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1、第六章酶的分子工程之一：概述酶分子工程概述第一节第一节 酶的分子工程酶的分子工程原因：原因：1 1 稳定性不够，不能适应大量生产稳定性不够，不能适应大量生产 的需要。的需要。2 2 作用的最适条件不符。作用的最适条件不符。3 3 酶的主要动力学性质的不适应。酶的主要动力学性质的不适应。4 4 临床应用的特殊要求。临床应用的特殊要求。5. 5. 。酶分子工程概述酶的分子工程酶的分子工程 molecular engineering of the enzyme molecular engineering of the enzyme 主要指化学或分子生物学方法对酶分子进行改造主要指化学或分子生物学方法
2、对酶分子进行改造 酶分子工程概述l洗衣粉洗衣粉: :枯草芽孢杆菌蛋白酶枯草芽孢杆菌蛋白酶加强去污能力，加强去污能力，在漂白剂的作用下易失去活性。在漂白剂的作用下易失去活性。Met-222Met-222被被氧化氧化将酶蛋白分子中的氨基酸将酶蛋白分子中的氨基酸(Met-222)(Met-222)进行替进行替代，使酶的代，使酶的抗氧化能力抗氧化能力大大提高，因而可大大提高，因而可与漂白剂同时使用。与漂白剂同时使用。酶分子工程概述酶分子工程概述l分两部分：分两部分：对对天然酶分子天然酶分子进行改造，包括进行改造，包括酶一级结构中氨基酸置换、肽酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等链切割、氨
3、基酸侧链修饰等分子生物学水平分子生物学水平，即用基因工，即用基因工程方法对程方法对DNADNA或或RNARNA进行分子改进行分子改造，以获得化学结构更为合理造，以获得化学结构更为合理的酶蛋白的酶蛋白酶分子工程概述1 1、化学酶工程、化学酶工程l又称为又称为初级酶工程初级酶工程(Primary enzyme (Primary enzyme engineering)engineering)，它主要由，它主要由酶学与化学工程酶学与化学工程技术技术相互结合而形成，通过化学修饰、固定化处理、相互结合而形成，通过化学修饰、固定化处理、甚至通过化学合成法等手段，改善酶的性质以甚至通过化学合成法等手段，改善酶
4、的性质以提高催化效率及降低成本。提高催化效率及降低成本。酶分子工程概述l它包括：它包括：自然酶自然酶化学修饰酶化学修饰酶固定化酶固定化酶化学人工酶化学人工酶等等的研究和应用等等的研究和应用。酶分子工程概述2.2.生物酶工程：生物酶工程：l是是酶学酶学和以和以DNADNA重组技术重组技术为主的现代分子生为主的现代分子生物学技术相结合一门新兴的生物工程，物学技术相结合一门新兴的生物工程，l亦称高级酶工程亦称高级酶工程( (Advanced Enzyme Engineering) )。酶分子工程概述生物酶工程：生物酶工程：克隆酶克隆酶突变酶突变酶新酶新酶酶分子工程概述基基因因工工程程基基本本过过程程
5、克隆酶克隆酶酶分子工程概述酶分子工程概述l2020世纪世纪9090年代，随着基因工程的广泛介入，一年代，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上表达因重组，可以在微生物上表达摆脱对天然摆脱对天然酶的依赖。酶的依赖。“基因工程基因工程发酵工艺发酵工艺先进的发酵设备先进的发酵设备” 酶工业的重大飞跃酶工业的重大飞跃酶分子工程概述最成功的例子：最成功的例子：l人纤维蛋白溶酶原激活剂人纤维蛋白溶酶原激活剂促进溶解血块中的纤维蛋白。临床上用于治疗血栓性疾病，促进促进溶解血块中的纤维蛋白。临床上用于治疗血栓性疾病，促进
6、体内血栓的溶解。体内血栓的溶解。利用工程菌株生产的纤维蛋白溶酶原激活剂在疗效上与人体合成利用工程菌株生产的纤维蛋白溶酶原激活剂在疗效上与人体合成的酶完全一效，目前已用于临床试验。的酶完全一效，目前已用于临床试验。 l凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶生产乳酪的必需用酶，其来源有限。生产乳酪的必需用酶，其来源有限。人们克隆了小牛凝乳酶基因在酵母系统中表达，得到的凝乳酶与人们克隆了小牛凝乳酶基因在酵母系统中表达，得到的凝乳酶与从小牛胃中提取的天然酶性质完全一致。从小牛胃中提取的天然酶性质完全一致。酶分子工程概述突变酶突变酶酶分子工程概述定向进化示意图定向进化示意图随机突变随机突变+ +定向选择目标突变体定向选择
7、目标突变体细菌细菌诱发突变的诱发突变的因素因素5050 0 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力（温度）（温度）温度耐受型突温度耐受型突变体变体最适生长温度为最适生长温度为37370 0C C最适生长温度提高了！最适生长温度提高了！酶分子工程概述超自然的优质酶超自然的优质酶新酶新酶This image shows a computer-generated model for the design of a new enzyme not found in nature. This particular protein design, called retro-aldolase 22,
8、 was tested and was able to enhance the rate of a carbon bond breaking chemical reaction 10,000 times over the rate of the uncatalyzed reaction. Being able to break carbon bonds more quickly and efficiently could lead to improvements in cleaning up organic waste and in developing renewable energy so
9、urces Images by Lin Jiang and Eric Althoff, University of Washington and Howard Hughes Medical Institute.the designed active site (grey meshing)酶分子工程概述第二节第二节 酶蛋白的稳定性和稳定化酶蛋白的稳定性和稳定化酶分子工程概述酶的稳定性酶的稳定性（enzyme stabilityenzyme stability）l是指酶分子抵抗各种不利因素影响，维持一定空间结是指酶分子抵抗各种不利因素影响，维持一定空间结构，保持生物活性相对稳定的能力。构，保持生物
10、活性相对稳定的能力。在细胞内，酶分子受到内膜系统保护，而且处于还原性环境，在细胞内，酶分子受到内膜系统保护，而且处于还原性环境，不易被氧化失活。不易被氧化失活。而酶工程所涉及的催化过程几乎都在体外，条件比细胞内环而酶工程所涉及的催化过程几乎都在体外，条件比细胞内环境恶劣得多，酶不稳定的缺点显得尤其突出。境恶劣得多，酶不稳定的缺点显得尤其突出。酶分子工程概述l稳定的空间结构稳定的空间结构是酶催化活性稳定的基础是酶催化活性稳定的基础l从分子水平上看从分子水平上看l一级结构：肽键和二硫键。一级结构：肽键和二硫键。l酶分子空间结构通常比一级结构更为脆酶分子空间结构通常比一级结构更为脆弱，非共价键包括疏
11、水键、氢键、离子弱，非共价键包括疏水键、氢键、离子键、范德华力、金属离子结合等。键、范德华力、金属离子结合等。 一、蛋白质稳定性的分子原因一、蛋白质稳定性的分子原因 酶分子工程概述蛋白质稳定性的分子原因：蛋白质稳定性的分子原因： A: A: 金属离子、底物、辅助因子和其他相对分子质量配体金属离子、底物、辅助因子和其他相对分子质量配体的结合作用的结合作用酶分子工程概述B:B:蛋白质蛋白质- -蛋白质和蛋白质蛋白质和蛋白质- -脂的作用脂的作用l当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表
12、面的疏水区域因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域 酶分子工程概述C:C:盐键和氢键盐键和氢键数目较少，但对蛋白质稳定性贡献很显著数目较少，但对蛋白质稳定性贡献很显著目前认为：氢键与蛋白质稳定性关系不大目前认为：氢键与蛋白质稳定性关系不大3-磷酸磷酸-甘油醛脱氢酶：甘油醛脱氢酶：来源：嗜热脂肪芽孢杆菌来源：嗜热脂肪芽孢杆菌 兔肌兔肌结构很类似，但嗜热的酶亚基间区域有盐结构很类似，但嗜热的酶亚基间区域有盐桥协作系统，而嗜温的酶没有。桥协作系统，而嗜温的酶没有。因此嗜热酶的催化活力的变性温度和最适因此嗜热酶的催化活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约温度都比嗜温酶高出约20。酶分
13、子工程概述D D：二硫键：二硫键Disulfide bond大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高其在溶液中的稳定性大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高其在溶液中的稳定性 在酶分子中引入在酶分子中引入-SH，或者，用双功能试剂实现分子内交联，或者，用双功能试剂实现分子内交联，也能使蛋白质构象稳定化也能使蛋白质构象稳定化酶分子工程概述引入二硫键引入二硫键l研究发现，在酶蛋白中引入半胱氨酸，从而增加酶蛋研究发现，在酶蛋白中引入半胱氨酸，从而增加酶蛋白中二硫键的数量可以增加某些酶的稳定性，但不影白中二硫键的数量可以增加某些酶的稳定性，但不影响酶的活性。响酶的活性。TumnenTumnen等报道
14、将等报道将Trichoderma reeseiTrichoderma reesei的木聚糖酶的木聚糖酶IIII的一个的一个-螺旋中的螺旋中的Ser-110Ser-110和和Asp-154Asp-154分别突变为分别突变为CysCys，从而在，从而在110110位和位和154154位建立一个二硫键，位建立一个二硫键， 65 65时的半衰期从不到时的半衰期从不到1min1min增加到增加到14min14min。WakarchukWakarchuk等在木聚糖酶分子中引入不影响其活性的二硫键，等在木聚糖酶分子中引入不影响其活性的二硫键，使其耐热性提高了使其耐热性提高了1515。 酶分子工程概述E E：
15、疏水相互作用：疏水相互作用l对蛋白质的稳定性非常重要对蛋白质的稳定性非常重要l增加疏水作用数目是稳定蛋白质的实用方法。增加疏水作用数目是稳定蛋白质的实用方法。降低蛋白质表面的疏水性质；降低蛋白质表面的疏水性质；增加蛋白质内部的疏水性。增加蛋白质内部的疏水性。l从实验上看，可用从实验上看，可用定点突变或化学修饰定点突变或化学修饰来实现来实现这个目的。这个目的。 酶分子工程概述F F：对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低：对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低l结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸）的结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸）的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。氧化作用是蛋白质失活的最
16、常见的机理之一。l半胱氨酸的半胱氨酸的巯基巯基和色氨酸的和色氨酸的吲哚环吲哚环，对氧化特别敏，对氧化特别敏感感l因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度稳定的嗜因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显著偏低热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显著偏低酶分子工程概述lMAPK MAPK 磷酸酶（磷酸酶（MPKsMPKs）削弱应激激活的）削弱应激激活的MAPK MAPK 信号传递。信号传递。MPKMPK含有一个半胱氨酸巯基（含有一个半胱氨酸巯基（sulfhydryl groupsulfhydryl group），决定），决定其催化活性。如果该基团在活性氧簇（其催化活性
17、。如果该基团在活性氧簇（reactive oxygen reactive oxygen speciesspecies，ROSROS）下发生氧化，）下发生氧化，MPKMPK活性不可逆地消失活性不可逆地消失 酶分子工程概述G G：氨基酸残基的坚实装配：氨基酸残基的坚实装配l蛋白质结构中仍有空隙蛋白质结构中仍有空隙, ,通常通常为水分子所充满。分子量为为水分子所充满。分子量为2323万的蛋白质中约有个万的蛋白质中约有个515515水分子水分子 ，会导致蛋白质，会导致蛋白质不稳定。不稳定。因此，蛋白质的坚实化可作为一种人为稳定蛋白质的方法因此，蛋白质的坚实化可作为一种人为稳定蛋白质的方法酶分子工程概述
18、蛋白质稳定性因素蛋白质稳定性因素l金属离子、底物、辅因子和其它低分子质量配体的结合金属离子、底物、辅因子和其它低分子质量配体的结合使蛋白质构象稳定；使蛋白质构象稳定；l蛋白质与其它的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用；蛋白质与其它的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用；l盐键盐键；疏水相互作用；氢键；二硫键；疏水相互作用；氢键；二硫键；l对氧化修饰敏感的氨基酸含量降低；对氧化修饰敏感的氨基酸含量降低；l氨基酸残基的坚实装配。氨基酸残基的坚实装配。酶分子工程概述二、蛋白质不可逆失活的原理和机理二、蛋白质不可逆失活的原理和机理酶分子工程概述酶在使用和贮存过程中的失活酶在使用和贮存过程中的失活常是由于微生
19、物和外源蛋白水解常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的结果。酶作用的结果。蛋白水解酶可催化肽键水解。蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋白水当蛋白质底物也是一种蛋白水解酶时，就会发生自我降解现象，解酶时，就会发生自我降解现象，叫作叫作自溶自溶 1.1.蛋白水解酶和自溶作用蛋白水解酶和自溶作用酶分子工程概述2.2.聚合作用聚合作用l聚合很久以来就被认为是蛋白质失活的一种机理。聚合很久以来就被认为是蛋白质失活的一种机理。l首先，单分子（首先，单分子（N N）构象变化，导致蛋白质可逆变性）构象变化，导致蛋白质可逆变性(U)(U)。使包埋。使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。的疏水性氨基酸
20、残基暴露于水溶剂。l其次，这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合（其次，这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合（A A），以最），以最大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。l最后，如果蛋白质当中含最后，如果蛋白质当中含cyscys，形成二硫键（，形成二硫键（AsAs）l当然，聚合作用不一定是不可逆的当然，聚合作用不一定是不可逆的：用变性剂破坏非共价力（氢键或疏水键）用变性剂破坏非共价力（氢键或疏水键）还原或氧化再生二硫键，可使蛋白质活化。还原或氧化再生二硫键，可使蛋白质活化。NUAAs酶分子工程概述3.3.极端极端pHpHl极端极端pHpH能启动能启动
21、改变、交联或破坏氨基酸残基改变、交联或破坏氨基酸残基的化学的化学反应，结果引起不可逆失活。反应，结果引起不可逆失活。远离蛋白质的等电点，蛋白质分子内相同电荷间的静电斥远离蛋白质的等电点，蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展。但这些构象变化常能导致不可逆聚力会导致蛋白质伸展。但这些构象变化常能导致不可逆聚合；对蛋白酶来说，常导致自溶合；对蛋白酶来说，常导致自溶酶分子工程概述l肽键水解肽键水解也容易在强酸条件下或中等也容易在强酸条件下或中等pHpH和高温和高温相结合的条件下发生。相结合的条件下发生。6 mol/L HCl6 mol/L HCl，24h, 11024h, 110：l蛋白质
22、可完全水解成氨基酸。蛋白质可完全水解成氨基酸。在在AspAsp所处的肽键在不太酸的环境下短时间也易水解（尤其是所处的肽键在不太酸的环境下短时间也易水解（尤其是Asp-ProAsp-Pro）。）。AsnAsn和和GlnGln的脱胺作用，会导致蛋白质的疏水性内部引进入负的脱胺作用，会导致蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，使得酶失活电荷，使得酶失活酶分子工程概述4.4.氧化作用氧化作用l各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。l分子氧，分子氧，H H2 2O O2 2和氧自由基和氧自由基是常见的蛋白质氧
23、化是常见的蛋白质氧化剂。剂。酶分子工程概述5.5.表面活性剂和去污剂表面活性剂和去污剂l去污剂有离子性和非离子去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏性两大类，都含有长链疏水尾巴，但水尾巴，但“头头”部基团部基团不同，有带电的，有不带不同，有带电的，有不带电的。去污剂的亲水部分电的。去污剂的亲水部分和疏水部分之间的相对平和疏水部分之间的相对平衡是决定其行为的重要因衡是决定其行为的重要因素素酶分子工程概述l对于几乎所有的蛋白对于几乎所有的蛋白质来说，每克蛋白质质来说，每克蛋白质结合结合SDSSDS的最大量类似，的最大量类似，大约大约1.4g/g1.4g/g。SDS-SDS-多多肽复合物本质上
24、是胶肽复合物本质上是胶团，团，SDSSDS分子聚集在蛋分子聚集在蛋白质暴露的疏水区域白质暴露的疏水区域周围。周围。酶分子工程概述6.6.变性剂变性剂l脲和盐酸胍脲和盐酸胍l高浓度盐高浓度盐l螯合螯合l有机溶剂有机溶剂酶分子工程概述高浓度盐高浓度盐 高浓度盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作高浓度盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作用，这要看盐的性质和浓度，用，这要看盐的性质和浓度，(CH(CH3 3) )4 4N N+ + NH NH4 4+ + K K+ +,Na,Na+ + Mg Mg2+2+ Ca Ca2+2+ Ba Ba2+2+ SO SO4 42-2- CICI- - Br Br
25、- - NO NO3 3- - CIO CIO4 4- - SCN SCN- -l越靠近序列越靠近序列左侧左侧的离子对蛋白质的的离子对蛋白质的稳定作用越强稳定作用越强，愈靠近该序列愈靠近该序列右边右边的离子越使蛋白质的离子越使蛋白质不稳定不稳定。l例如，例如，(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4是酶稳定剂，贮存酶时常用它。是酶稳定剂，贮存酶时常用它。 NaSCN NaSCN（硫氰酸钠）硫氰酸钠）是酶的紊乱剂是酶的紊乱剂酶分子工程概述螯合螯合l结合金属离子的试剂结合金属离子的试剂, ,如如EDTAEDTA能使金属酶失活能使金属酶失活l这类失活常常是不可逆的，这类失活常常是不可逆的，l相反
26、，螯合剂通常可以稳定不需要金属离子相反，螯合剂通常可以稳定不需要金属离子的蛋白质的蛋白质酶分子工程概述7.7.重金属离子和巯基试剂重金属离子和巯基试剂l已知重金属阳离子，如已知重金属阳离子，如HgHg2+2+，CdCd2+2+，PbPb2+2+能与蛋白质的能与蛋白质的巯基反应（将其转化为硫醇盐），也能与组氨酸和色巯基反应（将其转化为硫醇盐），也能与组氨酸和色氨酸残基反应。此外，银或汞能催化水解二硫键氨酸残基反应。此外，银或汞能催化水解二硫键l巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但这个作用巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但这个作用常是可逆的。常是可逆的。酶分子工程概述8.8.热热l热失活是最
27、经常遇到的蛋白质失活热失活是最经常遇到的蛋白质失活l工业上的酶法加工大多要求在较高温度下进行，因为工业上的酶法加工大多要求在较高温度下进行，因为这可以增加溶解度和反应速度以及降低溶液粘度、防这可以增加溶解度和反应速度以及降低溶液粘度、防止微生物污染。所以热失活是工业上最经常遇到的酶止微生物污染。所以热失活是工业上最经常遇到的酶失活的原因。失活的原因。 酶分子工程概述9.9.机械力机械力l压力、压力、l剪切力、剪切力、l振动振动l超声超声酶分子工程概述10.10.冷冻和脱水冷冻和脱水l低温减弱疏水作用，引起蛋白质的解离和变性低温减弱疏水作用，引起蛋白质的解离和变性l溶质（酶和盐）随着水分子的结晶
28、而被浓缩，引起酶微溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的环境中的pHpH和离子强度的剧烈改变。和离子强度的剧烈改变。磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液的pHpH在冷冻后可由在冷冻后可由7 7变到变到3.53.5，离子强度提高，引起寡聚蛋白质的解离。离子强度提高，引起寡聚蛋白质的解离。酶分子工程概述l二硫交换或巯基氧化。二硫交换或巯基氧化。酶浓度增加引起酶浓度增加引起CysCys浓度也增加。分子内和分子间浓度也增加。分子内和分子间的二硫交换反应就很容易发生，的二硫交换反应就很容易发生，巯基在低温下更易氧化，因为在巯基在低温下更易氧化，因为在-3-3部分冻结系统部分冻结系统内的氧浓度要比
29、内的氧浓度要比00溶液中的高溶液中的高11501150倍。倍。这种浓缩效应还能增加氧自由基的浓度。这种浓缩效应还能增加氧自由基的浓度。酶分子工程概述11.11.辐射作用辐射作用电离辐射：如电离辐射：如射线，射线，X X射线，电子，射线，电子，粒子等粒子等直接作用由于形成自由基而引起一级结构的共价改直接作用由于形成自由基而引起一级结构的共价改变，继而交联或氨基酸破坏。这导致天然构象丧失或变，继而交联或氨基酸破坏。这导致天然构象丧失或聚合。聚合。间接作用是由于在水溶液中形成反应性产物，其中间接作用是由于在水溶液中形成反应性产物，其中主要是主要是OH自由基，溶解的电子和自由基，溶解的电子和H2O2等
30、。等。酶分子工程概述失活机理失活机理变性条件变性条件聚合（有时伴随形成分子间二硫键）聚合（有时伴随形成分子间二硫键）加热，变性剂脲，盐酸胍加热，变性剂脲，盐酸胍, SDS, SDS,振动振动一级结构改变一级结构改变1 1、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解和自溶作用、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解和自溶作用极端极端pHpH值，加热，蛋白水解酶值，加热，蛋白水解酶2 2、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环）、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环）氧气、氧气代谢产物，辐射氧气、氧气代谢产物，辐射3 3、二硫键还原，分子间二硫交换、二硫键还原，分子间二硫交换加热，高加热，高pHpH，巯基化合物，巯
31、基化合物, ,二硫化物二硫化物4 4、必需巯基的化学修饰、必需巯基的化学修饰金属离子，二硫化物金属离子，二硫化物5 5、蛋白质磷酸化、蛋白质磷酸化蛋白激酶蛋白激酶6 6、在催化过程中由于反应中间物（主要是自由基）引、在催化过程中由于反应中间物（主要是自由基）引起的起的“自杀自杀”失活失活底物底物7 7、氨基酸的外消旋化、氨基酸的外消旋化加热，极端加热，极端pHpH8 8、二硫键剪切后形成新氨基酸、二硫键剪切后形成新氨基酸加热，高加热，高pHpH9 9、天冬酰胺脱胺、天冬酰胺脱胺加热，高加热，高PHPH辅酶分子从活性部位上解离辅酶分子从活性部位上解离螯合剂、透析、加热，金属离子螯合剂、透析、加热
32、，金属离子寡聚蛋白解离成亚基寡聚蛋白解离成亚基化学修饰，极端化学修饰，极端pH, pH, 脲，表面活性剂，脲，表面活性剂，高温或低温高温或低温吸附到容器表面吸附到容器表面蛋白质浓度低蛋白质浓度低, , 加热加热“不可逆不可逆”构象改变构象改变加热，极端加热，极端pH, pH, 有机溶剂有机溶剂, ,盐酸胍盐酸胍流体中的剪切失活流体中的剪切失活流体形变流体形变酶分子工程概述三、蛋白质的稳定化三、蛋白质的稳定化l酶分子的可逆伸展（不可逆失活的初始阶段）酶分子的可逆伸展（不可逆失活的初始阶段） 黑体部分是酶的活性中心黑体部分是酶的活性中心 酶分子工程概述l酶的不可逆失活示意图酶的不可逆失活示意图 酶
33、分子工程概述l解决问题要从两方面着手：解决问题要从两方面着手：l一是如何防止酶的可逆伸展，一是如何防止酶的可逆伸展，l二是一旦酶发生可逆伸展，那么如何防止其不二是一旦酶发生可逆伸展，那么如何防止其不可逆失活反应发生。可逆失活反应发生。酶分子工程概述稳定天然酶的方法稳定天然酶的方法方 法说 明固定化固定化1、酶多点连接于载体上酶构象坚固化；立体障碍防止蛋白水解酶的降解作用2、分配效应和扩散限制载体的化学和物理性质影响酶分子周围的微环境非共价修饰非共价修饰1、添加剂专一性添加剂使N U平衡向N移动；竞争性添加剂除掉破坏性催化剂；有的中性盐和多羟基化合物的保护作用2、反相胶团反相胶团中酶抵抗有机溶剂
34、变性3、蛋白质间相互作用酶的抗体保护酶化学修饰化学修饰1、共价交联使酶构象坚固化2、改变离子状态或引入立体障碍的试剂修饰增加、中和或改变酶分子上的带电残基；可溶性大分子的连结抑制与其它溶质（蛋白酶）的相互作用蛋白质工程蛋白质工程定点突变取代不稳定的氨基酸残基，引入稳定酶的因素酶分子工程概述1.1.固定化：固定化：（A）交联）交联（B）共价连接或吸附）共价连接或吸附（C）包埋）包埋可以使酶构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向可以使酶构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡伸展态过渡,并可抑制酶的自降解并可抑制酶的自降解 酶分子工程概述2 2、非共价修饰、非共价修饰1)反相胶团（束）反相
35、胶团（束）酶分子工程概述 所谓反胶团所谓反胶团, ,是指当是指当油相油相中表面活性中表面活性剂的浓度剂的浓度超过临界胶束浓度后超过临界胶束浓度后, ,其分其分子在非极性溶剂中自发形子在非极性溶剂中自发形成成的亲水基向内、疏水基的亲水基向内、疏水基向向外的具有极性内核的多外的具有极性内核的多分子聚集体分子聚集体酶分子工程概述蔗糖酶蔗糖酶包埋在由包埋在由SDSSDS和苯等组成的反相胶团中的的活力比和苯等组成的反相胶团中的的活力比其在水介质中的活力高其在水介质中的活力高4 4倍多，而且维持活力的时倍多，而且维持活力的时间由间由48 h48 h延长至延长至7 7天。天。l视溶剂和表面活性剂的组成，视溶
36、剂和表面活性剂的组成，可在与水不混溶的溶剂中得可在与水不混溶的溶剂中得到微乳化的反相胶团。到微乳化的反相胶团。反相反相胶团不仅可以保护酶，还能胶团不仅可以保护酶，还能提高酶活力，改变酶的专一提高酶活力，改变酶的专一性。性。酶分子工程概述l事实上，在保证酶有效作用事实上，在保证酶有效作用所必需的水量所必需的水量的前提下，的前提下，酶在有机溶剂中的酶在有机溶剂中的稳定性稳定性比在水中更好。比在水中更好。例如，在干燥的三丁酸甘油酯中的脂肪酶相当稳定，例如，在干燥的三丁酸甘油酯中的脂肪酶相当稳定，100100时时的半寿期大于的半寿期大于12 h,12 h,而水含量大于而水含量大于1%1%时，酶立即失活
37、。这主要时，酶立即失活。这主要是由于酶在无水有机溶剂中的构象高度坚实化，有机溶剂是由于酶在无水有机溶剂中的构象高度坚实化，有机溶剂“冻结冻结”了酶的活化构象。另外一个原因是缺乏游离水，而实了酶的活化构象。另外一个原因是缺乏游离水，而实验证明，酶的任何一个失活过程都需要水的参与。验证明，酶的任何一个失活过程都需要水的参与。酶分子工程概述2)2)添加剂：添加剂：可增加溶液酶或冻干过程中酶的稳定性可增加溶液酶或冻干过程中酶的稳定性 l添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还可提高酶抗蛋白添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还可提高酶抗蛋白水解、抗化学试剂、抗水解、抗化学试剂、抗pHpH变化、抗变性剂、抗稀释作
38、用变化、抗变性剂、抗稀释作用等的稳定性。等的稳定性。 专一性的底物和配体；专一性的底物和配体；非专一性的中性盐和多羟基化合物（如甘油、糖和聚乙二醇）；非专一性的中性盐和多羟基化合物（如甘油、糖和聚乙二醇）；与酶失活剂竞争的物质或除掉破坏化学反应催化剂的物质，如加与酶失活剂竞争的物质或除掉破坏化学反应催化剂的物质，如加入的蛋白质，螯合剂和还原剂。入的蛋白质，螯合剂和还原剂。酶分子工程概述3).3).蛋白质间非共价相连蛋白质间非共价相连l蛋白质间相互作用时，由于从蛋白质表面相互蛋白质间相互作用时，由于从蛋白质表面相互作用区域排除水，因而降低自由能，增加蛋白作用区域排除水，因而降低自由能，增加蛋白质
39、的稳定性。质的稳定性。有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性是由于保护性有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性是由于保护性大分子（如肽和聚胺）发挥作用的结果。大分子（如肽和聚胺）发挥作用的结果。l酶的多聚体或酶的聚合体的活力和稳定性也常酶的多聚体或酶的聚合体的活力和稳定性也常比其单体高比其单体高 酶分子工程概述用抗体来稳定酶用抗体来稳定酶l有些抗体可以在蛋白质开始伸展的部位或发生蛋白质有些抗体可以在蛋白质开始伸展的部位或发生蛋白质水解的部位起作用，因此可以稳定蛋白质。水解的部位起作用，因此可以稳定蛋白质。l例如，例如，-淀粉酶与其抗体的复合物在淀粉酶与其抗体的复合物在7070时的半寿期时的半寿期为为16
40、h16 h，而天然酶的半寿期仅为，而天然酶的半寿期仅为5 min5 min。l抗体保护的酶还有抗氧化、抗有机溶剂、抗低极端抗体保护的酶还有抗氧化、抗有机溶剂、抗低极端pHpH、抗自溶、抗蛋白水解作用。由于任何一种酶都有它对抗自溶、抗蛋白水解作用。由于任何一种酶都有它对应的抗体，制备酶的抗体亦较简单迅速，所以这种稳应的抗体，制备酶的抗体亦较简单迅速，所以这种稳定酶的方法具有普遍性。定酶的方法具有普遍性。酶分子工程概述3.3.化学修饰化学修饰l可溶性大分子修饰酶可溶性大分子修饰酶 l可溶性小分子修饰酶可溶性小分子修饰酶l交联酶晶体交联酶晶体 得到可溶性的稳定化酶得到可溶性的稳定化酶交联酶晶体是近年
41、开发的有效的酶稳定化方法交联酶晶体是近年开发的有效的酶稳定化方法酶分子工程概述4.4.蛋白质工程蛋白质工程l此法提供了有目的改变此法提供了有目的改变酶性能的可能性：不仅酶性能的可能性：不仅可以改变酶结构（与母可以改变酶结构（与母体分子只有体分子只有1 1个或几个氨个或几个氨基酸残基的差别），也基酸残基的差别），也可改变其催化活力及专可改变其催化活力及专一性和稳定性。一性和稳定性。用基因操纵技术高度专一性地改变目标蛋白质用基因操纵技术高度专一性地改变目标蛋白质酶分子工程概述The Nobel Prize in Chemistry 1993The Nobel Prize in Chemistry
42、1993Site-directed mutagenesis reprograms DNA酶分子工程概述附：选择稳定酶方法的标准：附：选择稳定酶方法的标准：la a 稳定性至少要增加稳定性至少要增加1-31-3个数量级；个数量级；lb b 应对各种酶失活因素都有保护作用；应对各种酶失活因素都有保护作用；lc c 稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性；稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性；ld d 稳定化方法应适合各类蛋白质；稳定化方法应适合各类蛋白质；le e 稳定化方法应在体内，体外都适用；稳定化方法应在体内，体外都适用；lf f 从经济角度看，方法应具有放大的潜力从经济角度看，方法应具有放大的潜力 酶分子工程概述酶分子工程概述
