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1、荧光定量PCR在临床医学中的应用1内容提要一、基因诊断技术简介一、基因诊断技术简介二、乙型肝炎的病原检测二、乙型肝炎的病原检测三、丙型肝炎的病原检测三、丙型肝炎的病原检测四、性病相关病原体的检测四、性病相关病原体的检测2基因诊断技术简介34 基因诊断3 免疫学诊断临床诊断细胞膜细胞核DNA转录 mRNA翻译蛋白质1 形态学诊断2 生化诊断概念4PCR与基因诊断技术l基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。lPolymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小
2、片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。 l九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。5荧光定量PCR技术l实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光染料：SYBR Green I、EVA Green荧光探针：TaqMan、 Hybridization Probes 、Molecular Beacon67荧光定量PCR技术的
3、优点l特异性强：直接扩增病原体的特异DNA或异常基因片段l灵敏度高：可检测到极少量的DNA，有效降低漏诊率l高效省时：扩增周期短，有利于快速诊断l取材范围广：血清、痰液、体液、毛发等多种样本l全封闭反应：无需PCR后处理，降低污染l定量准确：利用标准曲线法，采用对数期分析l自动化程度高：操作安全，避免人为判断8RocheLightCycler910荧光定量PCR技术的临床应用l病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测l性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV）的基因检测l优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒II型（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒l其它病
4、原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等11乙型肝炎的病原检测12乙肝病毒乙肝病毒1314 HBV的感染过程的感染过程15乙肝如何传染？16慢性HBV感染病毒持续病毒持续6个月未被清除者个月未被清除者l免疫耐受期：HBV复制活跃l免疫清除期l非活动或低复制期17慢性乙型肝炎lHBeAg阳性慢性乙型肝炎lHBeAg阴性慢性乙型肝炎18乙型肝炎肝硬化l代偿期肝硬化l失代偿期肝硬化19HBsAg与抗HBslHBsAg在感染在感染HBV两周后即可阳性。只要两周后即可阳性。只要HBsAg阳阳性就可诊断性就可诊断HBV感染，阴性则不能排除感染，阴性则不能排除HBV感染。感染。l抗
5、抗HBs为保护性抗体，阳性表示对为保护性抗体，阳性表示对HBV有免疫力。有免疫力。20HBsAg和抗和抗HBs同时阴性：同时阴性： 即所谓窗口期，此时即所谓窗口期，此时HBsAg和抗和抗HBs都未产生。都未产生。HBsAg和抗和抗HBs同时阳性：同时阳性： HBV感染恢复期，此时感染恢复期，此时HBsAg未消失，抗未消失，抗HBs已已产生。或者是亚型感染。产生。或者是亚型感染。 21为什么HBsAg阴性不能排除HBV感染？l窗口期窗口期l检测试剂不够灵敏检测试剂不够灵敏l隐匿性慢性乙肝（隐匿性慢性乙肝（S S基因变异）基因变异）l重叠重叠HCVHCV感染（干扰感染（干扰HBsAgHBsAg合成
6、）合成）22抗HBs阳性就万无一失了吗？单一抗单一抗HBsHBs阳性阳性HBV DNAHBV DNA检出率检出率0-11.8%0-11.8%l先后感染了不同的先后感染了不同的HBVHBV亚型亚型lHBVHBV病毒病毒S S基因变异基因变异23如何诊断血清HBsAg阴性的HBV感染？l提高提高检测敏感性检测敏感性l采用针对变异抗原的检测试剂采用针对变异抗原的检测试剂lHBV DNAHBV DNA的检测！的检测！24HBeAg与抗HBelHBeAg的存在表示病毒复制活跃且有较强的的存在表示病毒复制活跃且有较强的传染性。传染性。HBeAg消失而抗消失而抗HBe产生称为血清产生称为血清转换。抗转换。抗
7、HBe阳转后，病毒复制水平低，传染阳转后，病毒复制水平低，传染性降低。性降低。l但长期抗但长期抗HBe阳性者并不代表病毒复制停止或阳性者并不代表病毒复制停止或无传染性，研究显示无传染性，研究显示20%50%仍可检测到仍可检测到HBV DNA，部分可能由于前，部分可能由于前C区基因变异，区基因变异，导致不能形成导致不能形成HBeAg。25HBeAg与抗HBe共存？l处于血清转换过程中处于血清转换过程中l野生株与变异株同时存在野生株与变异株同时存在26HBeAg水平与HBV DNA的关系lHBeAgHBeAg阳性标本阳性标本HBV DNAHBV DNA检出率检出率9090左右左右lHBeAgHBe
8、Ag与与HBV DNAHBV DNA有着良好的相关性有着良好的相关性27HBeAg阴性/抗HBe阳性/HBV DNA阳性HBV DNA水平一般较低水平一般较低lHBVHBV低水平复制低水平复制lHBVHBV病毒前病毒前C C区基因变异区基因变异l重叠重叠HCVHCV感染感染28“两对半”缺陷l“两对半”是机体的免疫反应状态，为间接指标。机体的免疫反应状态，为间接指标。l l“ “携带者携带者” ”、“ “大三阳大三阳” ”、“ “小三阳小三阳” ”等免疫学指标不能等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。反应体内病毒复制水平与感染程度。l lHBsAgHBsAg阴性或阴性或HBeAgHB
9、eAg阴性不能排除阴性不能排除HBVHBV感染。感染。29HBV DNA 是病毒复制和传染性的直接标志。是病毒复制和传染性的直接标志。HBV DNA定量对于判断病毒复制程度、传染性大定量对于判断病毒复制程度、传染性大小、病毒药物疗效等有重要意义。小、病毒药物疗效等有重要意义。HBV DNA拷贝数乙肝病毒载量拷贝数乙肝病毒载量30HBV DNA检测的临床意义lHBV DNAHBV DNA是是HBVHBV存在最直接的依据存在最直接的依据lHBV DNAHBV DNA是是HBVHBV复制的标志复制的标志lHBV DNAHBV DNA是患者具有传染性的标志是患者具有传染性的标志lHBV DNAHBV
10、DNA对乙肝两对半起补充作用对乙肝两对半起补充作用lHBV DNAHBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标lHBV DNAHBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎可检测出隐匿性慢性乙型肝炎31提供直接证据缩短提供直接证据缩短“窗口期窗口期”PCRPCR检测“窗口期窗口期”核酸核酸检测缩短的短的“窗口期窗口期”的天数的天数HBVHBV56566-156-15HCVHCV707041-6041-60HIVHIV222210-1510-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断HBV DNA检测的临床
11、意义32HBV DNA检测的临床意义 调查表明并不是所有调查表明并不是所有“大三阳大三阳”的病人都处的病人都处于于HBV复制期，具有传染性；也不是所有复制期，具有传染性；也不是所有“小小三阳三阳”的病人的病人HBV都无复制。因此，要准确知都无复制。因此，要准确知道道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测通过检测HBV DNA来决定。来决定。33HBV DNA检测方法l斑点杂交（基本淘汰）斑点杂交（基本淘汰）l定性定性PCR（基本淘汰）（基本淘汰）l荧光定量荧光定量PCR（主流）（主流）l基因芯片（将来？）基因芯片（将来？）34为什么建议病人要进行HB
12、V DNA检测？35荧光定量PCR方法检测HBV感染的各期血清标本Copies/mlHBeAg阳性慢性乙型肝炎病人8.3 x 108经干扰素治疗后HBeAg转阴6.2 x 103非活动性HBsAg携带者血清5.6 x 103原先血中HBV DNA阳性，已痊愈超过12个月的血清1033637HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性？l干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。lPCR所用引物相应的所用引物相应的DNA序列发生突变，此序列发生突变，此引物与突变引物与突变DNA不能配对结合。不能配对结合。l病毒病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离整
13、合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。很少或缺乏。38乙肝的治疗l目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到最好的抗病毒药物疗效也仅能达到5050左右。左右。l目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：病毒药物主要有两大类： 干扰素：重组人干扰素：重组人-1b-1b干扰素、干扰素、- 2a- 2a、 -2b -2b干扰素等。干扰素等。 核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。39乙肝的治疗主要包括抗
14、病毒、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化等对于HBV DNA105的患者应进行抗病毒治疗40拉米夫定l可迅速降低HBV DNAHBV DNA的浓度，改善肝脏组织的病变，还可能阻断肝纤维化的进程，终止肝硬化的发展。l尤其是拉米夫定不受病毒感染的模式、野生型或基因组前C区突变的影响。l此外拉米夫定还能抑制肝移植受体和AIDSAIDS病人体内的HBVHBV复制。41拉米夫定治疗人群l有明显HBV DNA复制者l前C区变异的慢性乙型肝炎l代偿期的慢性乙型肝炎l接受肝脏移植的患者l干扰素治疗失败42拉米夫定治疗效果l绝大多数患者绝大多数患者HBV DNAHBV DNA水平显著下降。水平显著下降。l用药用药4
15、4周开始下降，周开始下降，1212至至1616周约半数以上的病周约半数以上的病例血清例血清HBV DNAHBV DNA降到可检测水平以下。降到可检测水平以下。l治疗治疗1 1年后年后HBeAgHBeAg阴转率约为阴转率约为20%20%。43l病毒学应答：HBV DNA低于检测下限l血清学应答l生化学应答l组织学应答应用抗病毒药物后如何判断疗效？44应用抗病毒药物后如何判断疗效？l治疗结束时治疗结束时完全应答完全应答l随访随访1 1年年持续应答持续应答l无应答无应答45YMDD变异lYMDDYMDD：酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天：酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天 门冬氨酸门冬氨酸l蛋氨酸（蛋氨酸（M M）突
16、变为异亮氨（）突变为异亮氨（I I）或缬氨酸）或缬氨酸（V V）形成）形成YIDDYIDD变异株或变异株或YVDDYVDD变异株变异株 。抗病毒治疗中存在的问题46HBV-YMDD变异检测的临床意义l动态检测动态检测：服用拉米夫定：服用拉米夫定3个月开始，每月个月开始，每月 检测检测1次次l提前发现提前发现：可在耐药临床表现发生前：可在耐药临床表现发生前1-4个个 月检测出突变株月检测出突变株l及时调整及时调整：适时调整用药方案，防止因耐：适时调整用药方案，防止因耐 药而导致病情恶化药而导致病情恶化47丙型肝炎的病原检测48丙肝病毒lHCV是单链RNA病毒l主要通过血液和血制品传播l感染后易转
17、变为慢性肝炎或发展为肝硬化、肝癌l呈全球性分布，约1%普通人群感染49抗HCV IgM和抗HCV IgGlHCV抗体不是保护性抗体，是存在HCV感染的标志。l抗HCV IgM在发病后即可检测到，一般持续13个月。l如果抗HCV IgM持续阳性，提示病毒持续复制，易转为慢性。l低滴度抗HCV IgG提示病毒处于静止状态，高滴度提示病毒复制活跃。50HCV抗原检测的困难lHCVHCV在血液中含量极低，仅为在血液中含量极低，仅为HBVHBV的的1%1%lHCVHCV病毒颗粒很难有效地分离纯化、人工合成抗原病毒颗粒很难有效地分离纯化、人工合成抗原l丙型肝炎的窗口期很长，血清学检测无法早期诊断丙型肝炎的
18、窗口期很长，血清学检测无法早期诊断l抗体持续性存在，无法提示正确的病毒载量抗体持续性存在，无法提示正确的病毒载量lHCVHCV的型别复杂，高突变率的型别复杂，高突变率lHCVHCV核心抗原检测试剂盒敏感性差：核心抗原检测试剂盒敏感性差：45.68%45.68%51HCV RNA HCV RNA阳性是病毒感染和复制的直接标志。阳性是病毒感染和复制的直接标志。HCV RNA的定量测定有助于了解病毒复制程度、抗的定量测定有助于了解病毒复制程度、抗病毒治疗的选择及疗效评估等。病毒治疗的选择及疗效评估等。52HCV RNA荧光定量PCR检测的临床意义l早期诊断：在免疫学检测的“窗口期”或一部分不产生抗体
19、的丙肝病毒携带者，都可出现HCV RNA阳性，抗HCV阴性的检测结果。l弥补ELISA方法的高漏检率,HCV RNA可作为HCV感染诊断的指标。lHCV RNA定量可指导用药，为疗效观察及预后判断提供客观指标。抗HCV不能作为抗病毒疗效的指标。l慢性丙型肝炎长期抗HCV阳性，这只表示曾经感染了丙肝病毒并出现了相应的免疫应答，并不代表体内仍有丙肝病毒的存在或复制，这时只能通过HCV RNA定量检测鉴别丙肝病毒的活动性和复制程度。lHCV主要通过输血和血制品传播，对献血员及血制品进行检测，以减少医源性丙型肝炎的发生和传播。核酸检测在核酸检测在HCV感染的诊断中要比感染的诊断中要比HBV感染的诊断重
20、要得多！感染的诊断重要得多！53性病相关病原体的检测54 性病在我国已成为性病在我国已成为一个重要的公共卫生问一个重要的公共卫生问题，自题，自9999年以来，性病年以来，性病的发生率居高不下，其的发生率居高不下，其发病率在传染性疾病中发病率在传染性疾病中位居第位居第3 3位，位，0303年我国累年我国累计报道性病病例数（计报道性病病例数（HIV除外）除外）7373万。浙江省为万。浙江省为高发区，位居全国第三。高发区，位居全国第三。55常见性传播疾病病原体l淋病双球菌(NG)l沙眼衣原体(CT)l解脲支原体(UU)l人类乳头瘤病毒(HPV)l人类免疫缺陷病毒(HIV)56淋病双球菌的传统检测方法
21、l涂片染色：对于女性患者检出率低，易出现假阴性l分离培养：培养较困难，生化鉴定复杂，时间长lELISA抗原检测法：存在交叉反应，非特异反应较严重57荧光定量PCR检测NG的优势l可在短时间内快速、准确地直接从临床各种标本中检出含量极低的病原菌l对女性疑似淋球菌引起的各种炎症的诊断及鉴别诊断起决定性作用l对症状轻者或无症状的淋球菌感染者做到早期诊断和鉴别诊断l可用于疗效考核58沙眼衣原体59沙眼衣原体感染与致病l近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌l在我国，在非淋球菌性尿道炎中居首位在我国，在非淋球菌性尿道炎中居首位l泌尿生殖道感染，妨碍妊娠l盆腔感染，可致生殖能力损害60传
22、统方法检测沙眼衣原体的缺陷l“窗口期”检测不出l不能判定是现症感染还是既往感染61荧光定量PCR检测衣原体的优势l灵敏度98%以上、特异性100%l提高阳性检出率l适用于感染的早期诊断和无症状携带者的检查62解脲支原体63lUU难以分离，需特殊培养基培养，操作费时，需1-3天才能得到初步结果。l血清学检查，仅10%UU尿道炎患者在病程中特异性抗体滴度升高4倍，使其方法学应用受限。l一些非致病的脲原体或培养过程中的污染都可能导致假阳性的结果。传统方法检测解脲支原体的缺陷64l具有高度的敏感性和特异性，提高阳性检出率l快速、定量准确，可以为临床评价疗效提供依据荧光定量PCR检测支原体的优势65 C
23、T、UU是美国FDA批准的PCR检测试剂盒，作为首选方法，在临床推广应用66人类乳头瘤病毒l有100多个型l只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是HPV的惟一宿主l l免疫原性低，易形成持续性感染免疫原性低，易形成持续性感染l l新生儿产道感染新生儿产道感染67HPV宫颈癌宫颈癌6869l传统巴氏涂片漏诊率可达30%l从细胞学水平来观察细胞的形态学改变，其中80%的患者确诊时已是宫颈癌晚期传统方法检测HPV的缺陷70l早期感染的病原检测l可对HPV进行分型l可以评估病毒载量与患癌症风险l可以考核疗效与预后l用于HPV感染与生殖器肿瘤相关性的研究荧光定量PCR检测HPV的优势71人类免疫缺陷病毒是
24、引起艾滋病的病原体是引起艾滋病的病原体72l可判定无症状且血清阴性患者潜在的HIV传播性l检测长潜伏期的HIV携带者l使“窗口期”缩短10天l在治疗过程中观察患者血清HIV载量的变化预示病情的转归和指导临床用药l对于新生儿是否从母体感染HIV的诊断尤为适用荧光定量PCR检测HIV73小结l荧光定量PCR是特异、灵敏、高效的基因诊断技术l对致病微生物核酸含量进行定量检测l弥补免疫检测的缺陷（如HCV）l缩短诊断的窗口期（如HIV），利于早期诊断74l对治疗过程进行疗效监测l指导用药过程及剂量，以制定合理的疗效方案l定量PCR的临床应用可结合临床表现，并与传统的免疫学、影像学等诊断方法来综合评判，更为科学小结75 04年6月，卫生部临检中心主任申子瑜、中国医科大学附属一院副院长尚红等专家对迪安医学检验中心的PCRPCR基因诊断实验室基因诊断实验室进行验收，并顺利通过！76 谢谢 谢谢 大大 家家 ！ 7778
