻璃酸酶青霉素苯胺蒽酮 N,N二甲基甲酰胺（KOH） 0.1moldm3NaOH苯二胺无水乙醇氧化酶等曙红丫乙二胺邻苯二醛3-乙酰氧基吲哚甲氧基6氯9-（ 氨乙基）氨基氮杂蒽 紫外465
26、365366紫外365345315紫外420365395420蓝色5054004105004854904255405254704705000.121.51505310-8510-6moldm-3 10-100200.01500.0660.0010.020.0550.0010.0330.06250.625（1）蛋白质的测定）蛋白质的测定蛋白质具有三种氨基酸，即酪氨酸、色氨酸和蛋白质具有三种氨基酸，即酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，它们受激发后发射的荧光最大波长苯丙氨酸，它们受激发后发射的荧光最大波长分别为分别为303nm303nm348nm348nm和和282nm282nm。最大激发波长为。最大激发波
27、长为280nm280nm。2.2.其他应用其他应用（2 2）DNADNA序列测定序列测定在单链的在单链的DNADNA的碱基上接上荧光基团，不同碱基标记不同的碱基上接上荧光基团，不同碱基标记不同荧光团，然后依次切下每个碱基进行测定。荧光团，然后依次切下每个碱基进行测定。20012001年美国遭受年美国遭受911911袭击时，美国世贸大厦内袭击时，美国世贸大厦内一共有一共有2 2万万5 5千多人，人们惊讶地发现了一个世界都千多人，人们惊讶地发现了一个世界都为之惊叹的纪录：两座大楼里，为之惊叹的纪录：两座大楼里，1 1万万8 8千多人在上百千多人在上百层的大楼完全断电的情况下，在一个半小时之内成层的大楼完全断电的情况下，在一个半小时之内成功逃生。功逃生。
