《三节聚合酶链反应polymerasechareactionPCR》由会员分享，可在线阅读，更多相关《三节聚合酶链反应polymerasechareactionPCR（26页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三节第三节 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase polymerase chain reaction,PCRchain reaction,PCR）l lPCRPCR是模拟体内是模拟体内DNADNA复制条件，应用复制条件，应用DNADNA聚聚合酶反应，特异性扩增某一合酶反应，特异性扩增某一DNADNA片段的技片段的技术。术。l l体外程序化的体外程序化的DNADNA合成技术。合成技术。1 1PCR2 2原原 理：理：1 1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板合成待扩增区域两端已知序列，与模板合成待扩增区域两端已知序列，与模板合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNADNADNADNA
2、互补互补互补互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；段的长度；段的长度；段的长度；2 2 2 2）反应体系：反应体系：反应体系：反应体系：DNADNADNADNA模板，模板，模板，模板，dNTPdNTPdNTPdNTP，TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶，聚合酶，聚合酶，聚合酶，bufferbufferbufferbuffer3 3）反应程序：反应程序：反应程序：反应程序： 变性变性变性变性94959495o oC C复性复性
3、复性复性延伸延伸延伸延伸37553755 o oCC70727072 o oCC72727272 o o o oC C C C延伸延伸延伸延伸10101010minminminmin DNA DNA DNA DNA扩增扩增扩增扩增100100100100万倍万倍万倍万倍3 3PCR扩增4 4PCR特点及应用：特点：特点：特点：特点：（1 1 1 1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快 速；速；速；速； 2 2 2 2）微量的模板）微量的模板）微量的模板）微量的模板DNADNADNADNA即可扩增
4、大量产物即可扩增大量产物即可扩增大量产物即可扩增大量产物; ; ; ;应用：应用：应用：应用：（1 1 1 1）基因组）基因组）基因组）基因组DNADNADNADNA分析；分析；分析；分析； （2 2 2 2）遗传物质的鉴定；）遗传物质的鉴定；）遗传物质的鉴定；）遗传物质的鉴定； （3 3 3 3）遗传病的诊断）遗传病的诊断）遗传病的诊断）遗传病的诊断; ; ; ;缺点：缺点：缺点：缺点：（1 1 1 1）需靶）需靶）需靶）需靶DNADNADNADNA序列的信息；序列的信息；序列的信息；序列的信息； （2 2 2 2）产物短小，）产物短小，）产物短小，）产物短小，DNADNADNADNA复制不
5、精确。复制不精确。复制不精确。复制不精确。5 5PCRPCR相关技术：相关技术：1.1.1.1.增效增效增效增效PCRPCRPCRPCR（booster PCRbooster PCRbooster PCRbooster PCR）当当当当扩增少于扩增少于扩增少于扩增少于1000100010001000拷贝的模板拷贝的模板拷贝的模板拷贝的模板DNADNADNADNA时会遇到两时会遇到两时会遇到两时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特
6、异扩增片段产量降低。对消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步于这种情况，可设置二步于这种情况，可设置二步于这种情况，可设置二步PCRPCRPCRPCR，先用较低浓度的先用较低浓度的先用较低浓度的先用较低浓度的引物进行初级引物进行初级引物进行初级引物进行初级PCRPCRPCRPCR，此时由于引物少，形成引物此时由于引物少，形成引物此时由于引物少，形成引物此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，二聚体的可能减少，但它并
7、不影响靶序列的扩增，二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经只是由于引物少产量不高。约经只是由于引物少产量不高。约经只是由于引物少产量不高。约经1515151520202020个循环后个循环后个循环后个循环后补充产物量，以初级补充产物量，以初级补充产物量，以初级补充产物量，以初级PCRPCRPCRPCR产物为模板进行扩增，产物为模板进行扩增，产物为模板进行扩增，产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。靶序列的产量将相应增加。靶序列的产量将相应增加。靶序列的产量将相应增加。6 62. 2. 巢式巢式PCRPCR（nest PCRnest PCR）此时也是进行二
8、步此时也是进行二步PCRPCR，与上面不同的与上面不同的是，第二是，第二级级PCRPCR需另行设置反应体系，并应需另行设置反应体系，并应用另外的用另外的PCRPCR引物，此时引物的位置位于初引物，此时引物的位置位于初级级PCRPCR引物的内侧，用初级引物的内侧，用初级PCRPCR产物做模板，产物做模板，进行第二步进行第二步PCRPCR，这样只有初级这样只有初级PCRPCR中特异中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效除了达到增效PCRPCR同样的目的外，还提同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。高了最终产物的特异性。7 7l l在同一在同一PCRPCR体
9、系中加入数对体系中加入数对PCRPCR引物，如果引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个多个DNADNA片段。片段。l l多重多重PCRPCR常用来检测同一基因的多个外显子常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。的缺失，或在检测缺失设置内对照。3 3、多重、多重PCRPCR8 84.RT-PCR4.RT-PCRl lRT-PCRRT-PCR是以是以mRNAmRNA为模板，经逆转录酶作为模板，经逆转录酶作用合成用合成cDNAcDNA。使微量的使微量的mRNA
10、mRNA（pgpg水平）水平）迅速扩增（达迅速扩增（达ngngugug水平），大大提高水平），大大提高mRNAmRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。调控的研究。9 9RT-PCR1010RT-PCRcDNA1111五、单链构象多态性（五、单链构象多态性（Single Strand Single Strand Conformation Polymorphism, Conformation Polymorphism, SSCPSSCP）l l是指单链是指单链是指单链是指单链DNADNADNADNA由于碱基序列不同可引起构象差由于碱基序列不同可引起构象差由于
11、碱基序列不同可引起构象差由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链异，这种差异将造成相同或相近长度的单链异，这种差异将造成相同或相近长度的单链异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNADNADNADNA电泳迁移率不同。据此，可用于电泳迁移率不同。据此，可用于电泳迁移率不同。据此，可用于电泳迁移率不同。据此，可用于DNADNADNADNA中单个碱基中单个碱基中单个碱基中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。的替代，微小的缺失或插入的检测。的替代，微小的缺失或插入的检测。的替代，微小的缺失或插入的检测。 通常与通常与通常与通常与PCRPCRPCRPCR技术联合应用，称为
12、技术联合应用，称为技术联合应用，称为技术联合应用，称为PCR-SSCPPCR-SSCPPCR-SSCPPCR-SSCP技术。技术。技术。技术。l l 在疑有突变的在疑有突变的在疑有突变的在疑有突变的DNADNADNADNA片段附近设计一对引物，进行片段附近设计一对引物，进行片段附近设计一对引物，进行片段附近设计一对引物，进行PCRPCRPCRPCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的酰胺凝胶中电泳（中性胶
13、），突变所引起的酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNADNADNADNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。判断。判断。判断。1212PCR-SSCPPCR-SSCP过程：过程：-primerprimer-3232P-dNTPP-dNTP掺入掺入掺入掺入PCRPCR扩增扩增扩增扩增产物产物产物产物 变性变性变性变性 单链单链单链单链DNADNA中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳1234512345自
14、显影自显影自显影自显影1.1.为正常为正常结果分析结果分析结果分析结果分析2 2、4 4、5 5纯合患者纯合患者3.3.为杂合子为杂合子.解链构像DAN原理过程1313第二节第二节 DNADNA多态多态l lDNADNA多态（多态（DNA PolymorphismDNA Polymorphism）：）：l l群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNADNA是不完全相同的，一般每是不完全相同的，一般每100100500500bpbp就有一就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现表型并没有改变，这
15、种表现称为称为DNADNA多态多态。常。常用做遗传分析中的标记。用做遗传分析中的标记。l l除一卵双生子外，没有两个个体的基因组除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNADNA是完全相同的。是完全相同的。 1414DNADNA分析中常用的多态性标记有分析中常用的多态性标记有3 3类类：1 1）RFLPRFLP：称限制性片段长度多态性，为第一称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；代多态性标记；2 2）重复序列多态性重复序列多态性：短串联重复序列：短串联重复序列（STRSTR），），为第二代多态性标记；为第二代多态性标记；3 3）单碱基多态性（单碱基多态性（SNPSNP）：DNADNA序列的
16、单个核序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。苷酸的差别，为第三代多态性标记。1515一、序列多态（或点多态）一、序列多态（或点多态）l l限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（Restriction Restriction Restriction Restriction Fragment Length Polymorphism Fragment Length Polymorphism Fragment Length Polymorphism Fragment Length Polymorphism ，RFLP RFLP RFLP RFLP ）。
17、）。）。）。l l由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或新的酶切点出现，从而引起不同个体的新的酶切点出现，从而引起不同个体的新的酶切点出现，从而引起不同个体的新的酶切点出现，从而引起不同个体的DNADNADNADNA在用同一在用同一在用同一在用同一限制酶切割时，产生限制酶切割时，产生限制酶切割时，产生限制酶切割时，产生DNADNADNADNA片段长度的差异。这种由于片段长度的差异。这种由于片段长度的差异。这种由于片段长度的差异。这种由于酶切位点变化导致的酶切位点变化导致的酶
18、切位点变化导致的酶切位点变化导致的DNADNADNADNA片段长度的差异称为片段长度的差异称为片段长度的差异称为片段长度的差异称为RFLPRFLPRFLPRFLP。l lRFLPRFLPRFLPRFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。用的遗传标记。用的遗传标记。用的遗传标记。1616AlleleII产生了新的酶切点 Allele IAllele IAllele IAllele IAllele IIAllele II12Kb8Kb4Kbprobeprobe12Kb8KbR
19、FLPSouthern blotRFLPSouthern blot检测结果检测结果 1717AlleleIIAlleleII酶切位点消失酶切位点消失1818二、序列长度多态性（或数目变异串联重复，二、序列长度多态性（或数目变异串联重复，variable number variable number tendomtendom repeats, VNTR repeats, VNTR）l l重复序列以各自的核心序列（重复单元），重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列。首尾相连多次重复，称为串联重复序列。散在地分布于染色体上，以插入散在地分布于染色体上，以插入/ /缺
20、失方式缺失方式形成多态。如图：形成多态。如图：l lVNTRVNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之两侧的酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。同长度的片段。1919VNTR VNTR 酶切，电泳后的检测结果酶切，电泳后的检测结果大小2020PCR-VNTR检测2121通常，重复单位1628bp长，称为小卫星DNA。 重复单位6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism
21、, Amp-FLP）2222PCR-VNTR2323生物芯片技术生物芯片技术 l l九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载微型多参数生物传感器。它通过在一
22、微小的固体载体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。l l基因芯片（又称基因芯片（又称基因芯片（又称基因
23、芯片（又称DNADNADNADNA芯片，生物芯片，芯片，生物芯片，芯片，生物芯片，芯片，生物芯片，DNADNADNADNA探针微列探针微列探针微列探针微列阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，序
24、列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。实现生物基因信息的大规模检测。实现生物基因信息的大规模检测。实现生物基因信息的大规模检测。 2424基因芯片基因芯片如：如： 靶基因靶基因 基因组基因组特异性片段特异性片段 探探 针针 -AGCTTAGC- AGCTTAGC- 靶序列靶序列-TCGAATCG-probeABC12345检测2525基因芯片的应用：一、基因组扫描一、基因组扫描二、寻找基因功能二、寻找基因功能三、基因型及单碱基多态（三、基因型及单碱基多态（SNPSNP）四、突变检测四、突变检测五、基因表达五、基因表达2626
