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1、实验二实验二 总总RNARNA提取、提取、RT-RT-PCRPCR制备制备cDNAcDNA及及DNADNA克隆克隆Total RNA Total RNA Preparation,cDNA Preparation,cDNA preparation by RT-preparation by RT-PCR,and DNA cloningPCR,and DNA cloning1v实验二和实验三是以获取纯化的表达蛋白质为目的，从RNA提取开始，经过RT-PCR获取特定基因的cDNA片断，再进行重组、筛选获取克隆，最后进行基因编码蛋白质的表达、纯化、和检测。2第一天1.小鼠脑总RNA的提取；2.RNA含量
2、测定；3.RT-PCR4.载体酶切3第二天1.琼脂糖凝胶电泳检测检查RNA及PCR产物；2.RT-PCR产物的纯化；3.PCR产物的快速酶切；4.载体及PCR酶切产物的乙醇沉淀纯化；5.琼脂糖凝胶电泳检测检查载体及PCR酶切状况，DNA浓度的微量测定；6.连接反应4第三天1.感受态细菌的制备；2.细菌转化5从组织中一步法分离总从组织中一步法分离总RNATotal RNA isolation from tissues by One-Step RNA Purification Method1、取小鼠，断颈处死，用剪刀沿小鼠枕骨断开小鼠颈椎，露出枕骨大孔，然后从枕骨大孔分别向两侧剪开小鼠颅骨，用镊子
3、小心向上掰开顶骨，取出暴露的大脑。（取出肝脏-20冻存）实验步骤：第一天62、玻璃匀浆器中加入4ml的RNAiso试剂置冰上待用。3、立即取出脑组织，移入玻璃匀浆器中，立即在冰浴中上下研磨十次左右进行匀浆。4、然后将匀浆液平均转移入4只2ml离心管中，室温静置5分钟。第一天75、加入0.4ml氯仿，盖紧管口，用力颠倒离心管3-5次进行混合，室温再静置5min后。6、12000rpm4离心10min；用移液器将上层水相分别转移入1.5ml离心管，每只600L。7、加入600L异丙醇，颠倒混匀后室温静置5-10min，15000rpm离心5min。第一天88.用移液器将上清去净后，加入1mLDEP
4、C处理过的75%乙醇，振荡片刻，再于15000rpm离心5min；再次去净上清，敞口室温静置5-15min，待RNA沉淀略干。9.每管中加入DEPC处理过的蒸馏水100L溶解RNA，4保存备用。第一天9RNA含量的紫外分光光度计测定含量的紫外分光光度计测定Determination of RNA contents by UV-Spectrometerv操作：取两只比色杯，一只加入1470LDEPC处理过的蒸馏水，再加入30LRNA液；一只加入1.5mLDEPC处理过的蒸馏水v混匀后置紫外分光光度计中，分别测定其在260nm和280nm的光吸收值，计算出二者的比值与RNA溶液浓度。第一天10一步
5、法一步法RT-PCR制备制备cDNAcDNA Preparation by One-Step RT-PCRvRT-PCR采用一步RT-PCR试剂盒（TransGenBiotech)v每组取一薄壁反应管（200uL）ComponentsVolumeRNATemplateXuL（5ug）ForwardPrimer1uLReversePrimer1uL2HiFiPCRSuperMix25uLOne-stepEnzymeMix1uLRNase-freeWaterto50uL反应体系：第一天11反应条件4530min水浴箱PCR仪942min9430sec5530sec进行30次循环72180sec72
6、5min第一天12载体DNA的酶切v取1.5ml离心管，按下列表中所列加入组分：v1v载体DNAv-vDNA溶液（l）20v10X缓冲液5vdH2O23v-v混匀后分别加入相应的酶vBamHI(GGATCC)1vCIAP1v-v混匀，37温浴过夜第一天13第二天用移液器将PCR反应液40L转移入一只1.5mL离心管中，用于纯化。在PCR反应管中加入适量10X上样液（约1L），用于电泳检测。14琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis1、琼脂糖胶模的准备：2、样品准备：向每一只样品管中加入9uL样品、1uL10X上样液，混匀备用。第二天MRNAPCR第一
7、组第二组第三组第四组15PCR产物（产物（DNA）的纯化）的纯化Purification of PCR product1.向装有PCR反应液的1.5mL离心管中加入5倍体积（200L）BindingSolutionB,上下颠倒混匀。2.将混合液转移到套放收集管的GenClean柱中，室温放置2min,于8000rmp离心1min。第二天163.取下GenClean柱，倒掉收集管中的废液。4.将GenClean柱重新放回收集管中，加入500LWashSolution，于12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。5.重复步骤4一次。第二天176.将GenClean柱重新放回收集管中，于12
8、000rpm离心1min，以彻底去除WashSolution。（开盖室温放置10min，将有助于WashSolution中的乙醇挥发干净）187.将GenClean柱放入干净的1.5mL离心管中，在GenClean柱吸附膜中央小心加入60LElutionBuffer，37放置2min备用。（将ElutionBuffer加热至65将提高洗脱效率）19PCR产物的限制酶切产物的限制酶切 Restriction Digestion of DNA取1.5ml离心管，按下列表中所列加入组分：2PCR产物-DNA溶液（l）4310X缓冲液5dH2O-混匀后分别加入相应的酶BamHI(GGATCC)2-混匀
9、，37温浴10min第二天20DNA的乙醇沉淀纯化的乙醇沉淀纯化Purification of DNA by achohol precipitation u向酶切反应管（载体及PCR)中加入50LTE，然后加入100L苯酚/氯仿，于振荡器上振荡10sec，然后15000rpm离心5min，将上层水相移入一只新离心管。第二天21v再加入1/10体积（10L）的3MNaAc和2倍体积（220L）的无水乙醇，混匀后于15000rpm离心10min；去上清后，加1mL75%乙醇，再次离心1min，用移液器去净上清，将离心管敞口于室温静置5-15min干燥，然后加入20LTE缓冲液溶解DNA。第二天22
10、电泳法微量DNA定量分析v电泳方法同前，将胶中样品DNA区带的亮度与同一胶中标准DNA（Marker）的各区带的亮度相比较，就可以估算出样品区带中的DNA含量。v每一只样品管中加入5uL样品、0.5uL10X上样液，混匀备用。MVectorPCR第一组第二组第三组第四组第二天23DNA的重组连接的重组连接 DNA Ligationv取一只1.5mL离心管，加入100ng酶切PCR产物，100ng酶切载体DNA和2L10X连接反应液，再加水至20L；混匀后，加入1U的T4DNA连接酶，混匀后16保温4hr以上，然后4保存。第二天24感受态细菌制备感受态细菌制备 Preparation of Co
11、mpetent Bacteriav1、细菌划盘培养：取一不含抗菌素的LB培养皿，将接种环于酒精灯上烧灼灭菌，冷却后蘸取菌种于培养基上划线，然后将培养皿倒扣置37温箱中过夜培养，第二天早上取出置室温待用。第三天25v2、细菌过夜液态培养：第二天下午5点左右，取经过高压消毒的MA培养液10mL移入一100mL容积的三角烧瓶，加四环素至终浓度为10ug/mL；用200ml移液器从培养皿上取一个菌落接种于其中，37230rpm振摇过夜。第三天26v第三天，将100l过夜培养的菌液转移入10mlSOB培养液中，继续于37oC230rpm振摇培养3-4hr，至菌液的OD600nm=0.4-0.6（细菌的指
12、数生长期）。第三天273、感受态细菌制备：取一1.5mL离心管（分别标记为管1、2），各加入1.4mL培养细菌，冰浴中冷却10min后于415000rpm离心1min，去净上清，加入0.4ml感受态制备液A，上下吹吸悬浮细菌，然后置冰浴中15min；第三天28v4，15000rpm离心1min，去净上清，加入100L感受态制备液B，上下吹吸悬浮细菌，加入1L的1.4M巯基乙醇，混匀后置冰浴待用10min待用第三天29细菌转化细菌转化 Transformation of Bacteria1、向感受态细菌管1中加入5L连接反应液，向感受态细菌管2中加入1ng的质粒DNA，混匀后置冰浴中静置30-4
13、5min；然后移入42热休克处理1.5min；再移入冰浴静置2-5min。2、向各管中加入900LSOC培养液，颠倒混匀，置37保温60min，每15min颠倒混匀一次。第三天303、铺盘：对应于每一转化反应取两个含抗生素的MA培养皿，标记上组号和反应号，先将全部培养液转移入一培养皿，然后使其均匀分布于全平皿，再倾斜吸出多余的菌液移入第二个平皿中，同样处理使菌液均匀分布于培养皿上。第三天314、过夜培养：将第一个培养皿倒扣，第二个培养皿正置于37温箱中过夜培养。第二天，取出培养皿，挑选菌落进行培养、提取DNA、和筛选；或者用封口膜封住培养皿，置4可以保存1-2星期。第三天32相关实验原理RNA
14、提取vRNA酶易复活，不易彻底去除，使RNA极易降解。因此，在提取、保存、使用RNA的过程中，必须时刻注意防止RNA酶污染问题。33v一般采取预防为主的措施，所有与RNA接触的试剂、器材都需要去RNA酶处理。一般金属、玻璃制品可以于160oC加热2-6小时；塑料制品可以用氯仿、过氧化氢、DEPC处理；试剂和水可以用DEPC处理，然后再高压消毒除去残留的DEPC。v此外，在操作方面需要注意快捷，尤其要缩短从处死动物到RNA提取开始这段时34TotalRNA电泳照片35RT-PCR36DNA琼脂糖凝胶电泳v实验原理实验原理 DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的
15、分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。37v（2）琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.50.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。38v琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得
16、到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径39感受态细菌的制备v大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA（PlasmidDNA、PhageDNA等），处于这种状态的细胞称为感受态细胞（CompetentCell）。v将处于对数生长期的细菌悬浮于冰冷的CaCl2溶液中。经冰育一段时间后，细胞膜的通透性增加，细胞就具备了感受态特性，此时加入外源DNA，经42短暂热处理后，外源DNA进入感受态细胞。40
